張 鑫,汪劉華,苗永昌,王道榮

(1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州,225003;2.連云港市第二人民醫(yī)院 胃腸外科,江蘇 連云港,222002;3.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院 胃腸外科,江蘇 揚州,225009;4.揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州,225003;5.揚州市消化病/代謝病基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點實驗室,江蘇 揚州,225009)

結(jié)腸癌是嚴重威脅人類健康的惡性消化道腫瘤之一,其患病率與致死率呈逐年上升趨勢。腫瘤具有高度的侵襲性及轉(zhuǎn)移性,易導(dǎo)致治療效果降低及患者預(yù)后不良,因而早期診斷及治療有助于改善患者預(yù)后[1]。結(jié)腸癌發(fā)病率位居中國癌癥發(fā)病率第2位,且病死率較高,結(jié)腸癌患者5年生存率約為50%,而晚期患者的5年生存率則低于10%[2]。適配器相關(guān)蛋白復(fù)合物 1亞基Mu2(AP1M2)在多種真核生物中具有同源性,屬于黏附蛋白有關(guān)的銜接蛋白復(fù)合物 1,其在細胞內(nèi)皮中的抗高爾基網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)分選中發(fā)揮作用,特征是介導(dǎo)黏附蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)移中的募集和跨膜物質(zhì)信號的識別。AP1M2在系統(tǒng)發(fā)育上是保守的,并在檢測到的所有細胞類型中表達[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)AP1M2在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、直腸癌、結(jié)腸癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中高表達,且預(yù)后不良。本研究探討結(jié)腸癌中AP1M2的表達及臨床意義,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

采用基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析AP1M2在惡性腫瘤中的表達情況,其中結(jié)腸癌組共納入624例,分別為結(jié)腸癌組織275例和癌旁正常組織349例。在線分析AP1M2在結(jié)腸癌患者中的表達水平,并且分析AP1M2相關(guān)基因,進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)功能富集分析,運用BioGRID數(shù)據(jù)庫探索AP1M2蛋白互作情況。

1.2 病例資料

選取2017年1—12月連云港市第二人民醫(yī)院收治的行根治性手術(shù)治療的97例結(jié)腸惡性腫瘤患者的癌組織及癌旁組織。納入標準：① 診斷明確的結(jié)腸癌患者;② 患者均具有手術(shù)指征并接受手術(shù);③ 患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤輔助治療。排除標準：① 其他結(jié)腸疾病患者;② 存在結(jié)腸癌以外其他腫瘤的患者;③ 患有精神疾病或因其他原因無法配合本研究者。收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分級、轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后5年復(fù)發(fā)情況等臨床病理資料。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準進行(批件號：2016-049),全部受試對象知情同意。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

將收集的結(jié)腸癌組織及癌旁正常組織采用10%福爾馬林固定,脫水,石蠟包埋,組織切成4 μm厚并制成切片,純二甲苯脫蠟3次,每次15 min;不同濃度酒精水化,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次;浸入抗原修復(fù)液行抗原修復(fù),PBS洗滌3次;滴加3%過氧乙酸阻斷組織內(nèi)源性過氧化酶活性10 min,浸入PBS漂洗3次;滴加羊血清封閉液,室溫孵育30 min;甩去玻片血清,滴加AP1M2多克隆抗體,置于4 ℃冰箱過夜;次日,使用PBS漂洗3次,滴加即用型二抗,室溫放置30 min,PBS漂洗3次;滴加即用型SP溶液,室溫孵育30 min,PBS漂洗3次;結(jié)束后,DAB顯色1～5 min,蘇木素復(fù)染120 s,自來水沖洗10～20 min,晾干,中性塑膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

細胞染色強度積分：① 0分表示陰性,即細胞不著色;② 1分表示弱陽性,即細胞著淺黃色;③ 2分表示中等陽性,即細胞著中黃色或著棕色且無背景著色,或細胞著深棕色,但有淺棕色背景;④ 3分表示強陽性,即細胞著深棕色或棕褐色且無背景著色。

陽性細胞表達數(shù)積分：① 0分表示陽性細胞表達數(shù)為0%;② 1分表示陽性細胞表達數(shù)為>0%～25%;③ 2分表示陽性細胞表達數(shù)為>25%～50%;④ 3分表示陽性細胞表達數(shù)為>50%～75%;⑤ 4分表示陽性細胞表達數(shù)>75%。

依據(jù)細胞染色強度積分與陽性細胞表達數(shù)積分的相加結(jié)果來判斷切片染色的陽性等級：0分為陰性,1～3分為弱陽性(+),4～5分為陽性(),6～7分為強陽性()。高表達定義為陽性與強陽性之和,低表達定義為陰性與弱陽性之和。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad prism 8.0版軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料間的比較采用t檢驗,計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗,生存分析采用Kaplan-Meier法并行Log-rank檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用R語言軟件3.6運行“ggplot2”包以進行生物信息學(xué)可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析AP1M2表達情況

通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫,提取結(jié)腸癌相關(guān)數(shù)據(jù),分析275例結(jié)腸癌組織和349例癌旁正常組織中的AP1M2表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AP1M2在結(jié)腸癌組織中的表達高于癌旁正常組織中,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 AP1M2在結(jié)腸癌組織及血清中的表達情況

免疫組化染色發(fā)現(xiàn),AP1M2免疫組化陽性著色主要位于細胞質(zhì),高表達多見于結(jié)腸癌組織,而低表達多見于癌旁組織。免疫組化分析發(fā)現(xiàn),AP1M2在結(jié)腸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織,在97對標本中,結(jié)腸癌組織AP1M2高表達73例,癌旁組織AP1M2高表達43例,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。見表1、見圖2。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌患者血清中AP1M2表達高于非腫瘤者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。見圖3。

表1 AP1M2在97例結(jié)腸癌中的表達情況

2.3 AP1M2 表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

依據(jù)免疫組化評分計算結(jié)果,將97例患者分為AP1M2高表達組與低表達組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、性別、腫瘤分化程度、M分期(遠處轉(zhuǎn)移)、神經(jīng)脈管侵犯情況、癌胚抗原(CEA)水平與結(jié)腸癌組織中AP1M2表達無相關(guān)性(P>0.05),而腫瘤直徑>5 cm、N1～N2分期(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、T分期的T3～T4期、術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者AP1M2高表達比率分別高于腫瘤直徑≤5 cm、N0分期(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、T分期的T1～T2期、術(shù)后5年無復(fù)發(fā)患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 AP1M2表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 AP1M2表達水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

術(shù)后隨訪5年,24例AP1M2低表達患者術(shù)后5年死亡5例,而73例AP1M2高表達患者術(shù)后5年死亡24例,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005),見圖4。Cox分析顯示,AP1M2是結(jié)腸癌患者術(shù)后死亡的危險因素,見表3。

表3 結(jié)腸癌術(shù)后5年生存影響因素的多因素分析

2.5 AP1M2在結(jié)腸癌中的生物功能分析預(yù)測

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中,分析與AP1M2相關(guān)程度最高的前100個基因,通過DAVID網(wǎng)站進行KEGG富集分析,得出AP1M2相關(guān)基因主要富集在代謝通路方面,見圖5;BioGRID數(shù)據(jù)庫探索AP1M2蛋白互作情況見圖6。

3 討 論

結(jié)腸癌是嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤,其發(fā)病主要受飲食結(jié)構(gòu)、肥胖程度以及生活方式等因素的影響[6]。結(jié)腸癌病情進展迅速,若未得到及時診治,則會由原位癌進展為浸潤性癌,降低患者預(yù)后生存率,因此尋找早期生物學(xué)標志物對改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

現(xiàn)有研究[7-8]表明,基因在一些生物過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能,廣泛參與細胞增殖、凋亡、染色質(zhì)修飾和轉(zhuǎn)錄后加工等過程。多種疾病中發(fā)現(xiàn)基因表達存在異常,能夠影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程,這預(yù)示其可作為腫瘤早期檢測和預(yù)后的標志物之一,有助于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后判斷[9-10]。既往研究[11-13]表明,結(jié)腸癌中有多種基因存在表達異常,并可調(diào)控結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等行為。AVRUCH J等[14]研究發(fā)現(xiàn),Yes相關(guān)蛋白(YAP)在結(jié)腸癌組織中高表達,能夠促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,其作為癌基因在結(jié)腸癌中發(fā)揮作用。RASOOL M等[15]研究發(fā)現(xiàn),沙特阿拉伯的結(jié)腸癌患者中,白細胞介素8(CXCL8)在結(jié)腸癌組織中表達水平較高,主要與腫瘤分期、腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤深度等臨床病理特征相關(guān),在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中具有關(guān)鍵作用,也可以作為生物標志物基因,在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。

AP1M2屬于黏附蛋白相關(guān)的銜接蛋白復(fù)合物1,在系統(tǒng)發(fā)育上呈保守性,在幾乎所有的真核生物中都能被檢測到,從最低等的酵母菌到高等的哺乳動物均有表達,且呈高度同源性,其特征功能在于介導(dǎo)黏附蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)移中的募集和跨膜物質(zhì)信號的識別。AP1M2在腫瘤中的研究很少,且均為生物信息學(xué)分析。YI Y X等[4]通過泛癌分析發(fā)現(xiàn),AP1M2在膀胱癌、乳腺癌、肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中呈高表達,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且與腫瘤免疫浸潤相關(guān),高表達提示預(yù)后不良;但該研究僅通過公共數(shù)據(jù)庫進行分析,并無進一步的臨床研究和細胞或動物實驗。WU H W等[16]通過分析基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)中GSE12090、GSE19982、GSE8271這3組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),AP1M2在腎嫌色細胞癌中高表達,是鑒別腎嫌色細胞癌與腎嗜酸細胞瘤的重要生物標志物;但該研究也僅僅是生物信息學(xué)分析,未進一步通過免疫組化或其他方法驗證。LIU S等[5]通過系統(tǒng)分析癌癥基因組圖譜-胰腺癌(TCGA-PAAD)數(shù)據(jù)庫發(fā)掘出AP1M2在胰腺癌中呈高表達,通過生存分析提示預(yù)后不良。COLAS E等[17]僅僅通過聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)AP1M2在子宮內(nèi)膜癌中高表達,但并未進行進一步研究。

本研究通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)AP1M2在結(jié)腸癌中高表達,通過收集97例結(jié)腸癌和癌旁組織進行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中有73例AP1M2高表達,而在癌旁組織中僅有43例AP1M2呈高表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。根據(jù)免疫組化評分結(jié)果,將97例患者分為AP1M2高表達組和低表達組,結(jié)果顯示在高表達組與低表達組間,不同年齡、性別及腫瘤分化程度患者癌組織中AP1M2表達比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而腫瘤直徑>5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1～N2分期)、T分期的T3～T4期、術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者AP1M2高表達比率分別高于腫瘤直徑≤5 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0分期)、T分期的T1～T2期、術(shù)后5年無復(fù)發(fā)患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組患者血清中AP1M2表達高于非腫瘤者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02),說明AP1M2可以在血清中檢出,與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。術(shù)后隨訪5年,24例AP1M2低表達患者術(shù)后5年死亡5例,而73例AP1M2高表達患者術(shù)后5年死亡24例,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005),可見AP1M2高表達患者預(yù)后差,Cox分析也顯示AP1M2是結(jié)腸癌患者術(shù)后死亡的危險因素(P<0.05)。KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn),AP1M2的生物學(xué)主要體現(xiàn)在影響代謝方面,其中與癌癥糖代謝相關(guān)通路值得進一步研究;在蛋白互作水平方面,也找到了與AP1M2存在相互作用的蛋白,有待進一步的探索。

綜上所述,AP1M2表達水平在結(jié)腸癌組織中及血清中上調(diào),這與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān),與結(jié)腸癌患者預(yù)后也相關(guān)。AP1M2可作為結(jié)腸癌預(yù)后的潛在預(yù)測指標。