蒲美旨,馮小可,謝立群

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 中醫(yī)科,江蘇 南京,210029;2.南京醫(yī)科大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合研究所,江蘇 南京,210029)

胃食管反流病(GERD)是指酸性胃內(nèi)容物反流入食管,導(dǎo)致長(zhǎng)期存在的典型胃食管癥狀(胃灼熱和反酸)或特定并發(fā)癥(食管炎、食管狹窄和Barrett食管)[1]。GERD在中國(guó)的發(fā)病率低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家,但隨著現(xiàn)代生活方式的改變,其發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)[2]。嚴(yán)重的反流癥狀可導(dǎo)致睡眠障礙、焦慮抑郁、異常精神心理等并發(fā)癥,其中以失眠最為常見[3-4]。目前,GERD合并失眠的臨床治療仍以抑酸、保護(hù)胃黏膜輔以鎮(zhèn)靜、抗焦慮抑郁為主。然而,由于耐藥性、局限性以及明顯的副作用,GERD合并失眠的治療尚未取得令人滿意的效果[5]。因此,尋求更好改善GERD合并失眠的治療策略具有十分重要的意義。小柴胡湯源自《傷寒論》,是中醫(yī)和解少陽(yáng)的經(jīng)典方劑,具有和暢樞機(jī)、解郁調(diào)達(dá)之功效。臨床實(shí)踐[6]證明,小柴胡湯在治療GERD和失眠中取得了良好的療效。但由于中藥復(fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),目前小柴胡湯治療GERD合并失眠的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制及環(huán)節(jié)仍未明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),初步探討小柴胡湯治療GERD合并失眠的作用機(jī)制,以期為小柴胡湯的臨床使用提供新依據(jù),以及為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 篩選小柴胡湯活性成分及藥物靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php)中以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,獲取小柴胡湯的活性成分。將活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)名稱導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/),轉(zhuǎn)化為基因名稱,獲得小柴胡湯潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將以上收集到的活性成分及對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2(https：//cytoscape.org/),構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.3 收集GERD和失眠的疾病靶點(diǎn)

以"insomnia"、"gastroesophageal reflux disease"為關(guān)鍵詞,通過Gene Cards (https：//www.genecards.org/)、DisgeNet (https：//www.disgenet.org/)、TTD (http：//db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)收集GERD和失眠的疾病靶點(diǎn)。

1.4 收集小柴胡湯治療GERD合并失眠的潛在作用靶點(diǎn)

利用R語(yǔ)言(https：//www.r-project.org/)進(jìn)行靶點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析與可視化。取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集,得到小柴胡湯治療GERD合并失眠的潛在作用靶點(diǎn),并繪制維恩圖。

1.5 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

將小柴胡湯活性成分、潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。使用Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值篩選小柴胡湯治療GERD合并失眠的主要活性成分。

1.6 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因

將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https：//cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析,要求最低互作分?jǐn)?shù)>0.700。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2進(jìn)行可視化。以大于中位數(shù)2倍的度值篩選關(guān)鍵基因。

1.7 基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。導(dǎo)出P<0.01的富集結(jié)果,根據(jù)富集程度選取排名前15位的GO條目和前20位的KEGG通路進(jìn)行可視化。

1.8 構(gòu)建活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-器官/組織網(wǎng)絡(luò)

使用BioGPS(http：//biogps.org)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行關(guān)鍵基因定位。定位結(jié)果選擇物種為“人”且基因表達(dá)位列前5位的器官/組織。將關(guān)鍵基因、關(guān)鍵基因?qū)?yīng)的活性成分、器官/組織、前20位KEGG通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2進(jìn)行可視化,構(gòu)建“活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-器官/組織”網(wǎng)絡(luò)。

1.9 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)研究,選擇度值較高的關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)分別作為分子對(duì)接的配體和受體。配體的三維(3D)結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載。受體的3D結(jié)構(gòu)從RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.rcsb.org/)下載。配體和受體由MGLTools-1.5.6軟件修復(fù),并保存為pdbqt文件。AutoDockVina1.1.2軟件(http：//vina.scripps.edu/)用于測(cè)試關(guān)鍵活性成分和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間對(duì)接的親和力。使用PyMOL2.3對(duì)分子對(duì)接數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形可視化。

2 結(jié) 果

2.1 小柴胡湯活性成分及對(duì)應(yīng)藥物作用靶點(diǎn)

根據(jù)設(shè)定的OB和DL,得到214個(gè)符合條件的活性成分,刪除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分并去重后,最終得到165個(gè)活性成分,其中柴胡13個(gè),黃芩32個(gè),半夏12個(gè),人參17個(gè),甘草88個(gè),生姜4個(gè),大棗19個(gè),這些中藥的共同活性成分見表1。對(duì)應(yīng)的3 556個(gè)藥物靶點(diǎn),經(jīng)去重、格式轉(zhuǎn)換后,最終得到273個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。

表1 共同活性成分

2.2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將活性成分及對(duì)應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),共有464個(gè)節(jié)點(diǎn),3 448條邊。165個(gè)活性成分與273個(gè)藥物靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng),見圖1。

2.3 小柴胡湯治療GERD合并失眠的潛在作用靶點(diǎn)

經(jīng)整合GeneCards、DisgeNet、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的靶點(diǎn),最終獲得2 706個(gè)GERD相關(guān)和2 968個(gè)失眠相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。取藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)交集見圖2,三者共有94個(gè)靶點(diǎn)重疊,將其作為小柴胡湯治療GERD合并失眠的潛在作用靶點(diǎn),進(jìn)行后續(xù)分析。

2.4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

將小柴胡湯治療GERD合并失眠的潛在作用靶點(diǎn)及相對(duì)應(yīng)的活性成分導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2,構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)一共有254個(gè)節(jié)點(diǎn),1 421條邊。使用Cytoscape3.7.2的Network Analysis工具進(jìn)行拓?fù)浞治?按度值大小進(jìn)行形狀和位置排序,度值越大則形狀越大,且排列越靠圓圈的內(nèi)側(cè),見圖3。排名前10位的活性成分及其拓?fù)鋵傩砸姳?。

表2 前10活性成分的拓?fù)鋵傩?/p>

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因

將潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入SRTING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析,將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有83個(gè)節(jié)點(diǎn),976條邊,節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊表示靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián),邊的不同顏色代表不同的證據(jù)類型,邊的粗細(xì)代表不同的關(guān)聯(lián)分值,邊越粗則關(guān)聯(lián)分值越大,見圖4A。根據(jù)度值將靶點(diǎn)進(jìn)行圓圈排列,越靠近中心位置,靶點(diǎn)越重要。將大于中位數(shù)2倍的基因選為關(guān)鍵基因,進(jìn)行后續(xù)分析。關(guān)鍵基因見圖4B。

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO總條目為803,KEGG總條目為115。結(jié)果通過EXCEL篩選排序,選擇P≤0.01的條目,并按基因數(shù)量從大到小排序,使用R語(yǔ)言對(duì)排名前15位的GO條目和排名前20位的KEGG條目進(jìn)行可視化。GO的生物過程包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,見圖5A。KEGG富集通路包括癌癥途徑、AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等,見圖5B。

2.7 中藥成分-靶點(diǎn)-通路-器官/組織網(wǎng)絡(luò)

關(guān)鍵基因的BioGPS基因定位顯示,小柴胡湯治療GERD合并的關(guān)鍵基因主要表達(dá)于胰島、胸腺、松果體、胰腺等臟器,CD56+_NKCells、BDCA4+_DentriticCells、CD34+、CD4+_Tcells、CD14+_Monocytes等在與免疫相關(guān)的細(xì)胞上也有表達(dá)。將關(guān)鍵基因?qū)?yīng)的活性成分、器官/組織以及KEGG前20位通路導(dǎo)入Cytoscape3.7.2構(gòu)建中藥成分-通路-靶點(diǎn)-器官/組織網(wǎng)絡(luò),見圖6。

2.8 分子對(duì)接

根據(jù)PPI互作網(wǎng)絡(luò)篩選排名前5位的關(guān)鍵基因,即核心基因,分別為絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、白細(xì)胞介素-1B(IL-1B)、腫瘤蛋白53(TP53)。在藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)中尋找與上述基因相對(duì)應(yīng)的活性成分。核心基因與對(duì)應(yīng)活性成分的相關(guān)信息見表3。選擇度值最大,且與核心基因均有聯(lián)系的槲皮素分別與這些基因進(jìn)行分子對(duì)接。具體對(duì)接分?jǐn)?shù)見表4、見圖7?？梢暬肿訉?duì)接結(jié)果見圖8。

表3 排名前5位基因及其對(duì)應(yīng)成分

表4 分子對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)果表明,核心基因與槲皮素存在很好的結(jié)合作用且匹配度高(結(jié)合能均小于-5 kcal/mol)。槲皮素與核心靶點(diǎn)能夠形成氫鍵、疏水、范德華力等多種相互作用,這些相互作用可以促使蛋白與小分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物,表明槲皮素與靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

3 討 論

小柴胡湯為《傷寒論》經(jīng)典方劑,被譽(yù)為“和劑之祖”,為治療少陽(yáng)膽火內(nèi)郁、樞機(jī)不利的主方。方中柴胡質(zhì)輕而味苦,可疏解少陽(yáng)之郁;黃芩苦寒而重,能泄膽腑之熱;半夏、生姜共用,能和胃降逆;人參、甘草、大棗甘溫,能扶正祛邪。全方寒溫并用,攻補(bǔ)兼施,有調(diào)達(dá)上下、宣通內(nèi)外之效[7]。研究[8]表明,GERD臨床多見肝胃郁熱、肝胃不和證型,而“胃不和,則臥不安”。因此以肝胃不和為主要病機(jī)的GERD合并失眠可用小柴胡湯治之。然而,由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜,作用途徑廣泛,盡管小柴胡湯治療GERD合并失眠的臨床療效較好,其作用機(jī)制尚未得到系統(tǒng)性研究。近年來,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起使中藥復(fù)方的研究有了新的進(jìn)展,對(duì)闡明中藥配伍關(guān)系、發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵藥物成分和作用靶點(diǎn)及分析復(fù)方與疾病的分子關(guān)聯(lián)具有重要意義。因此,本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探討了小柴胡湯治療GERD合并失眠的作用機(jī)制。

本研究通過篩選、檢索,收集到165個(gè)小柴胡湯活性成分,其中作用于GERD和失眠的主要化學(xué)成分包括槲皮素、山奈酚、異鼠李素、黃芩素、β-谷甾醇等。研究[9-10]發(fā)現(xiàn),槲皮素和異鼠李素可通過調(diào)節(jié)局部微環(huán)境和抑制相關(guān)炎癥通路起到保護(hù)大鼠反流性食管炎的作用。此外,槲皮素和山奈酚還可能通過激活GABA(A)受體,改善GABA傳遞,以調(diào)節(jié)睡眠周期[11-12]。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻?小柴胡湯可能主要是通過AKT1、IL1B、IL-6、TNF、TP53等關(guān)鍵靶點(diǎn)治療GERD合并失眠。AKT1可調(diào)節(jié)包括代謝、增殖、血管生成在內(nèi)的許多過程。代謝壓力或能量失衡會(huì)影響AKT途徑的異常信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂,影響睡眠周期和睡眠持續(xù)時(shí)間[13];此外,AKT的異常信號(hào)也與食管癌的發(fā)生密切相關(guān),而GERD是食管腺癌的潛在危險(xiǎn)因素[14]。研究[15]報(bào)道,小柴胡湯可能通過抑制AKT1活性從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。IL-1B、IL-6、TNF是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),研究[16-18]表明,慢性炎癥廣泛存在于GERD和失眠患者中,對(duì)GERD和失眠的進(jìn)展至關(guān)重要,炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及STAT3在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。蘭斌等[21]研究表明,小柴胡湯可有效降低脂多糖(LPS)誘導(dǎo)發(fā)熱白兔血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和TNF-α水平,抑制炎癥反應(yīng)。TP53在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)中高頻率突變,提示GERD引起的炎癥可能是ESCC的致癌背景[22]。

GO和KEGG富集分析結(jié)果表明,小柴胡湯治療GERD合并失眠與多種生物過程和信號(hào)途徑相關(guān),其中包括癌癥途徑、AGE-RAGE、TNF和MAPK信號(hào)通路等。研究[23-24]提示,AGE-RAGE信號(hào)通路不僅在糖脂代謝、氧化應(yīng)激方面起重要作用,還可誘導(dǎo)激活MAPK、Jak-STAT和PI3K-Akt信號(hào)通路,促進(jìn)炎癥反應(yīng),進(jìn)而參與GERD和失眠的炎癥過程。

BioGPS基因定位顯示,小柴胡湯可能主要作用于松果體、胰島、胰腺、胸腺等臟器的關(guān)鍵基因,發(fā)揮治療GERD和失眠效應(yīng)。研究[25]報(bào)道,松果體褪黑激素(MT)的夜間釋放可調(diào)節(jié)外周循環(huán)細(xì)胞和腦脊液,使中樞和外周時(shí)鐘同步。針刺治療可提高大鼠松果體MT表達(dá)量,從而改善睡眠,調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。小柴胡湯是否也能通過調(diào)節(jié)MT的表達(dá),進(jìn)而改善睡眠值得進(jìn)一步研究。胰島和胰腺對(duì)代謝的調(diào)節(jié)至關(guān)重要,研究[26-27]發(fā)現(xiàn),大約16.5%的失眠伴有明顯的代謝變化,反映為胰島素分泌增加、糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加和鈣信號(hào)中斷。藥理學(xué)研究[28]表明,小柴胡湯的多種成分在治療代謝綜合征組分疾病中起到作用,對(duì)于肥胖、糖尿病、高血壓、高血脂以及胰島素抵抗等具有較好療效。胸腺功能與免疫緊密相關(guān)。研究[29]表明,GERD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與多種細(xì)胞因子、趨化因子和血小板激活因子的產(chǎn)生有關(guān),這些因子將免疫細(xì)胞募集到食管黏膜,激活和募集額外的免疫細(xì)胞,進(jìn)一步參與GERD的疾病進(jìn)展。研究[30]表明,小柴胡湯能夠抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),而對(duì)CD56+_NKCells、BDCA4+_DentriticCells、CD34+、CD4+_Tcells、CD14+_Monocytes等免疫細(xì)胞影響如何,值得進(jìn)一步探究。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)槲皮素能與核心靶點(diǎn)以多種相互作用形成較穩(wěn)定的復(fù)合物,其中與TNF的對(duì)接結(jié)果結(jié)合能最低,結(jié)合最穩(wěn)定。初步驗(yàn)證了小柴胡湯主要活性成分槲皮素與核心靶點(diǎn)的結(jié)合可能是其發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵,但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,小柴胡湯治療GERD合并失眠具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn),其可能通過槲皮素、山奈酚等主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、IL-1B、IL-6、TNF、TP53等結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng),與炎癥免疫反應(yīng)、糖脂代謝、晝夜節(jié)律等生物過程相關(guān)。本研究首次通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步揭示了小柴胡湯治療GERD合并失眠的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制,為后續(xù)開展實(shí)驗(yàn)研究,深入探索小柴胡湯的作用機(jī)制及拓展其臨床應(yīng)用提供了重要理論依據(jù)。