吳曉青，劉永靜，孫燕麗

1. 福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院（福州 350007）；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)（福州 350122）

橄欖（Canarium albumRaeusch）為橄欖科橄欖屬喬木植物的果實，呈青色、卵圓形，所以也稱為青果，藥食同源[1]。我國橄欖種植資源極為豐富，福建、廣東、廣西、云南、海南、臺灣和浙江等均有橄欖分布和栽培[2]。橄欖的功效成分種類和含量豐富，其中多酚類物質(zhì)是橄欖最重要且含量最高的功效成分，也是影響橄欖鮮食品質(zhì)的核心指標(biāo)之一[3]。橄欖多酚具有抗菌、抗病毒、解熱、抗腫瘤、降血壓、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用[4-6]。目前，橄欖多酚主要用甲醇、丙酮、乙醇等有機溶劑提取，安全性較差，且會污染環(huán)境[7]。低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）是由兩組或三組低共熔混合物分別作為氫鍵供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）和氫鍵受體（Hydrogen Bond Acceptor，HBA），按照一定化學(xué)計量的摩爾比通過氫鍵之間的相互作用組合而成的，常用的氫鍵受體多為季銨鹽，如氯化膽堿或甜菜堿等，而氫鍵供體多為醇類、酰胺、糖類及羧酸等[8]。DES是繼離子液體之后的又一新型的綠色溶劑，具有無毒、易生物降解、原料成本低、合成簡單等優(yōu)點，因這一系列獨特的性質(zhì)使得其在萃取天然產(chǎn)物領(lǐng)域的潛力逐漸為人們所重視[9-11]。目前，DES在提取天然植物生物活性成分如黃酮[12-13]、多酚[14-16]、生物堿[17]、皂苷[18]、多糖[19]等方面已有一定的應(yīng)用。

超聲輔助提取法是應(yīng)用超聲波強化提取植物的有效成分，操作簡單，可以采用不同溶劑以滿足不同目標(biāo)物提取的需要，尤其可以在低溫下操作，非常適宜熱敏性物質(zhì)的提取。故此研究以橄欖為原料，探究超聲輔助低共熔溶劑法提取橄欖多酚，以橄欖中的多酚得率為評價指標(biāo)，在低共熔溶劑的種類、摩爾比、含水量、液料比、超聲時間和超聲溫度等單因素考察基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化超聲輔助低共溶劑提取工藝，并以抗壞血酸為陽性對照，通過1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除試驗，評價橄欖多酚的抗氧化活性，為橄欖多酚的深入研發(fā)提供一種可供借鑒的提取新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖（福建閩清）；純度≥98%沒食子酸（上海源葉生物科技有限公司）；氯化膽堿、丙二醇、丙三醇、乙酰胺、乙醇、福林酚、無水碳酸鈉、L(+)-抗壞血酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙二醇、丁二醇、丙二酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；乳酸、脲（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；DPPH（分析純，索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800PC-DS2紫外可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；101A-2電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海東星建材試驗設(shè)備有限公司）；KQ-600GKDV高功率恒溫數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHA-B恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；DS-1高速組織搗碎機（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 DES的制備

將溶劑氫供體與氫受體按表1所示摩爾比進行混合，于80 ℃恒溫水浴中，磁力攪拌直至形成均一的溶液后，用去離子水稀釋，得到含水量為30%的DES，冷卻至室溫，備用。

表1 DES配制表

1.3.2 橄欖多酚的提取方法

取橄欖鮮果，洗凈，去核，在60 ℃熱風(fēng)干燥至恒重，粉碎過0.425 mm篩備用。精密稱取1 g處理后的橄欖粉末，加入低共熔溶劑，在一定溫度下，超聲處理（功率600 W）一定時間后，以5 000 r/min離心10min取得上清液，即得橄欖多酚提取液。

1.3.3 多酚得率的測定

采用課題組前期優(yōu)化的福林酚（Folin-ciocalteu，F(xiàn)C）比色法測定橄欖多酚含量[20]。精確稱取0.1 g沒食子酸，加蒸餾水稀釋至25 μg/mL，得到?jīng)]食子酸對照品溶液。精密量取1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL沒食子酸對照品溶液，用蒸餾水稀釋適量后的橄欖多酚提取液1.0 mL置刻度離心管中，加3.0 mL FC試劑、4.0 mL 10% Na2CO3溶液，加水稀釋至25.0 mL，搖勻，在40℃恒溫水浴中反應(yīng)45 min后，在765 nm波長條件下測定吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程Y=0.134X+0.010 2，r=0.999 7，沒食子酸在1.008 0～5.040 0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算橄欖多酚質(zhì)量濃度，并按式（1）計算橄欖多酚得率。

式中：C為回歸方程計算出的質(zhì)量濃度，μg/mL；m為樣品質(zhì)量，g；V為測定時反應(yīng)體系總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

采用1.3.2小節(jié)方法提取橄欖多酚，以不同比例的DES-1為提取溶劑，考察不同的提取條件下橄欖多酚得率。單因素試驗設(shè)計如表2所示。

表2 單因素試驗表

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定氯化膽堿/乙二醇摩爾比1∶4，選取重要影響因素含水量、液料比、超聲時間和超聲溫度4個因素為變量，運用響應(yīng)面分析軟件的 Box-Behnken模型，以橄欖多酚得率為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗分析，確定多酚提取最佳提取工藝條件。響應(yīng)面因素編碼及各自變量水平見表3。

表3 響應(yīng)面因素水平設(shè)計

1.3.6 DPPH清除能力的測定

分別取適量1.3.2小節(jié)方法所得兩種橄欖多酚提取液以及抗壞血酸，用無水乙醇稀釋成系列濃度的待測液。在比色管中分別加入2.0 mL待測液與2.0 mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，混合均勻，暗處放置30 min后，在517 nm波長處測定其吸光度A1。同時，將2.0 mL不同濃度的待測液與2.0 mL無水乙醇充分混合反應(yīng)后測定其吸光度A2，將2.0 mL DPPH乙醇溶液和2.0 mL無水乙醇充分混合反應(yīng)后測定其吸光度A0。根據(jù)式（2）計算待測液的DPPH清除率。采用SPSS軟件擬合，求出IC50值。

式中：A1為加入待測溶液后的吸光度；A2為待測溶液的本底吸光度；A0為空白對照溶液的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2021軟件進行作圖，通過Design Expert 10.0.3軟件進行響應(yīng)面試驗處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DES類型的選擇

以液料比20∶1 mL/g、超聲功率600 W、超聲溫度40 ℃、超聲波輔助提取30 min作為橄欖多酚提取條件，8種不同低共熔溶劑及乙醇溶劑對多酚得率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，8種DES溶劑中，DES-1對多酚的提取效果最佳?？赡苁怯捎贒ES-1與橄欖多酚極性相似利于溶出，而且具有較低的黏性和表面張力，對細(xì)胞具有更好的滲透性，故選擇氯化膽堿-乙二醇（DES-1）作為低共熔提取溶劑。

圖1 DES類型的選擇（n=3）

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 摩爾比對橄欖多酚得率的影響

HBA與HBD之間合適的比值對多酚得率具有很大的影響[29]。由圖2可見，氯化膽堿/乙二醇體系的摩爾比從1∶1到1∶4的過程，DES的黏度和表面張力隨著降低，橄欖多酚得率逐漸增加，當(dāng)物質(zhì)的量比為1∶4時，多酚得率達5.63%，但隨著摩爾比的繼續(xù)變化至1∶5，鹽濃度降低，多酚得率反而出現(xiàn)降低趨勢。故選擇摩爾比1∶4為最佳配比。

圖2 摩爾比對多酚得率的影響（n=3）

2.2.2 含水量對橄欖多酚提取率的影響

DES的黏度通常高于常規(guī)溶劑的黏度。黏度過高，會導(dǎo)致能量傳遞緩慢，阻礙多酚從細(xì)胞傳質(zhì)到溶劑介質(zhì)中的效率，添加一定比例的水可以有效改善黏度。因此試驗通過混合不同比例水的DES作為提取溶劑，考察含水量對橄欖多酚提取效果的影響。如圖3所示，當(dāng)DES中的含水量從0增加30%時，橄欖多酚得率隨含水量的增加而增加，且在含水量為30%時達到最大。而當(dāng)含水量從30%增加40%時，橄欖多酚得率開始下降，這可能是橄欖多酚和DES之間的氫鍵相互作用降低。故DES的含水量確定為30%。

圖3 含水量對多酚得率的影響（n=3）

2.2.3 液料比對橄欖多酚提取率的影響

原料和溶劑接觸面積與液料比有關(guān)，這會影響橄欖多酚的提取效果。由圖4可知，在液料比為40∶1mL/g之前，提取率隨液料比的增大而增大，在40∶1 mL/g時達到最大，但在40∶1 mL/g后得率開始下降。在提取過程中，液料比的提高必然會在較大程度上提高傳質(zhì)推動力，有利于多酚得率的增加[30]。然而，當(dāng)液料比增加到一定程度后，接觸面積達到飽和，再單純加大溶劑比例對多酚的提取作用不明顯，反而使得已吸附的多酚脫附重新回到待提取物中，導(dǎo)致得率出現(xiàn)下降。故液料比選用40∶1 mL/g。

圖4 液料比對多酚得率的影響（n=3）

2.2.4 超聲時間對橄欖多酚提取率的影響

在一定時間范圍內(nèi)，延長提取時間可以增加多酚的溶出量，但當(dāng)繼續(xù)延長時，多酚已基本溶出或溶劑對物料的作用達到某種平衡，并且時間過長會破壞多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響多酚的提取效果。如圖5所示，隨著提取時間的延長，多酚的提取率先上升后下降，多酚提取率30 min時達到最大。隨著提取時間的繼續(xù)延長，多酚的得率反而下降。故最佳提取時間選用30 min。

圖5 超聲時間對多酚得率的影響（n=3）

2.2.5 超聲溫度對橄欖多酚提取率的影響

不同超聲溫度對橄欖多酚提取率的影響如圖6所示。研究表明，升高溫度降低DES的黏度、增加擴散系數(shù)等有利于成分溶出[31]。而且升高溫度會加快分子運動，使有效成分加速擴散，但過高溫度會加速酚類物質(zhì)的氧化，不利于提取。當(dāng)超聲溫度為40 ℃時，橄欖多酚提取率最高，但溫度高于40 ℃提取率呈下降狀態(tài)。故選擇提取溫度為40 ℃。

圖6 超聲溫度對多酚得率的影響（n=3）

2.3 響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果

2.3.1 統(tǒng)計分析和模型擬合

單因素試驗結(jié)果表明，含水量、液料比、超聲時間和超聲溫度對多酚得率有顯著影響，故設(shè)定為自變量A、B、C、D，橄欖多酚得率為響應(yīng)值（Y），采用Design-Expert 10.0.3軟件設(shè)計29組試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。通過數(shù)據(jù)分析得到回歸擬合方程：

Y=7.47+0.15A+0.21B+0.13C-0.12D-0.25AB+0.08AC-0.04AD-0.077BC-0.21BD-0.55CD-1.49A2-1.1B2-1.05C2-0.7D2

從表5可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.105 5＞0.05），說明模型擬合程度好，同時模型回歸系數(shù)R2=0.984 8，調(diào)節(jié)后的R2=0.969 6，表明96.96%的數(shù)據(jù)可用該模型解釋，說明回歸方程可靠性較高。通過分析方差數(shù)據(jù)可以看出，一次項含水量、液料比對多酚得率具有極顯著影響（P＜0.01），超聲溫度、超聲時間對多酚得率具有顯著影響（P＜0.05），各因素的主效應(yīng)關(guān)系為B＞A＞C＞D，即液料比＞含水量＞超聲時間＞超聲溫度。其二次項交互作用AB、CD對多酚得率具有極顯著的影響（P＜0.01），BD對多酚得率具有顯著的影響（P＜0.05）。

表5 響應(yīng)面實驗方差分析

2.3.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線圖，可以直觀分析各因素對多酚提取率的影響規(guī)律和各因素間的交互作用強弱。響應(yīng)面的曲面陡峭程度與各因素對多酚得率影響顯著性呈正相關(guān)。A、B、C和D對橄欖多酚得率的影響如圖7所示，四個因素之間的交互曲面均具有較大的傾斜度，說明兩兩因素之間對橄欖多酚得率的影響較大。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.3.3 工藝驗證與方法比較

根據(jù)擬合方程與模型優(yōu)化提取因素，得到最佳提取條件：含水量30.454%，液料比42.035∶1 mL/g，超聲時間25.482 min，超聲溫度38.616 ℃。為適于實際操作，調(diào)整提取工藝參數(shù)為含水量30%、液料比42∶1 mL/g、超聲時間25 min、超聲溫度39 ℃。并進行3次平行驗證試驗，實際橄欖多酚提取率為7.46%±0.06%，與預(yù)測值總多酚提取率7.50%在5%偏差范圍內(nèi)，表明該模型可用于橄欖多酚提取。與課題組前期優(yōu)化的超聲輔助乙醇提取橄欖多酚（以53%乙醇為提取溶劑，液料比為32∶1 mL/g、超聲提取時間為30min，超聲溫度為50 ℃）比較，結(jié)果顯示超聲輔助乙醇法提取的多酚得率為7.01%±0.07%。提示超聲輔助低共熔溶劑提取橄欖多酚顯著提高了橄欖多酚的得率（P＜0.05）。

2.4 橄欖多酚對DPPH清除能力的評價

如圖8所示，隨著橄欖多酚濃度的增加，清除DPPH自由基的能力增強，DES法提取的橄欖多酚質(zhì)量濃度從1.48 μg/mL到14.84 μg/mL時，橄欖多酚的清除率從25.20%增加到95.70%，橄欖多酚IC50為3.05 μg/mL，抗壞血酸的IC50為6.47 μg/mL；而醇提法提取液中橄欖多酚IC50為3.07 μg/mL。結(jié)果表明，DES提取的橄欖多酚對DPPH自由基清除能力與醇提法提取的橄欖多酚相當(dāng)，且清除能力明顯高于陽性對照抗壞血酸。提示超聲輔助低共熔溶劑法可保持橄欖多酚良好的抗氧化活性。

圖8 DPPH清除率測定結(jié)果圖

3 結(jié)論與討論

利用超聲輔助低共熔溶劑對橄欖中多酚成分的提取進行了探索，并對多酚提取液的抗氧化情況進行了考察評價。低共熔溶劑的性能很大程度上是由氫鍵受體和氫鍵供體種類決定的。在提取過程中，選擇一種合適的DES至關(guān)重要。此試驗以氯化膽堿為氫鍵受體，以醇、酸、脲、乙酰胺為氫鍵供體，通過預(yù)試驗篩選了不同的低共熔溶劑組合，制備了8種不同體系的DES。驗試結(jié)果表明，8種DES中，由氯化膽堿-乙二醇（摩爾比1∶4）構(gòu)成的DES更適合于橄欖多酚的提取。經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化，橄欖多酚的最佳提取工藝：采用含水量為30%的氯化膽堿-乙二醇（摩爾比1∶4）為提取溶劑、液料比為42∶1 mL/g、超聲時間為25 min、超聲溫度為39 ℃。在此條件下，橄欖多酚得率為7.46%±0.06%，顯著高于橄欖多酚得率為7.01%±0.07%的超聲輔助乙醇法。

通過DPPH清除試驗，以抗壞血酸為參照，在橄欖多酚質(zhì)量濃度為14.84 μg/mL時，清除DPPH的抑制率高達95.70%。DES提取的橄欖多酚清除DPPH的半數(shù)抑制濃度（IC50）為3.05 μg/mL，醇提法提取的橄欖多酚為3.07 μg/mL，抗壞血酸為6.45 μg/mL。兩種提取法的橄欖多酚抗氧化活性相當(dāng)，且明顯高于抗壞血酸。可見采用超聲輔助低共熔溶劑法提取橄欖多酚不僅提取效率高，而且可保持橄欖多酚良好的抗氧化活性。

綜上，超聲輔助低共熔溶劑法提取橄欖多酚綠色環(huán)保、簡單易行、提取率高，且提取的橄欖多酚具有良好的抗氧化活性，可作為藥食同源橄欖中橄欖多酚提取的新方法，為橄欖資源的充分開發(fā)利用奠定了試驗基礎(chǔ)。