陳文雅,經(jīng) 緯,粟 平,王宏歌,俞意佳,陶月紅

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州,225001;2.揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院 兒科,江蘇 揚州,225001;3.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧 大連,116044)

兒童矮身材是指在相似生活環(huán)境下,兒童個體身高低于同種族、同性別和同年齡人群平均身高2個標(biāo)準(zhǔn)差(-2.00 SD),或低于第3百分位數(shù)(-1.88 SD)[1]。世界衛(wèi)生組織公布的發(fā)展中國家矮小癥發(fā)病率為32.5%[2],中國的抽樣調(diào)查結(jié)果[3]顯示兒童矮小癥的發(fā)病率約為3%,其中僅10%的矮小癥患者得到治療,嚴(yán)重影響患兒的身心健康。目前,重組人生長激素(rhGH)在臨床中應(yīng)用廣泛,已成為治療兒童矮身材的重要措施。腸道菌群是一個動態(tài)的微生物群體,其中厚壁菌及擬桿菌占90%以上,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對宿主的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌及代謝等有重要的影響[4-5]。生長激素能夠影響宿主腸道菌群的組成和豐度,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFAs)也可通過多種途徑影響生長的相關(guān)機(jī)制,例如生長激素/胰島素樣生長因子-1軸、甲狀腺素等[6],但關(guān)于生長激素影響矮身材兒童腸道菌群的研究目前鮮有報道。近年來,高通量測序技術(shù)快速發(fā)展,這為研究腸道菌群與生長的關(guān)系及其潛在途徑提供了可行性。本研究基于16S rDNA測序技術(shù)分析rhGH治療前后矮身材兒童腸道菌群的組成及變化,探討rhGH對腸道菌群的影響,以期為矮身材兒童的治療提供新思路和新方案。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年7月—2022年4月就診于江蘇省蘇北人民醫(yī)院的3～14歲且初次使用rhGH治療的矮身材兒童作為研究對象。收集患兒的臨床資料,包括性別、年齡、身高標(biāo)準(zhǔn)差積分(SDS)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1),并收集患兒的糞便樣本。所有患兒及其監(jiān)護(hù)人同意參與本研究并簽署知情同意書,本研究經(jīng)江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批(批文編號2021ky181)。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡3～14歲者;② 需使用生長激素治療的矮身材兒童[1](在正常生活水平下,身高低于同性別、同年齡、同種族兒童平均身高2個標(biāo)準(zhǔn)差,或低于第3百分位數(shù));③ 參與本研究前尚未使用生長激素治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 每階段樣本收集前1個月內(nèi)有益生菌、益生元或抗生素使用史和(或)有急性腹瀉病史和(或)其他感染性疾病者;② 在收集樣本的任意階段有明顯飲食結(jié)構(gòu)改變者;③ 合并嚴(yán)重先天性心臟病、消化道畸形、炎癥性腸病、肝腎功能損害、代謝性疾病、血液系統(tǒng)腫瘤者;④ 被研究者認(rèn)為不適合參加本研究者。

1.2 治療與分組方法

本研究最終納入32例矮身材兒童,根據(jù)所用rhGH劑型的不同分為長效組和短效組,每組16例。長效組使用聚乙二醇重組人生長激素(PEG-rhGH)注射液(商品名金賽增,長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字S20140001)皮下注射,劑量為每周0.2 mg/kg,睡前0.5～1.0 h皮下注射,連續(xù)治療6個月。短效組使用rhGH注射液(商品名賽增,長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字S20050025),劑量0.10～0.15 IU/(kg·d),睡前0.5～1.0 h皮下注射,連續(xù)治療6個月。治療前1周內(nèi)和治療3、6個月時,分別留取2組患兒的糞便標(biāo)本,檢測并記錄身高SDS和IGF-1水平。治療過程中,部分患兒因病使用抗生素或益生菌,故未收集相應(yīng)階段的糞便標(biāo)本及臨床資料。長效組治療前及治療后3、6個月收集例數(shù)分別為16、12、10例,短效組治療前及治療后3、6個月收集例數(shù)分別為16、16、13例,共收集83份糞便樣本。

1.3 16S rDNA測序方法

1.3.1 糞便樣本收集及處理：分別留取入組患兒治療前1周內(nèi)和治療3、6個月時的新鮮糞便樣本約2 g,置于無菌采集管或可室溫保存的一次性大便樣本采集處理器中,于2 h內(nèi)送至醫(yī)院并置于-80 ℃冰箱保存待測,運輸時需用干冰低溫保存。

1.3.2 16S rDNA高通量測序：將糞便樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。全程按照試劑盒說明和操作規(guī)范進(jìn)行操作。采用十六烷基三甲基溴化銨或十二烷基硫酸鈉方法提取糞便基因組DNA,通過引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGAC

TACNNGGGTATCTAAT -3′)對細(xì)菌的16S rDNA V3～V4高變區(qū)序列進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、產(chǎn)物純化和文庫構(gòu)建。通過NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行上機(jī)測序,對測序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾,得到有效數(shù)據(jù)。通過DADA2插件對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪,并過濾掉豐度<5的序列,獲得最終的擴(kuò)增序列變體(ASVs)。

1.3.3 生物信息學(xué)分析：采用QIIME2軟件的classify-sklearn算法對每個ASV使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)行物種注釋。根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣品特征表,獲得界、門、綱、目、科、屬、種水平物種豐度表,比較各組腸道菌群的優(yōu)勢物種及其相對豐度。α多樣性分析通過對各樣本進(jìn)行組間差異分析,可反映各組間微生物群落的豐富度、多樣性和均勻度。β多樣性分析通過分析坐標(biāo)軸中樣本間的距離直觀地對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較,可評估樣本間物種多樣性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

短效組男9例、女7例,平均年齡(9.16±2.56)歲;長效組男10例、女6例,平均年齡(8.99±2.39)歲。2組患兒年齡(t=0.344,P=0.561)、性別(χ2=0.130,P=0.719)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。短效組患兒不同時點間身高SDS、IGF-1比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.863、34.853,P<0.001);長效組患兒不同時點間身高SDS、IGF-1比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=270.536、27.234,P<0.001)。2組患兒治療3、6個月時的身高SDS、IGF-1均高于治療前,且治療6個月時的身高SDS、IGF-1均高于治療3個月時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);長效組治療6個月時身高SDS高于短效組,治療3個月時IGF-1低于短效組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 短效組和長效組患兒不同時點身高SDS、IGF-1水平比較

2.2 樣本數(shù)據(jù)分析

2.2.1 α多樣性指數(shù)組間差異性分析：Chao1指數(shù)反映物種豐富度,數(shù)值越大表示物種豐富度越高;Shannon指數(shù)反映群落多樣性,數(shù)值越大表示群落多樣性越高;Pielou e指數(shù)反映群落均勻度,數(shù)值越大表示物種越均勻。治療前及治療3、6個月時,長效組Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Pielou e指數(shù)均逐漸升高,但不同時點間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.308、0.982、0.818,P=0.737、0.385、0.450);治療前及治療3、6個月時,短效組Chao1指數(shù)、Pielou e指數(shù)均逐漸升高,Shannon指數(shù)先升高再降低,但不同時點間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.663、0.761、0.930,P=0.520、0.473、0.403)。長效組治療3個月時Chao1指數(shù)高于短效組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);長效組其他時點Chao1指數(shù)和各時點Shannon指數(shù)、Pielou e指數(shù)與短效組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的豐富度、多樣性、均勻度得到改善;PEG-rhGH在改善腸道菌群豐富度、多樣性、均勻度方面相較于短效rhGH更具持續(xù)性和穩(wěn)定性,PEG-rhGH短期內(nèi)(治療3個月)在改善腸道菌群豐富度方面顯著優(yōu)于短效rhGH。見表2、表3、表4。

表2 短效組和長效組不同時點Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)比較

表3 短效組和長效組不同時點Pielou e指數(shù)比較

表4 不同時點樣本的α多樣性指數(shù)比較

2.2.2 β多樣性分析：β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進(jìn)行比較分析,通過分析坐標(biāo)軸中樣本和樣本之間的距離直觀觀察各組樣本的菌群差異性,若各組樣本間的直線距離較近,表示各組間菌群差異較小,反之表示差異較大。置換多元方差分析(Per MANOVA)unweighted-Unifrac結(jié)果顯示,F=3.425,P=0.001,表明組間腸道菌群組成存在顯著差異;非度量多維尺度(NMDS)分析是將樣本中包含的物種信息以點的形式反映在多維空間上,不同樣本間的差異程度通過點與點之間的距離體現(xiàn),可反映樣本組間和組內(nèi)差異,見圖1。圖中每個點表示1個樣本,點與點之間的距離表示差異程度,同組同時點樣本使用同一種顏色表示,其中Stress值為0.17(<0.20)具有一定解釋意義,可反映各樣本間菌群結(jié)構(gòu)的差異程度。Per MANOVA結(jié)合NMDS分析結(jié)果表明,rhGH可在一定程度上調(diào)節(jié)矮身材兒童腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)。

2.2.3 腸道菌群物種組成：基于QIIME2軟件分別在門水平和屬水平選取前4位的優(yōu)勢物種并列出相關(guān)豐度占比,見表5、表6。在門水平上,2組不同時點樣本均以厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、變形菌門為主(占95%以上);在屬水平上,2組不同時點樣本均以布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬和擬桿菌屬為主。隨著rhGH使用時間的延長,擬桿菌門、擬桿菌屬的豐度和擬桿菌門與厚壁菌門比值(B/F)逐漸上升;長效組治療6個月時放線菌門豐度低于治療前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);治療6個月時,長效組雙歧桿菌豐度分別低于治療3個月時和短效組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的物種豐度雖然受到影響,但優(yōu)勢菌群的種類未發(fā)生改變。

表5 門水平優(yōu)勢菌群的豐度占比和B/F比較

表6 屬水平優(yōu)勢菌群的豐度占比 %

2.2.4 功能預(yù)測：PICRUSt2功能預(yù)測結(jié)果顯示,排名前10位的信號通路分別為卡爾文循環(huán)(CBB)、糖原降解Ⅰ、糖原生物合成Ⅰ(來自ADP-D-葡萄糖)、L-異亮氨酸生物合成Ⅰ(來自蘇氨酸)、磷酸戊糖途徑(非氧化分支)、L-異亮氨酸生物合成Ⅱ、蔗糖降解Ⅲ(蔗糖轉(zhuǎn)化酶)、淀粉降解Ⅴ、丙酮酸發(fā)酵制異丁醇、L-纈氨酸生物合成,表明腸道菌群主要參與碳水化合物代謝和氨基酸代謝等途徑。

2.2.5 優(yōu)勢菌群與IGF-1、身高SDS的相關(guān)性分析：根據(jù)ASVs注釋結(jié)果和各樣本特征表,獲得各樣本在門水平和屬水平的優(yōu)勢物種及其相對豐度,并與對應(yīng)的IGF-1、身高SDS進(jìn)行Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。在門水平上,長效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌門(r=0.706,P=0.022)、B/F(r=0.794,P=0.006)呈正相關(guān),身高SDS與擬桿菌門(r=0.632,P=0.048)、B/F(r=0.626,P=0.047)呈正相關(guān);短效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌門(r=0.637,P=0.019)、B/F(r=0.736,P=0.004)呈正相關(guān),與厚壁菌門(r=-0.581,P=0.037)呈負(fù)相關(guān)。在屬水平上,長效組治療6個月時擬桿菌屬與IGF-1(r=0.640,P=0.046)、身高SDS(r=0.675,P=0.032)呈正相關(guān);短效組治療6個月時IGF-1與擬桿菌屬(r=0.577,P=0.039)呈正相關(guān);短效組治療3個月時雙歧桿菌屬與IGF-1(r=0.562,P=0.024)、身高SDS(r=0.556,P=0.049)呈正相關(guān)。rhGH應(yīng)用于矮身材兒童能實現(xiàn)促生長作用并提高體內(nèi)IGF-1水平,且2組患兒部分時點的腸道優(yōu)勢菌群與IGF-1、身高SDS呈正相關(guān),提示rhGH與腸道菌群可能具有協(xié)同促生長作用。

3 討 論

2000年世界衛(wèi)生組織通過了一項關(guān)于孕產(chǎn)婦、嬰幼兒營養(yǎng)問題的決議并商定了全球目標(biāo),其中主要目標(biāo)是到2025年將5歲以下發(fā)育不良兒童的數(shù)量減少40%,但按照目前的進(jìn)展速度,2025年仍會有1.27億名發(fā)育不良兒童,數(shù)量僅減少26%[2]。中國目前仍有很多矮身材兒童未得到治療,而rhGH治療是一個長期、動態(tài)的過程,療程應(yīng)視患兒具體情況決定,一般治療時間不宜短于1年[1]。動物試驗[7]證實,生長激素對腸道菌群存在一定影響,例如在生長激素基因中斷(GH-/-)小鼠和生長激素長期增加的牛生長激素轉(zhuǎn)基因(bGH)小鼠的模型中,6月齡的GH-/-小鼠和bGH小鼠的微生物圖譜與同窩對照小鼠相比均發(fā)生改變。本研究對使用不同劑型rhGH的矮身材兒童不同時期腸道菌群進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn),隨著rhGH使用時間的延長,患兒腸道菌群的豐富度、多樣性、均勻度和結(jié)構(gòu)組成改善,且相較于短效的rhGH,PEG-rhGH在改善患兒腸道菌群豐富度、多樣性和均勻度方面更具有穩(wěn)定性,短期內(nèi)改善腸道菌群豐富度的優(yōu)勢更明顯。

腸道菌群數(shù)量繁多且組成復(fù)雜,了解發(fā)揮主要作用的菌群至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示,2組患兒不同時點的門水平優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門,屬水平優(yōu)勢菌群均為布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和糞桿菌屬。厚壁菌門和擬桿菌門可以產(chǎn)生糖苷水解酶,促進(jìn)食物發(fā)酵和分解,將其轉(zhuǎn)化成SCFAs,從而促進(jìn)能量吸收[8]。變形菌門是具有潛在致病性的常見菌,能促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。放線菌門可在人類、動物和植物中引發(fā)各種感染,其中最主要的致病放線菌是結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌[10]。擬桿菌屬作為人體腸道重要的益生菌,可促進(jìn)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和丙酸,參與多糖和膽固醇代謝,影響體內(nèi)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及能量代謝,為人體提供營養(yǎng)并維持腸道功能。本研究發(fā)現(xiàn),長效組和短效組治療過程中擬桿菌門、擬桿菌屬豐度及B/F均逐漸上升,并與IGF-1、身高SDS呈正相關(guān),其余菌門和菌屬豐度呈波動性變化,治療6個月時2組厚壁菌門、放線菌門的豐度和長效組變形菌門的豐度均較治療前降低。由此提示,持續(xù)使用rhGH一方面能夠提高對人體有益的擬桿菌的豐度及B/F,另一方面能夠降低有害菌的豐度。研究[6]表明,腸道微生物對生長激素的代謝途徑(或影響)不同等,是腸道菌群中有益菌群和致病菌群豐度變化不同的原因,進(jìn)一步證實生長激素與腸道菌群之間存在相互作用。

腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主的生長,例如嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和部分大腸桿菌已被證實可以促進(jìn)生長[6]。腸道菌群及其主要代謝產(chǎn)物SCFAs可通過影響生長激素、IGF-1、甲狀腺激素、性激素[6,11-12]等多種途徑影響宿主的生長發(fā)育。研究[6]指出,腸道菌群的定植可通過SCFAs增加血清IGF-1表達(dá)。SCFAs大部分由腸道菌群分解碳水化合物產(chǎn)生,少部分來自腸道菌群對蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝,且厚壁菌門和擬桿菌門是產(chǎn)生SCFAs的優(yōu)勢菌[13]。本研究中,功能預(yù)測結(jié)果顯示腸道菌群主要參與碳水化合物和氨基酸代謝等途徑,相關(guān)分析結(jié)果顯示擬桿菌屬、B/F、雙歧桿菌屬與IGF-1和(或)身高SDS具有相關(guān)性,提示腸道菌群促生長的潛在途徑可能與SCFAs相關(guān)。

綜上所述,rhGH能夠改善矮身材兒童腸道菌群的豐富度、多樣性和均勻度,提高腸道內(nèi)部分有益菌的豐度,并降低有害菌的豐度,且短期內(nèi)PEG-rhGH在改善腸道菌群豐富度方面相較于短效rhGH具有一定優(yōu)勢。大量動物實驗已證實腸道菌群與生長激素存在相互作用,本研究亦證實外源性rhGH對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用,但腸道菌群對人體生長激素的影響及相關(guān)途徑還需進(jìn)一步研究。本研究納入樣本數(shù)量較小,后續(xù)研究還應(yīng)擴(kuò)大樣本量、延長樣本收集周期及完善代謝組學(xué)檢測,以探尋與生長相關(guān)的特定菌群或介質(zhì),通過補充益生菌或糞菌移植等方式實現(xiàn)協(xié)同rhGH促生長的目標(biāo),在為臨床診治提供新方案的同時減輕矮身材兒童家庭和社會的壓力。