姜 哲,韓佳慧,吳 婷,萬 盧,童 強(qiáng)

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)十堰市太和醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,湖北 十堰,442000;2.湖北省十堰市太和醫(yī)院 腫瘤科,湖北 十堰,442000;3.湖北省武漢亞洲心臟病醫(yī)院 心功能科,湖北 武漢,430000;4.湖北省十堰市太和醫(yī)院 消化內(nèi)科,湖北 十堰,442000)

食管癌是中國常見的惡性腫瘤,早期診治有助于改善患者預(yù)后,但食管癌早期癥狀較為隱匿,導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已處于中晚期。分子靶向治療、基因治療等方法已被用于腫瘤治療中,食管癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確,探究食管癌的發(fā)病機(jī)制有助于尋找靶向治療的潛在靶點(diǎn)[1]。環(huán)狀RNA(circRNA)屬于內(nèi)源性非編碼RNA分子,因不具有5′端帽子與3′尾巴,不易被外切核酸酶降解。研究[2-4]顯示,circRNA在食管癌中表達(dá)異常,并對(duì)細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程發(fā)揮調(diào)控作用。環(huán)狀RNA_0005273(circ_0005273)在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高,且與腫瘤生長及轉(zhuǎn)移相關(guān),還可促進(jìn)細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[5]。研究[6]表明,circ_0005273與微小RNA-1200(miR-1200)存在結(jié)合位點(diǎn),且miR-1200表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-1200與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)存在結(jié)合位點(diǎn),而食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲與STAT3表達(dá)上調(diào)有關(guān)[7]。circ_0005273/miR-1200/STAT3在食管癌中的作用機(jī)制尚不明確,本研究探討circ_0005273對(duì)miR-1200/STAT3表達(dá)的調(diào)控作用及其對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以期為食管癌發(fā)病機(jī)制的研究提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取2019年3月—2020年4月在湖北省十堰市太和醫(yī)院行手術(shù)切除治療的51例食管癌患者作為研究對(duì)象,男31例、女20例,年齡45～66歲,平均(55.24±6.46)歲,取患者癌組織和癌旁組織標(biāo)本作為研究樣本。所有研究對(duì)象經(jīng)病理診斷確診食管癌,未合并其他惡性腫瘤及自身免疫性疾病,并在明確各項(xiàng)操作步驟與注意事項(xiàng)的情況下自愿簽署知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)十堰市太和醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

人食管癌細(xì)胞EC109購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;Lipofectamine 3000和Trizol試劑購自美國invitrogen公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)相關(guān)試劑盒購自天根生化有限公司;si-circ_0005273、miR-1200 mimics、anti-miR-1200及其相應(yīng)的陰性對(duì)照(si-NC、miR-NC)由銳博生物合成;噻唑藍(lán)(MTT)試劑和細(xì)胞凋亡遷移相關(guān)檢測(cè)試劑盒分別購自碧云天生物技術(shù)有限公司、北京索萊寶有限公司。LightCycler480型熒光定量PCR儀購自上海Roche公司;FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組：將EC109細(xì)胞接種于6孔板(1×104個(gè)/孔),按照Lipofectamine 3000說明書將si-NC、si-circ_0005273、miR-NC、miR-1200 mimics、si-circ_0005273與anti-miR-1200轉(zhuǎn)染至細(xì)胞,分別設(shè)為si-參照組、si-circ組、miR-參照組、miR-1200組、si-circ+anti組,轉(zhuǎn)染6 h后丟棄原有培養(yǎng)基,應(yīng)用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。另設(shè)對(duì)照組,該組EC109細(xì)胞按照正常條件培養(yǎng)。si-NC正向引物序列為UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,反向引物序列為ACGUGACACGUUCGGAGAATT;si-circ_0005273序列為5′-GAAAGATTTCTGCCCAGCAGA-3′;miR-NC序列為5′-GGUUCGUACGUACACUGUUCA-3′;miR-1200序列為5′-CUCCUGAGCCAUUCUGAGCCUC-3′;anti-miR-1200序列為5′-GAGGCUCAGAAUGGCUCAGGAG-3′。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：分別取適量組織樣本和對(duì)數(shù)生長期的EC109細(xì)胞,均用Trizol試劑提取總RNA并進(jìn)行純度檢測(cè),取適量總RNA配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液并反應(yīng)合成cDNA。完成后將cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),即95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。使用LightCycler480型熒光定量PCR儀分析相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。circ_0005273正向引物序列為5′-AAGATTTCTGCCCAGCAGACC-3′,反向引物序列為5′-ACCAGGGTAGCCAGAAACCT-3′;STAT3正向引物序列為5′-TCTGTGTGACACCAACGACC-3′,反向引物序列為5′-TCCTCACATGGGGGAGGTAG-3′;GAPDH正向引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反向引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′;miR-1200正向引物序列為5′-GTATGAGCTCCTGAGCCATTCTGA-3′,反向引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3′;U6正向引物序列為5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′,反向引物序列為5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′。以GAPDH和U6為內(nèi)參基因,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將EC109細(xì)胞接種于96孔板,每孔加入20 μL MTT試劑反應(yīng)4 h和150 μL二甲亞砜(DMSO)反應(yīng)5 min。將檢測(cè)波長設(shè)為490 nm,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成數(shù)：將EC109細(xì)胞接種于6孔板(每孔1×103個(gè)),培養(yǎng)2周(每3 d更換1次培養(yǎng)液),加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,依次分別加入甲醇(500 μL)與1%結(jié)晶紫染色液(400 μL),采用蒸餾水洗滌后晾干拍照,觀察集落形成數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將EC109細(xì)胞用PBS洗滌并離心,收集細(xì)胞沉淀并用緩沖液重懸。將細(xì)胞懸液與Annexin V-FITC和PI染液孵育,使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：將EC109細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸,然后接種至Transwell小室的上室,并向下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞用甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色,30 min后使用流水洗滌并晾干,于顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)目的基因的靶向關(guān)系：Circular RNA Interactome、Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,circ_0005273與miR-1200之間、miR-1200與STAT3之間分別存在結(jié)合位點(diǎn)。由上海鈺博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成含有circ_0005273與miR-1200結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(WT-circ_0005273)以及含有結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(MUT-circ_0005273),含有miR-1200與STAT3結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(WT-STAT3)以及含有結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(MUT-STAT3)。將EC109細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)接種于6孔板,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-circ_0005273、MUT-circ_0005273、WT-STAT3、MUT-STAT3分別與miR-1200 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染至EC109細(xì)胞,轉(zhuǎn)染完成后將其放置于培養(yǎng)箱內(nèi),24 h后使用熒光素對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)量：采用RIPA裂解液提取總蛋白,然后用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂奶粉封閉后,膜與STAT3一抗(1∶1 000)或內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)孵育過夜,然后與二抗(1∶5 000)反應(yīng)2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯示蛋白條帶,并應(yīng)用Gel-Pro32軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 circ_0005273、miR-1200、STAT3在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

食管癌組織中circ_0005273表達(dá)量、STAT3蛋白表達(dá)量高于癌旁組織,miR-1200表達(dá)量低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

2.2 干擾circ_0005273對(duì)EC109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

si-circ組miR-1200表達(dá)量、細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均高于對(duì)照組、si-參照組,circ_0005273表達(dá)量、STAT3蛋白表達(dá)量、集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均低于或少于對(duì)照組、si-參照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表1。

表1 干擾circ_0005273對(duì)miR-1200、STAT3表達(dá)和細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響

2.3 過表達(dá)miR-1200對(duì)EC109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

miR-1200組STAT3蛋白表達(dá)量、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均低于或少于對(duì)照組、miR-參照組,miR-1200表達(dá)量、細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均高于對(duì)照組、miR-參照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3、表2。

表2 過表達(dá)miR-1200對(duì)STAT3表達(dá)和EC109細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響

2.4 circ_0005273與miR-1200的靶向關(guān)系分析

circular RNA Interactome預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,circ_0005273與miR-1200存在結(jié)合位點(diǎn),見圖4。miR-1200組WT-circ_0005273低于miR-參照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),2組MUT-circ_0005273比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明miR-1200過表達(dá)可降低WT-circ_0005273載體的熒光素酶活性,但對(duì)MUT-circ_0005273載體的熒光素酶活性無影響,見表3。

表3 circ_0005273與miR-1200靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

2.5 miR-1200與STAT3的靶向關(guān)系分析

Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-1200與STAT3存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5。miR-1200組WT-STAT3低于miR-參照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),2組MUT-STAT3比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明miR-1200過表達(dá)可降低WT-STAT3載體的熒光素酶活性,但對(duì)MUT-STAT3載體的熒光素酶活性無影響,見表4。

表4 miR-1200與STAT3靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

2.6 抑制miR-1200對(duì)干擾circ_0005273后的EC109細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響

si-circ組STAT3蛋白表達(dá)、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)低于或少于對(duì)照組,細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);si-circ+anti組STAT3蛋白表達(dá)、集落形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)高于或多于si-circ組,細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率低于si-circ組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6、表5。由此提示,抑制miR-1200可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0005273對(duì)EC109細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用及凋亡誘導(dǎo)作用。

表5 抑制miR-1200對(duì)干擾circ_0005273后的EC109細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響

3 討 論

circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,近年來多種新型circRNA如circ_0003340、circRNA PRKCI、circ_0006168、circ_0004370被證實(shí)在食管癌中異常表達(dá),參與食管癌病理過程并發(fā)揮重要作用,或可作為食管癌的潛在治療靶點(diǎn)[8-11]。胰腺癌組織中的circ_0005273呈高表達(dá),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后變化均與該指標(biāo)表達(dá)異常升高有關(guān),抑制circ_0005273表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖與遷移[12]。circ_0005273在乳腺癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與遷移,進(jìn)而抑制乳腺癌進(jìn)展[13]。乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中circ_0005273表達(dá)上調(diào),敲除circ_0005273可抑制細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲[14]。但食管癌中circ_0005273表達(dá)變化的具體機(jī)制及作用目前尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn),食管癌組織中circ_0005273表達(dá)量高于癌旁組織,而干擾circ_0005273表達(dá)可升高食管癌細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率,使集落形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少。

目前,circ_0005273靶向調(diào)控的微小RNA(miRNA)種類尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),在干擾circ_0005273后,食管癌細(xì)胞中miR-1200呈高表達(dá)變化趨勢(shì),進(jìn)一步證實(shí)circ_0005273可靶向結(jié)合miR-1200。由此提示,circ_0005273在食管癌病理過程中有參與并通過靶向結(jié)合miR-1200發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究[15-16]顯示,miR-1200在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)則可抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,miR-1200在食管癌組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-1200可抑制食管癌細(xì)胞增殖、克隆和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明miR-1200在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑癌基因作用。本研究還發(fā)現(xiàn),上調(diào)食管癌細(xì)胞中miR-1200表達(dá)可抑制STAT3蛋白表達(dá),而干擾circ_0005273表達(dá)也可抑制STAT3蛋白表達(dá)。食管癌組織中STAT3蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁組織,進(jìn)一步證實(shí)STAT3是miR-1200的靶基因,提示circ_0005273可通過靶向結(jié)合miR-1200而正向調(diào)控STAT3的表達(dá)。STAT3屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs)家族成員之一,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而發(fā)揮癌基因作用[17-18]。研究[19]顯示,抑制STAT3表達(dá)可促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖及移植瘤生長。本研究結(jié)果顯示,抑制miR-1200可以逆轉(zhuǎn)circ_0005273敲低對(duì)食管癌細(xì)胞生長、克隆形成和遷移的抑制作用,提示circ_0005273可靶向miR-1200/STAT3軸,進(jìn)而促進(jìn)食管癌的惡性進(jìn)程。

綜上所述,食管癌組織中circ_0005273和STAT3呈高表達(dá),miR-1200呈低表達(dá),干擾circ_0005273表達(dá)可通過上調(diào)miR-1200表達(dá)和下調(diào)STAT3表達(dá)而發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移的作用,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。circ_0005273在食管癌中發(fā)揮癌基因作用,或可作為食管癌的潛在治療靶點(diǎn)。