陳 殊，石宣宜，顧子嫻，陳家毅，蔣紅霞，張 亮，孫 群，劉建群

· 藥理與臨床?

基于代謝組學(xué)與琥珀酸/血管內(nèi)皮生長因子信號通路的雷公藤煨制增效機制研究

陳 殊，石宣宜，顧子嫻，陳家毅，蔣紅霞，張 亮，孫 群，劉建群*

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

觀察雷公藤煨制前后對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型大鼠的影響，并基于代謝組學(xué)與琥珀酸/血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）炎癥信號通路共同探索雷公藤煨制的增效機制。采用大鼠尾根部皮內(nèi)注射牛II型膠原乳劑復(fù)制CIA大鼠模型，分別給予醋酸地塞米松、雷公藤生品總提取物、雷公藤煨制品總提取物治療20 d。通過大鼠足腫脹度、關(guān)節(jié)炎評分、血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平、滑膜病理組織切片評估藥效；采用代謝組學(xué)技術(shù)對各組間的代謝差異進行表征；檢測滑膜中琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力以及琥珀酸和富馬酸的含量；采用免疫組化法檢測滑膜組織VEGFA、血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）表達。與模型組比較，雷公藤生品總提取物組和煨制品總提取物組大鼠足腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分顯著降低（＜0.05），血清中IL-1β水平顯著降低（＜0.05），滑膜組織病理改變明顯減輕，滑膜中琥珀酸含量顯著降低（＜0.05），SDH活力無明顯改變，滑膜組織VEGFA和CD31表達均顯著下調(diào)（＜0.05）。與生品總提取物組比較，煨制品總提取物組SDH活力無明顯改變，其余各項指標(biāo)明顯更向?qū)φ战M接近（＜0.05）。代謝組學(xué)結(jié)果表明，從模型組中共篩選出15個差異代謝物，經(jīng)煨制總提取物治療后，6個差異代謝物較模型組明顯回調(diào)（＜0.05），且與生品總提取物組相比明顯更接近對照組（＜0.05）。這些代謝物的變化涉及了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、色氨酸代謝、能量代謝、花生四烯酸代謝。煨制可顯著提高雷公藤對CIA模型大鼠的治療效果，其增效作用機制可能與調(diào)控纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，色氨酸代謝，能量代謝，花生四烯酸代謝途徑有關(guān)。雷公藤可通過調(diào)節(jié)琥珀酸/VEGF信號通路改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，煨制可增強雷公藤對該信號通路的調(diào)控從而發(fā)揮增效作用。

雷公藤；煨制；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；代謝組學(xué)；琥珀酸/血管內(nèi)皮生長因子炎癥信號通路；1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮1-1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮；雷公藤甲素；tripfordine A；雷公藤內(nèi)酯酮；雷公藤紅素；雷公藤晉堿；雷公藤定堿；雷公藤次堿

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管新生為主要病理特征，具有較高發(fā)病率與致殘率[1]。據(jù)估計，高達80%的RA患者有一種或多種并發(fā)癥，從而導(dǎo)致壽命縮短[2]。嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量，造成了沉重的社會負擔(dān)。目前，最常用于治療RA的藥物主要是改善病情類抗風(fēng)濕藥、新型生物制劑、非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素等，長期使用這些藥物不良反應(yīng)較多，且治療周期較長，患者難以堅持，導(dǎo)致治療效果不佳[3]。因此，開發(fā)高效低毒的藥物來治療RA具有重要意義。

雷公藤Hook. f.為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，具有祛風(fēng)除濕、消除止痛、活血化瘀、解毒殺蟲等功效[4]。雷公藤自1969年來被廣泛應(yīng)用于RA的治療，療效顯著，是國內(nèi)治療RA的首選單味中藥[5]。然而，雷公藤對肝、腎、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等有明確的損害，限制了其臨床應(yīng)用[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)煨制雷公藤不良反應(yīng)較小，治療佐劑性關(guān)節(jié)炎的效果顯著優(yōu)于生藥[8]，然而煨制對雷公藤的增效作用機制尚不清楚。代謝組紊亂是RA發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件，RA發(fā)病過程中會影響到代謝的多個途徑，從而對機體代謝物產(chǎn)生影響，代謝組學(xué)可從系統(tǒng)生物學(xué)角度為RA的治療提供新的思路[9-10]。琥珀酸是能量代謝中三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，其在滑膜組織中的堆積是RA有別于其他關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志，也被認為是導(dǎo)致滑膜病理變化的關(guān)鍵因素之一[11]。研究表明，抑制琥珀酸的堆積可降低血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產(chǎn)生和滑膜組織中內(nèi)皮細胞的活化，抑制血管新生，從而改善RA[12]。琥珀酸可作為一個潛在的信號分子將代謝與血管新生聯(lián)系起來?；诖?，本實驗建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型以評價煨制前后雷公藤治療RA的療效差異，同時基于代謝組學(xué)與琥珀酸/VEGF炎癥信號通路共同探討雷公藤煨制抗RA的增效作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量170～190 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（贛）2019-0004。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗，溫度23～26 ℃，相對濕度50%～70%。動物實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號JZLLSC20220515）。

1.2 藥材

雷公藤根采自江西省萍鄉(xiāng)市，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉建群教授鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤Hook. f.的根。

1.3 藥品與試劑

醋酸地塞米松（批號20210601）購自新鄉(xiāng)市常樂制藥有限責(zé)任公司；對照品1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮、tripfordine A、雷公藤定堿、雷公藤晉堿均為本實驗室自制，質(zhì)量分數(shù)均＞98%；對照品雷公藤紅素（批號FY210927）、雷公藤甲素（批號FY140320）、雷公藤內(nèi)酯酮（批號FY140325）及雷公藤次堿（批號FY140323）均購自鄭州豐耀農(nóng)業(yè)科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均＞98%；琥珀酸（批號MUST-11052307）購自成都曼斯特生物科技有限公司；富馬酸（批號F-016-170426）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；牛II型膠原（批號20022）、不完全弗氏佐劑（批號7002）均購自美國Chondrex公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號20221025）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）檢測試劑盒（批號20221017）均購自南京建成生物工程研究所；乙腈（質(zhì)譜級，批號C11976742）購自德國Merck公司；甲醇（質(zhì)譜級，批號L2017082）、甲酸（質(zhì)譜級，批號J2022123）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；VEGFA抗體（批號19003-1-AP）購自美國Proteintech公司；血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）抗體（批號Bs-0468R）、生物素標(biāo)記山羊抗兔抗體（批號bs-0295G-Bio）、HRP標(biāo)記鏈霉親和素（批號bs-0437P-HRP）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒（批號ZLI-9017）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Acquity UPLC液相色譜系統(tǒng)、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS型質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Milli-Q型超純水儀（美國MilliPore公司）；Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；SPARK 10M型多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）；YLS-7B型足趾容積測量儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；MF43型顯微鏡、MC50型數(shù)碼成像測量分析系統(tǒng)（廣州明美科技有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

按照本課題組前期研究方法制備雷公藤生品總提取物（total extract，TE）和煨制品總提取物（roasted total extract，RTE）[8]。將雷公藤根藥材均分為2份，其中1份用黃泥均勻包裹，包層厚度約0.3 cm，于200 ℃的烘箱中煨制45 min，涼透后剝離黃泥。將經(jīng)煨制處理的藥材和未經(jīng)處理的藥材分別切碎，均采用5倍量70%乙醇回流提取3次（1.5、1.5、1 h）。提取液合并濃縮，減壓蒸干，即得到TE和RTE。

2.2 TE和RTE成分分析及含量測定

研究表明，雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素以及生物堿是雷公藤的主要有效成分[13-15]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素及其煨制轉(zhuǎn)化物1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮，以及生物堿是雷公藤煨制后顯著變化的成分[16]，故本研究選取雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤定堿、tripfordine A（生物堿）、1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮8個成分對TE和RTE進行成分分析及含量測定。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤定堿、tripfordine A、1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮適量，加甲醇溶解并定容，均制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品儲備液。上述對照品儲備液各取0.5 mL于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得各對照品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取TE 0.1 g（相當(dāng)于生藥材0.794 g）、RTE 0.093 5 g（相當(dāng)于生藥材0.794 g），用甲醇溶解后定容于10 mL量瓶中，即得10 mg/mL TE供試品溶液和9.35 mg/mL RTE供試品溶液。

2.2.3 成分分析及含量測定 根據(jù)混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC圖譜，對比分析TE和RTE中的主要成分及煨制后顯著變化的成分，采用外標(biāo)法計算雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤定堿、tripfordine A、1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮在TE和RTE中的含量。色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～25% B；10～12.5 min，25%～30.5% B；12.5～30 min，30.5%～47% B；30～47 min，47%～72% B；47～57 min，72%～100% B；57～60 min，100% B；體積流量1 mL/min；檢測波長218 nm；進樣量10 μL；柱溫為室溫。

2.3 CIA大鼠模型的制備

根據(jù)文獻中的方法復(fù)制CIA大鼠模型[17]。將等體積的牛II型膠原溶液和不完全弗氏佐劑在冰浴上用手持式勻漿機充分混勻制備乳劑，質(zhì)量濃度為1 mg/mL。大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.2 mL乳劑進行初次免疫，7 d后繼續(xù)注射0.1 mL上述乳劑加強免疫。

2.4 動物分組及給藥

取7只大鼠作為對照（control，CON）組，剩余大鼠均尾根部皮內(nèi)注射膠原乳劑復(fù)制模型，CON組大鼠于同部位注射等體積生理鹽水。加強免疫后挑選造模成功的大鼠隨機均分為模型（model，MOD）組、醋酸地塞米松（dexamethasone acetate，DXMS）組、TE組和RTE組，每組7只。實驗約第21天出現(xiàn)炎癥癥狀后，開始連續(xù)ig給藥20 d。CON組和MOD組ig等體積的5%羧甲基纖維素鈉溶液，DXMS組ig醋酸地塞米松4.72 mg/kg（根據(jù)臨床等效劑量換算），TE組和RTE組參照課題組前期研究給藥劑量分別ig 4.5 g/kg各提取物（按生藥量計）[8]。

2.5 樣本的采集及處理

于末次給藥后收集尿液樣本，將大鼠放入代謝籠，禁食不禁水，收集6 h的尿液，收集后置于?80 ℃冰箱保存。將收集的尿液各取500 μL合并于干燥離心管中，渦旋60 s混合均勻，標(biāo)記為質(zhì)控樣品。另外，所有樣品各取500 μL，分別置于干燥離心管中，4 ℃、4000 r/min離心10 min，加甲醇3 mL，渦旋3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液3 mL，氮氣吹干后加甲醇200 μL復(fù)溶。復(fù)溶液渦旋3 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣瓶中進行UPLC-Q-TOF-MS分析。大鼠在收集完尿液后麻醉，采用腹主動脈取血，采血后室溫靜置1 h，3000 r/min離心15 min，分離血清用于炎癥因子IL-1β的檢測。最后取大鼠肝、腎以及滑膜組織于4%多聚甲醛中固定。

2.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.6.1 一般狀況觀察 分別于造模前、給藥前、給藥后觀察并記錄大鼠的飲食情況、毛色狀態(tài)及行為變化等肉眼可見的特征。

2.6.2 足腫脹度檢測及關(guān)節(jié)炎評分 給藥后0、4、8、12、16、20 d用足趾容積測量儀測量大鼠足趾容積，并進行關(guān)節(jié)炎評分。關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準(zhǔn)[18]：0分為無腫脹、紅腫；1分為跗骨或踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫；2分為從腳踝到跗骨出現(xiàn)腫脹和發(fā)紅；3分為從腳踝到跖骨關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫；4分為腳踝、跗骨和跖骨周圍紅腫。大鼠的關(guān)節(jié)炎評分大于4分，則表示造模成功，大鼠單個肢體的得分不能超過4分，共計得分不能超過16分。

足趾腫脹度＝造模后足趾容積平均值－造模前足趾容積平均值

2.6.3 IL-1β含量檢測 嚴格按試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清中IL-1β的含量。

2.6.4 代謝組學(xué)分析條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，5% B；2～16 min，5%～29% B；16～21 min，29%～47% B；21～24 min，47%～80% B；24～26 min，80%～95% B；26～32 min，95% B；32～32.1 min，95%～5% B；32.1～34 min，5% B；體積流量0.3 mL/min；進樣量3 μL；柱溫30 ℃；樣品室溫度10 ℃。

離子源溫度為120 ℃，采用正離子掃描模式，毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為40 V，采集范圍為/50～1000。為確保質(zhì)量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，利用亮氨酸腦啡肽進行實時質(zhì)量校正。為保證整個分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在本實驗中使用質(zhì)控樣品進行方法學(xué)驗證，質(zhì)控樣品由每個正常樣品各取500 μL混合而得。同一模式下，批量樣品檢測時以隨機順序進行，以減少誤差。

2.6.5 肝、腎及滑膜組織病理學(xué)的檢測 4%多聚甲醛固定后的肝、腎及滑膜組織進行常規(guī)的蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察各組肝、腎及滑膜組織病變情況。

2.6.6 滑膜組織中SDH活性及琥珀酸含量測定

（1）SDH活性測定：將滑膜組織用液氮凍硬后立即研磨成粉，根據(jù)其質(zhì)量加入10倍的生理鹽水以制備勻漿。取滑膜組織勻漿液，參照說明書檢測SDH活性。

（2）琥珀酸含量測定[19]：吸取300 μL滑膜勻漿加入等量的0.5 mol/L高氯酸混合均勻，樣品冰浴10 min后，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，上清液通過0.45 μm微孔膜過濾器濾過。制備濃度為1 000 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm微孔膜過濾至注射瓶中。HPLC分析條件：Ultimate AQ-C18色譜柱，以0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 2.5）為流動相進行等度洗脫，體積流量1 mL/min，波長210 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL。

2.6.7 免疫組化法檢測滑膜組織VEGFA、CD31表達 取“2.6.5”項下石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后，用pH 6.0的檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，3% H2O2室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性，3%牛血清白蛋白溶液室溫封閉15 min。隨后滴加VEGFA（1∶200）、CD31（1∶200）一抗工作液，4 ℃孵育過夜；加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育15 min；加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素工作液，37 ℃孵育15 min。最后加二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件讀取平均吸光度（）值進行統(tǒng)計分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 TE和RTE HPLC分析

混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC分析見圖1，雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素、雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤定堿、tripfordine A、1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮在TE和RTE中的含量見表1。

3.2 各組大鼠一般狀況檢查

各組大鼠在造模成功后出現(xiàn)進食減少，神態(tài)疲倦，常處于休息狀態(tài)，大鼠足爪部位可見紅斑與腫脹，關(guān)節(jié)功能活動障礙，活動遲緩，部分大鼠常因疼痛難忍而啃咬紅腫部位。治療結(jié)束后，CON組大鼠精神狀況良好，毛色光澤，行為活躍，反應(yīng)靈敏；MOD組與之前沒有明顯變化；TE組和RTE組大鼠食欲恢復(fù)，神態(tài)與活動皆正常，足腫脹度明顯減輕；DXMS組大鼠神態(tài)與活動皆正常，足腫脹度明顯減輕，但食欲仍未恢復(fù)。

1-1-羥基-2,5,8-三甲基-9-芴酮 2-雷公藤甲素 3-tripfordine A 4-雷公藤內(nèi)酯酮 5-雷公藤紅素 6-雷公藤晉堿 7-雷公藤定堿 8-雷公藤次堿

表1 TE和RTE中8個成分的含量

3.3 各組大鼠肝、腎組織病理變化

如圖2所示，各組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，未見炎性細胞浸潤和纖維組織增生，肝細胞正常，未見肝細胞變性、水腫、壞死。各組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，細胞質(zhì)和細胞核染色清晰，腎小管腔、腎小球和囊腔完整，無充血或炎性細胞浸潤現(xiàn)象。肝腎組織切片結(jié)果表明，各藥物在該劑量下連續(xù)給藥20 d不產(chǎn)生明顯的肝、腎毒性。

CON-對照組 MOD-模型組 DXMS-醋酸地塞米松組 TE-生品總提物組 RTE-煨制品總提物組，下圖同

3.4 各組大鼠關(guān)節(jié)炎評分及足腫脹度

如圖3所示，與CON組比較，MOD組足腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分顯著升高（＜0.05）；與MOD組比較，TE組和RTE組自給藥第4天后足腫脹度顯著降低（＜0.05），自給藥第12天后關(guān)節(jié)炎評分顯著降低（＜0.05）。RTE組自給藥第12天后足腫脹度和給藥第16天后關(guān)節(jié)炎評分顯著低于TE組（＜0.05），并且趨勢更向CON組靠近。

與CON組比較：*P＜0.05；與MOD組比較：#P＜0.05；與TE組比較：△P＜0.05，下圖同

3.5 雷公藤煨制前后對CIA大鼠血清中IL-1β水平的影響

如圖4所示，與CON組比較，MOD組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高（＜0.05）；與MOD組比較，各給藥組IL-1β水平均顯著下降（＜0.05）；與TE組比較，RTE組IL-1β水平顯著下降（＜0.05）。

3.6 尿液代謝組學(xué)

3.6.1 大鼠尿液總離子流圖 采用UPLC-Q-TOF-MS進行尿液樣品的分離和數(shù)據(jù)采集，得到各組大鼠尿液的總離子流圖（圖5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組樣品的總離子流圖基本相似，但各組峰形及峰面積存在一定差異，表明大鼠體內(nèi)部分代謝物發(fā)生變化。

圖4 各組大鼠血清中IL-1β水平(, n = 7)

圖5 正離子模式下大鼠尿液總離子流圖

3.6.2 PCA和OPLS-DA分析 首先應(yīng)用PCA散點圖（圖6）過濾異常值，然后采用OPLS-DA（圖7）對數(shù)據(jù)進行分析以突出組間差異，便于后續(xù)尋找潛在差異生物標(biāo)志物。PCA結(jié)果顯示，各組樣本之間存在一定的交叉，但CON組與MOD組樣本可較明顯地分開，表明CIA大鼠尿液中的代謝物發(fā)生了明顯的變化。OPLS‐DA結(jié)果顯示，CON組和MOD組、DXMS組與MOD組、TE組與MOD組、RTE組與MOD組以及TE組和RTE組分離明顯，顯示了良好的模型適應(yīng)性。為了避免過度擬合，本研究還進行了OPLS-DA模型驗證（置換檢驗＝200）。結(jié)果見圖7，模型具有較好的穩(wěn)定性且不存在過擬合現(xiàn)象。

圖6 各組大鼠尿液PCA散點圖

3.6.3 生物標(biāo)志物的篩選 通過VIP值（VIP＞1）及值（＜0.05）篩選出差異性化合物。將差異性化合物精確的分子離子在HMDB數(shù)據(jù)庫中進行數(shù)據(jù)識別，找出對應(yīng)物質(zhì)，見表2。通過對比CON組和MOD組，最終從尿液中篩選出5-羥基吲哚乙酸、白三烯B4、尿苷5′-單磷酸等15個與RA相關(guān)的生物標(biāo)志物。9個生物標(biāo)志物在TE治療后明顯回調(diào)，為TE潛在的抗RA生物標(biāo)志物，包括 ()-2-乙酰-2-羥基丁酸、肌酸、5-羥基吲哚乙酸、-乙酰色氨酸、-棕櫚酰色氨酸、5-甲酰胞嘧啶、白三烯B4、磷脂酸（8∶0/10∶0）、3-羥基-4，6-庚二炔-1-yl-1-葡萄糖苷。其中RTE組 ()-2-乙酰-2-羥基丁酸、5-羥基吲哚乙酸、-乙酰色氨酸、肌酸、磷脂酸（8∶0/10∶0）、白三烯B4等代謝物水平與TE組相比具有顯著性差異（＜0.05），并向CON組回調(diào)，為RTE潛在的抗RA增效生物標(biāo)志物，見圖8。

圖7 各組大鼠尿液OPLS-DA及相應(yīng)模型驗證圖

表2 各組大鼠尿液中內(nèi)源性差異代謝物

表示MOD組相對于CON組上調(diào)，?表示MOD組相對于CON組下調(diào)；?表示TE組相對于MOD組上調(diào)，¤表示TE組相對于MOD組下調(diào)；?表示RTE組相對于MOD組上調(diào)，D表示RTE組相對于MOD組下調(diào)

means MOD groupCON group increase, ? means MOD groupCON group decrease; ? means TE groupMOD group increase, ¤ means TEMOD group decrease; ? means RTE groupMOD group increase, D means RTE groupMOD group decrease

圖8 與煨制增效相關(guān)的差異代謝物含量(, n = 7)

3.6.4 代謝通路分析 將篩選出的差異代謝物進行代謝途徑通路分析，結(jié)果見圖9。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，能量代謝，色氨酸代謝，花生四烯酸代謝，嘧啶代謝與RA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。RTE可通過調(diào)節(jié)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，能量代謝，色氨酸代謝，花生四烯酸代謝途徑來減輕炎癥反應(yīng)，并且通過這些途徑發(fā)揮其增效作用。

3.7 琥珀酸/VEGF信號通路

3.7.1 滑膜組織病理切片 如圖10所示，CON組、DXMS組和RTE組可見滑膜細胞排列規(guī)則，滑膜內(nèi)纖維間質(zhì)排列疏松，無炎性細胞浸潤；MOD組可見滑膜增生明顯，內(nèi)襯細胞層次增加明顯，間質(zhì)纖維增生，伴有大量炎性細胞浸潤；TE組可見滑膜增生，間質(zhì)纖維增生，伴有少量炎性細胞浸潤。

紅色表示相對于模型組上調(diào)，綠色表示相對于模型組下調(diào)

圖10 各組大鼠滑膜組織病理變化(HE, ×100)

3.7.2 對SDH活性及琥珀酸、富馬酸含量的影響 如圖11所示，與CON組比較，MOD組SDH活力、富馬酸含量明顯下降（＜0.05），琥珀酸含量明顯上升（＜0.05）；與MOD組比較，各給藥組SDH活力、富馬酸含量均無顯著性差異，琥珀酸含量明顯下降（＜0.05）；與TE組比較，DXMS組和RTE組SDH活力、富馬酸含量均無顯著性差異，琥珀酸含量明顯下降（＜0.05）。

3.7.3 對VEGFA、CD31表達的影響 如圖12所示，與CON組比較，MOD組CD31和VEGFA表達明顯增加（＜0.05）；與MOD組比較，各給藥組CD31和VEGFA表達均明顯減少（＜0.05）；與TE組比較，DXMS組和RTE組CD31和VEGFA表達均明顯減少（＜0.05）。

圖11 雷公藤煨制前后對CIA大鼠滑膜組織中SDH活力以及琥珀酸、富馬酸含量的影響(, n = 6)

圖12 雷公藤煨制前后對CIA大鼠滑膜組織CD31和VEGFA表達的影響 (, n = 6)

4 討論

CIA模型是一種經(jīng)典的臨床前模型，與人類RA的發(fā)病機制最為相似，是目前公認研究RA病理機制和評價治療藥物的最佳動物模型[20]。模型大鼠的足腫脹程度和關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學(xué)的改變可以反映藥物的療效和作用強度，常用于藥物有效性評價和藥物篩選。IL-1β是與RA的發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)系密切的促炎癥細胞因子，在RA患者及CIA大鼠血清中的水平顯著高于健康組[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)RTE可明顯降低CIA大鼠足腫脹程度、關(guān)節(jié)炎評分、血清中IL-1β水平，改善關(guān)節(jié)滑膜增生和炎性細胞浸潤，且效果顯著優(yōu)于TE，說明煨制對雷公藤具有確切的增效作用。

4.1 代謝組學(xué)分析

代謝組學(xué)是一種可在機體內(nèi)快速篩選藥物療效或毒性的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，采用“自上而下”的策略，在整體環(huán)境中反映生物系統(tǒng)代謝網(wǎng)絡(luò)的最終癥狀，與中藥治病整體性、動態(tài)性原則極其相似，可為評估中藥的療效和機制提供一種新思路[23-24]。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)分析了雷公藤煨制前后對CIA模型大鼠的尿液代謝產(chǎn)物的影響，共篩選出15個潛在的RA生物標(biāo)志物，其中5-羥基吲哚乙酸、尿苷5′-單磷酸、肌酸、白三烯B4、-乙酰色氨酸據(jù)以往的報道證明為可靠的RA生物標(biāo)志物，對于疾病的發(fā)生具有重要意義。而 ()-2-乙酰-2-羥基丁酸、環(huán)狀-乙酰羥色胺葡萄糖醛酸苷、β-胍基丙酸、-棕櫚酰色氨酸、5-甲酰胞嘧啶在以往的研究中鮮有報道，為本研究新發(fā)現(xiàn)的RA相關(guān)生物標(biāo)志物。在TE組中鑒定出9個與抗RA相關(guān)的生物標(biāo)志物，在RTE組鑒定出6個與抗RA相關(guān)的生物標(biāo)志物。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，RTE組中的6個抗RA生物標(biāo)志物與TE組高度重合，且與TE組相比明顯更向CON組回調(diào)。代謝通路分析顯示，TE和RTE均通過調(diào)節(jié)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，能量代謝，色氨酸代謝，花生四烯酸代謝發(fā)揮抗RA作用，煨制增效的機制可能與調(diào)控這些途徑有關(guān)。

()-2-乙酰-2-羥基丁酸是一種短鏈酮酸，參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝途徑，其中主要影響異亮氨酸的生物合成。異亮氨酸是一種支鏈氨基酸，研究顯示支鏈氨基酸可以刺激腫瘤壞死因子、細胞因子（如IL-1β）的產(chǎn)生[25]，這與本研究中CIA大鼠血清中IL-1β升高結(jié)果一致。此外，異亮氨酸可以影響5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）前體物質(zhì)的運轉(zhuǎn)，造成中樞神經(jīng)的疲勞[26]，這與本研究中模型大鼠神態(tài)疲倦相符合。本研究中，與CON組相比，MOD組中 ()-2-乙酰-2-羥基丁酸含量顯著下降。()-2-乙酰-2-羥基丁酸含量的變化影響了異亮氨酸的合成，從而刺激了CIA大鼠相關(guān)因子與5-HT前體物質(zhì)，引發(fā)了炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞，造成了機體的疲乏感。在給予TE和RTE后，()-2-乙酰-2-羥基丁酸含量較CON組顯著上升。說明TE和RTE可以通過調(diào)節(jié)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成抑制RA的炎癥反應(yīng)。

5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）是5-HT的分解產(chǎn)物，參與色氨酸代謝中的5-羥色胺途徑。當(dāng)機體處于炎癥狀態(tài)時中或細胞受到損傷后，5-HT會被釋放并通過單胺氧化酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為5-HIAA[27]。研究發(fā)現(xiàn)，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中5-HIAA水平顯著上調(diào)[28]。在本研究中，致炎的大鼠體內(nèi)大量5-HT被釋放轉(zhuǎn)化為5-HIAA并隨尿液排出，導(dǎo)致MOD組大鼠尿液中5-HIAA含量顯著上升。TE和RTE干預(yù)后，抑制了5-HT的釋放，減少了5-HIAA的產(chǎn)生，導(dǎo)致尿液中的5-HIAA含量較MOD組顯著下降。-乙酰色氨酸是腸道微生物群產(chǎn)生的色氨酸的分解代謝物。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者存在色氨酸代謝異常，體內(nèi)-乙酰色氨酸含量與RA發(fā)病率有關(guān)[29]。本實驗中MOD組較CON組-乙酰色氨酸的含量變化說明了CIA大鼠體內(nèi)的色氨酸代謝被擾亂，而TE和RTE通過回調(diào)-乙酰色氨酸水平來改善色氨酸代謝異常，從而發(fā)揮治療作用。

在許多疾病的過程中，隨著炎癥的發(fā)生和發(fā)展，體內(nèi)能量的消耗會反映在代謝產(chǎn)物中。肌酸是一種含氮氨基酸，在機體內(nèi)由精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸3種氨基酸所合成。肌酸可在肌酸激酶的作用下形成磷酸化肌酸，參與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）循環(huán)，在細胞內(nèi)能量的轉(zhuǎn)運過程中具有重要作用[30]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為RA患者關(guān)節(jié)局部存在低氧、缺氧和低血糖狀態(tài)，低氧導(dǎo)致氧化磷酸化途徑ATP的生成障礙[31]。在CIA大鼠中，低氧導(dǎo)致肌酸通過氧化磷酸化途徑生成ATP的過程受到阻礙，能量反應(yīng)受到抑制，從而導(dǎo)致肌酸在機體內(nèi)的含量升高。在經(jīng)TE和RTE治療后，肌酸含量明顯較MOD組下降，提示TE和RTE可能通過調(diào)節(jié)能量代謝發(fā)揮抗炎作用。

白三烯B4是一種炎癥脂質(zhì)介體，可激活并且聚集多種炎性和免疫效應(yīng)細胞，作用于T淋巴細胞釋放各種細胞因子[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在RA機體中含有較高濃度的白三烯B4，并且中性粒細胞釋放白三烯B4的能力增強[25]。白三烯B4通過抑制中性粒細胞凋亡并誘導(dǎo)其定向遷移、致關(guān)節(jié)疼痛過敏、調(diào)控免疫細胞分化和細胞因子表達等引發(fā)RA病人關(guān)節(jié)腫痛、骨質(zhì)破壞等炎癥反應(yīng)[33]。本實驗中MOD組大鼠尿液中白三烯B4含量顯著升高，與文獻一致。經(jīng)TE和RTE治療后，白三烯B4含量顯著下降，提示TE和RTE通過調(diào)控白三烯B4在體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)化從而下調(diào)炎癥因子的釋放，進而發(fā)揮對CIA大鼠的治療作用。

尿苷5′-單磷酸是一種單磷酸鹽形式的尿嘧啶核苷酸，能夠由從頭途徑或體內(nèi)核苷酸和核酸的降解產(chǎn)物獲得。在RA患者的關(guān)節(jié)中有大量活化的T細胞，它們需要大量嘧啶以維持其增殖[34]。研究表明，在佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠中尿苷5′-單磷酸含量顯著降低，是潛在的RA生物標(biāo)志物[35]。本實驗結(jié)果與文獻一致[35]，可能是活化的T細胞的增殖消耗了大量嘧啶，導(dǎo)致其含量的下降。

4.2 對琥珀酸/VEGF炎癥信號通路的影響分析

RA的發(fā)病機制目前尚不明確，關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管新生是其基本病理特征。血管新生發(fā)生在炎癥關(guān)節(jié)組織的早期，可以促進炎性細胞向關(guān)節(jié)的浸潤，在RA的發(fā)展中起著重要作用[36]。VEGFA作為效果突出的促血管生成因子，在RA滑膜組織中高表達[37]，可促進滑膜內(nèi)皮細胞活化以誘導(dǎo)炎癥，從而在RA中建立血管新生和關(guān)節(jié)炎癥之間的相互作用[38]。炎性介質(zhì)CD31被視為內(nèi)皮細胞和血管細胞的表面分子標(biāo)志，主要高表達于血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)中，在血管的生成中起到重要的作用[39]。在本研究中TE和RTE可明顯下調(diào)VEGFA和CD31的表達，RTE下調(diào)的趨勢較TE更加明顯，提示雷公藤可調(diào)節(jié)血管新生改善RA，煨制增效作用與血管新生有關(guān)。

琥珀酸是能量代謝中三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，可由SDH水解為富馬酸。研究表明，琥珀酸在RA患者關(guān)節(jié)滑膜液中大量堆積可加劇關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管新生，阻斷琥珀酸在滑膜中的堆積可抑制血管新生和滑膜炎癥，從而改善RA[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)TE和RTE均可抑制模型大鼠的琥珀酸堆積，煨制品抑制效果顯著優(yōu)于生品。在三羧酸循環(huán)中抑制SDH活力會導(dǎo)致琥珀酸過度堆積[40]。然而本研究中CIA大鼠中SDH活性顯著高于健康大鼠且雷公藤煨制前后大鼠滑膜中SDH活性、富馬酸含量無顯著差異。結(jié)合文獻發(fā)現(xiàn)，琥珀酸的積累可能是SDH活性逆轉(zhuǎn)的結(jié)果[12]。而雷公藤并未參與對SDH活性的調(diào)控，煨制增效機制也與SDH活性無關(guān)。

綜上，煨制可有效提高雷公藤對CIA大鼠的治療效果，其增效機制與調(diào)節(jié)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，能量代謝，色氨酸代謝有關(guān)。在與RA發(fā)病相關(guān)的差異代謝物中，5-羥基吲哚乙酸、尿苷5′-單磷酸、肌酸、白三烯B4、-乙酰色氨酸經(jīng)文獻研究證明為可靠的RA生物標(biāo)志物，對于疾病的發(fā)生具有重要意義。而 ()-2-乙酰-2-羥基丁酸、環(huán)狀-乙酰羥色胺葡萄糖醛酸苷、β-胍基丙酸、-棕櫚酰色氨酸、5-甲酰胞嘧啶在RA的研究中鮮有報道，為本研究新發(fā)現(xiàn)的RA相關(guān)生物標(biāo)志物。經(jīng)進一步的研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤可調(diào)節(jié)琥珀酸/VEGF炎癥信號通路阻止琥珀酸堆積和抑制血管新生，從而改善RA，煨制可增強雷公藤對該信號通路的調(diào)控從而發(fā)揮增效作用。本研究首次從代謝組學(xué)的角度及琥珀酸/VEGF炎癥信號通路闡釋了煨制雷公藤抗RA增效機制，為煨制在雷公藤中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，為雷公藤的深入研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Enhancing efficacy mechanism of roastedbased on metabolomics and succinate/VEGF signal pathway

CHEN Shu, SHI Xuan-yi, GU zi-xian, CHEN Jia-yi, JIANG Hong-xia, ZHANG Liang, SUN Qun, LIU Jian-qun

Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To explore the enhancing efficacy mechanism of roasted(TW) based on metabolomics and succinate/vascular endothelial growth factor (VEGF) signal pathway by observing the effect of TW before and after roasting on collagen-induced arthritis (CIA) model rats.CIA model rats were induced by hypodermic injecting with bovine type II collagen emulsion into the tails of rats and then treated with dexamethasone acetate, total extract of TW and total extract of roasted TW for 20 d. The curative effect was assessed by paw swelling, arthritis scores, serum levels of interleukin-1β (IL-1β) and pathological sections of synovial tissue. The differences in metabolic expression profiles among groups were characterized based on metabolomics. Succinate dehydrogenase (SDH) viability as well as succinate and fumarate content in synovial tissue were detected. The expressions of VEGFA and platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) in synovial tissue was measured by immunohistochemistry.Compared with model group, paw swelling and arthritis scores in total extract and roasted total extract groups were significantly decreased (< 0.05), interleukin-1β level in serum was significantly decreased (< 0.05), synovial histopathological changes were ameliorated, content of succinate in synovium was significantly decreased (< 0.05), SDH activity was not significantly changed, expressions of VEGFA and CD31 in synovium were significantly decreased (< 0.05). Compared with total extract group, SDH activity in roasted total extract group had no obvious change, and the other indexes were obviously closer to the control group (< 0.05). The metabolomics results showed that a total of 15 differential metabolites were screened from the model group. Among them, six differential metabolites were significantly callback compared to the model group after treatment with roasted total extract. Moreover, the levels of these six metabolites in roasted total extract group were significantly closer to the levels in control group than in total extract group (< 0.05). The results indicated that these metabolite changes involved valine, leucine and isoleucine biosynthesis, tryptophan metabolism, energy metabolism and arachidonic acid metabolism.Roasting is able to improve the therapeutic effect of TW on CIA model rats. The enhancing efficacy mechanism may be related to the regulation of valine, leucine and isoleucine biosynthesis, tryptophan metabolism, energy metabolism and arachidonic acid metabolic pathways. TW modulates the succinate/VEGF inflammatory signal pathway to improve rheumatoid arthritis. Roasting enhances the anti-rheumatoid arthritis effect of TW by regulating succinate/VEGF signal pathway.

Hook. f.; roasting; rheumatoid arthritis; metabolomics; succinate/vascular endothelial growth factor inflammatory signal pathway; 1-hydroxy-2,5,8-trimethyl-9-fluorenone; triptolide; tripfordine A; triptonide; tripterine; wilforgine; wilfordine; wilforine

R285.5

A

0253 - 2670(2023)12 - 3851 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.012

2023-02-05

國家自然科學(xué)基金資助項目（81860686）；江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人資助項目（20182BCB22004）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級科技創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（CXTD22007）

陳 殊，碩士研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評價研究。E-mail: 804118328@qq.com

通信作者：劉建群，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評價研究。Tel: (0791)87118786 E-mail: liu5308@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]