王宇婷，金鐵巖，王云峰，王龍宇，張智勇，熊思睿

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）

假谷物也稱為準(zhǔn)谷物，并不是真正意義上的谷物，但與谷物有相同的營(yíng)養(yǎng)成分及功能。假谷物中存在高質(zhì)量的淀粉、膳食纖維、蛋白質(zhì)，豐富的礦物質(zhì)、維生素及其他的生物活性物質(zhì)，可以為人體提供營(yíng)養(yǎng)和能量，是重要的能源物質(zhì)之一[1]。

紫莧籽粒（purple amaranth grain）是一種新型的糧食作物資源，被人們稱為假谷物，并不是真正的谷物產(chǎn)品，它的成分和用途與小麥、大米等谷物相似，且不包含麩質(zhì)[2]，目前作為優(yōu)質(zhì)的食品原料摻入谷物食品中[3]。紫莧籽粒中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、維生素、礦物質(zhì)，膳食纖維及不飽和脂肪酸等其他生物活性，例如多酚[4]。紫莧籽粒粉中豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素以及微量元素可以有效預(yù)防慢性疾病的發(fā)生。因此它的使用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。同時(shí)具有顯著的降血壓、降血脂、延緩衰老、預(yù)防慢性疾病的作用[5]，因此紫莧籽粒粉的保健功效和藥用價(jià)值較高。而且有大量的研究證明，植物中多酚具有一定的抗氧化能力[6]。因此植物中的多酚被添加到保健食品中，充分發(fā)揮了紫莧籽粒的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[7]，進(jìn)而生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)健康的食品，對(duì)此可以進(jìn)行更深度的研究。

試驗(yàn)對(duì)乙醇提取紫莧籽粒中的多酚含量進(jìn)行測(cè)定，得出最優(yōu)提取的多酚含量，并對(duì)紫莧籽粒乙醇提取物（AEE）的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。研究表明紫莧籽粒多酚類物質(zhì)的抗氧化性能力，可提升紫莧籽粒的利用價(jià)值，為開(kāi)拓紫莧籽粒市場(chǎng)提供了理論數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫莧籽粒粉末（延邊悟德醬酒有限公司）；體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；抗壞血酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ABTS標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，上海源葉生物科技有限公司）；碳酸鈉、氯化鐵、鐵氰化鉀、福林酚、三氯乙酸、過(guò)硫酸鉀、鹽酸溶液、磷酸鹽緩沖液（均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

YP2002分析天平（上?？平虄x器有限公司）；GC-MS-QP2010電子天平（上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司）；U-3900紫外分光光度計(jì)（日立天美公司）；Y-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-IIIA型真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；FD=1C-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；101B電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 紫莧籽粒多酚含量的測(cè)定

測(cè)定多酚含量的原理是Folin-Ciocalteu試劑中多酚發(fā)生的還原反應(yīng)。參考滿朝坤[8]的方法檢測(cè)多酚含量，并繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取0.010 0 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解搖勻后定容至刻度線，獲得0.10 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別準(zhǔn)確移取0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于棕色容量瓶中，加蒸餾水至總體積6.0 mL，后加入0.5 mL福林試劑并攪拌均勻，在0.5～8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢?，定容，?0 ℃條件下避光0.5 h，取6.0 mL無(wú)標(biāo)準(zhǔn)溶液蒸餾水作為空對(duì)照，在波長(zhǎng)750 nm處測(cè)量吸光度，并平行測(cè)量每個(gè)樣品3次。

1.2.2 紫莧籽粒提取物制備

紫莧籽粒粉過(guò)0.180 mm篩，放在-20 ℃的冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

將紫莧籽粒粉末與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇以不同比例混合，在25 ℃的條件下浸泡1～24 h后進(jìn)行過(guò)濾，取上清液進(jìn)行抽濾。得到的乙醇提取液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在減壓下蒸發(fā)出乙醇和多余的水分，最后得到紫莧籽粒粉末提取物浸膏。將該浸膏放在-70 ℃的冰箱內(nèi)冷凍后放在真空冷凍干燥機(jī)中儲(chǔ)存，凍干后變成粉末，稱重并密封儲(chǔ)存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取6 g紫莧籽粒粉，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%，60%，70%，80%和90%的乙醇提取劑，料液比按1∶30（g/mL）混合，浸泡24 h后，得到上清液并采用福林酚法測(cè)定得到溶液中的多酚物質(zhì)含量。

1.2.3.2 料液比對(duì)多酚提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取6 g紫莧籽粒粉，使用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇為提取劑，分別按照料液比1∶5，1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）混合，浸泡24 h后得到上清液并采用福林酚法測(cè)定得到溶液中的多酚物質(zhì)含量。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取含量的影響

準(zhǔn)確稱取6 g紫莧籽粒粉，使用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇為提取劑，料液比按1∶30（g/mL）混合，分別浸泡1，3，6，12和24 h后得到上清液并采用福林酚法測(cè)定得到溶液中的多酚物質(zhì)含量。

1.2.4 正交試驗(yàn)

通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果分析乙醇提取紫莧籽粒中多酚含量，其單因素的最優(yōu)條件為料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、浸泡時(shí)間12 h，設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH又稱1, 1二苯基-2-三硝基苯肼，它是一種極其穩(wěn)定的氮中心自由基[10]。測(cè)定植物提取物的抗氧化能力一般選擇DPPH自由基作為衡量指標(biāo)。DPPH的特征吸收峰位于517 nm附近。利用試驗(yàn)檢測(cè)不同的吸光度對(duì)清除自由基能力進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]，該方法是研究體外自由基清除能力中用到最多的方法，此方法便捷，高效[12-13]。

將4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液分別與不同濃度的紫莧籽粒多酚提取液放置在試管中充分混勻，室溫下避光約0.5 h，以無(wú)水乙醇與水體積比1∶1作為空白試驗(yàn)。

將維生素C（抗壞血酸）作為對(duì)照，處理方法同上，測(cè)定后計(jì)算紫莧籽粒多酚提取物對(duì)DPPH自由基清除率（%），按式（1）計(jì)算。

式中：A0為測(cè)定樣品溶液在517 nm處的吸光度；A1為紫莧籽粒提取物和無(wú)水乙醇溶液（1∶1）混合后的吸光度；A2為DPPH溶液和無(wú)水乙醇混合后的吸光度。

1.2.6 ABTS自由基清除率測(cè)定

ABTS的特征吸收峰位于734 nm附近。通過(guò)檢測(cè)吸收，從而評(píng)估ABTS自由基清除能力[14-15]。

制備ABTS工作液：準(zhǔn)確稱取4 mg過(guò)硫酸鉀和12mg ABTS，配制出7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液。將配制完成的ABTS溶液與過(guò)硫酸鉀溶液按1∶1混合，室溫下避光放置12～16 h，再用無(wú)水乙醇將混合溶液稀釋約50倍，確保其在734 nm處吸光度為0.7±0.02。分別提取4 mL不同濃度的紫莧籽粒提取液于試管，再加入16 mL ABTS工作液，混勻后靜置6 min，檢測(cè)其在734 nm處吸光度A0，將蒸餾水作為空白對(duì)照，檢測(cè)其吸光度A1。

將維生素C（抗壞血酸）作為對(duì)照，處理方法同上，檢測(cè)后計(jì)算紫莧籽粒多酚提取物對(duì)ABTS自由基清除率（%），按式（2）計(jì)算。

式中：A1為ABTS工作液與蒸餾水混合后測(cè)得的吸光度；A0為紫莧籽粒提取物液與ABTS工作液混合后測(cè)得的吸光度。

1.2.7 Fe3+還原能力測(cè)定

把不同濃度的AEE移入試管，取5 mL在50 ℃下冷卻0.5 h后取出。然后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心15 min。取5 mL懸液，依次加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%氯化鐵溶液，攪拌均勻，反應(yīng)約9 min后在700 nm處測(cè)量吸光度[16]。以抗壞血酸（VC）作為參照，操作方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚含量的影響

根據(jù)圖1可知，在只改變乙醇體積分?jǐn)?shù)的條件下，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇提取時(shí)得到的多酚含量最多（10.684 mg/g）。因此得出乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得到的多酚含量最優(yōu)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取含量的影響

2.2 料液比對(duì)多酚含量的影響

根據(jù)圖2可知，在只改變料液比的條件下，在料液比為1∶30（g/mL）時(shí)提取得到的多酚含量最多（10.873 mg/g）。因此得出料液比1∶30（g/mL）時(shí)得到的多酚含量最優(yōu)。

圖2 料液比對(duì)多酚含量的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)多酚含量的影響

根據(jù)圖3可知，在只改變提取時(shí)間的條件下，在提取時(shí)間為12 h得到的多酚含量最多（10.914 mg/g）。因此得出提取時(shí)間在12 h得到的多酚含量最優(yōu)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚含量的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2和表3分析得出，相對(duì)明顯的影響因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C），以上三個(gè)因素對(duì)紫莧籽粒乙醇提取多酚最優(yōu)的理論方案是A2B3C3；而正交試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)方案是A2B2C3，原因是正交試驗(yàn)因素水平較少造成的偏差。所以理論最優(yōu)水平A2B3C3為最終的最優(yōu)方案，即用配制好體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液浸泡，料液比1∶33（g/mL），提取時(shí)間12 h，在以上因素下稱取6 g紫莧籽粒粉末進(jìn)行試驗(yàn)，得到的多酚含量為10.914 mg/g，得到的結(jié)果比正交試驗(yàn)得好。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

2.5 紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除能力

如圖4所示，DPPH屬于強(qiáng)抗氧化劑[17]，如果維生素C的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，會(huì)被完全還原呈透明色。因此，在此濃度水平下AEE的自由基清除率為25%～38%。多酚提取物消除自由基的能力與劑量呈成正相關(guān)，即多酚提取物濃度越高，DPPH自由基消除能力越強(qiáng)，由此可見(jiàn)紫莧籽粒提取物的濃度與其抗氧化活性直接相關(guān)，該結(jié)果與之前的研究一致[18]。Shah等[19]也研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物可以作為質(zhì)子供體發(fā)揮功能。所以，紫莧籽粒提取物中的化合物可能也存在相似作用。當(dāng)其質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)，AEE的自由基清除能力為75.43%。與陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸相比，抗壞血酸對(duì)DPE的去除率顯著低于對(duì)照組（P＞0.05）。如果其質(zhì)量濃度超過(guò)3 mg/mL時(shí)，紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除率上升幅度較小。因此，利用乙醇提取能夠獲得活性更優(yōu)的提取物，可以用于制作抗氧化劑。

圖4 紫莧籽粒提取物的DPPH自由基清除能力

2.6 紫莧籽粒提取物ABTS自由基清除能力

如圖5所示，AEE對(duì)ABTS自由基的清除能力較高。如果提取物的質(zhì)量濃度低于2.5 mg/mL，AEE的清除能力在17.53%～58.94%之間。當(dāng)質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，AEE對(duì)ABTS的去除率最高為61.02%，但顯著低于VC。與DPPH自由基清除能力對(duì)比，AEE對(duì)ABTS自由基的清除能力不足。參考其他研究人員的結(jié)論，也證實(shí)了假谷物與普通谷物的ABTS自由基的清除能力都不算良好的結(jié)論[20]。

圖5 紫莧籽粒提取物的ABTS自由基清除能力

2.7 紫莧籽粒提取物的鐵離子還原能力

如圖6所示，紫莧籽粒提取物和維生素C的鐵離子還原性與其濃度呈正比，濃度升高則還原能力增強(qiáng)，但是紫莧籽粒提取物的還原能力不如維生素C。如果紫莧籽粒提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL，AEE的吸光度是2.156，由此可見(jiàn)AEE具備鐵離子還原能力。

圖6 紫莧籽粒提取物的鐵離子還原能力

3 結(jié)論

紫莧籽粒提取物多酚含量比紫莧籽粒原料多，其原因可能是乙醇溶劑為物質(zhì)發(fā)散提供液體環(huán)境并促進(jìn)化合物或離子締合[21]。紫莧籽粒在用乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶33（g/mL）、提取時(shí)間12 h的條件下含量最優(yōu)。紫莧籽粒提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和鐵離子都有良好的自由基清除能力。其中紫莧籽粒乙醇提取物（AEE）的DPPH自由基清除能力最優(yōu)。提取物的濃度越高，抗氧化活性和還原能力也隨之上升。但是與相同濃度的維生素C溶液相比，AEE的抗氧化活性不高。

總之，由于紫莧籽粒提取物中有一定濃度的多酚，而多酚在自由基捕獲和還原能力方面有所差異，追根溯源，紫莧籽粒提取物中多酚分子的酚羥基發(fā)揮協(xié)同作用從而發(fā)生對(duì)自由基清除能力的抑制是其主要原因[22]。有關(guān)分析顯示，紫莧籽粒提取物的自由基清除和還原功能有所差異，這與提取物中的多酚有關(guān)，因此可研發(fā)以青紫莧籽粒為主要原料的保健食品。