湯小龍,陳旭峰,鄭 揚(yáng),楊勝蘭

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院 消化內(nèi)科,江蘇 無錫,240001)

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤,部分患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后不佳[1],因此探索胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,多種miRNA已被發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中差異表達(dá),參與胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程[2-5]。微小RNA-1291(miR-1291)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[6]。CAI Q等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-1291在前列腺癌組織中低表達(dá),上調(diào)miR-1291可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移,但miR-1291與胃癌的關(guān)系尚不明確。BMP激活素膜結(jié)合抑制因子(BAMBI)基因編碼的蛋白位于細(xì)胞膜,通過調(diào)控多種信號(hào)通路參與腫瘤進(jìn)展過程,例如沉默BAMBI基因的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力會(huì)增強(qiáng)[8],但也有研究[9]表明沉默BAMBI可抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力。BAMBI已被證實(shí)與多種miRNA存在靶向關(guān)系,但miR-1291與BAMBI的靶向關(guān)系尚不明確。本研究基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-1291對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的調(diào)控作用及其與BAMBI的靶向關(guān)系,以期為胃癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 基于公共數(shù)據(jù)庫分析miR-1291在胃癌組織、正常胃組織中的表達(dá)

通過GEO數(shù)據(jù)庫在線工具GEO2R分析GSE54129數(shù)據(jù)集中正常胃黏膜組織標(biāo)本與胃癌組織標(biāo)本的miR-1291表達(dá)水平。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

人胃癌細(xì)胞SGC-7901(上海酶研生物科技有限公司),人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1(蘇州海星生物有限公司);黑膠蟲清除基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPMI)1640(北京諾博萊德科技有限公司),Lipofectamine 2000試劑(上海復(fù)申生物科技有限公司),miR-1291 mimic質(zhì)粒(過表達(dá)miR-1291)、miR-NC質(zhì)粒、miR-1291 inhibitor質(zhì)粒(抑制劑)、miR inhibitor空質(zhì)粒、BAMBI mimic質(zhì)粒(過表達(dá)BAMBI)、Vector質(zhì)粒(過表達(dá)空載)、sh-BAMBI質(zhì)粒(敲低BAMBI)、sh-NC質(zhì)粒(敲低空白對(duì)照)、野生型(WT)-BAMBI和突變型(MUT)-BAMBI質(zhì)粒、引物(沈陽萬類生物有限公司),TRIzol試劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);miRNA逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(日本TARKARA生物有限公司),兔抗人BAMBI、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和SMAD同源物4(SMAD4)一抗、鼠抗兔二抗(沈陽萬類生物有限公司),CCK-8試劑盒(天津賽東南生物有限公司),Transwell小室(中喬新舟生物有限公司),Matrigel基質(zhì)膠(MatriClone公司),雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(MCE公司);ABI Q5型號(hào)PCR儀(美國ABI公司),酶標(biāo)儀(鄭州基波新科技有限公司)、光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

使用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞和GES-1細(xì)胞,培養(yǎng)條件為5%CO2,37 ℃。SGC-7901細(xì)胞系是胃癌細(xì)胞系,未污染,1個(gè)月檢測(cè)1次明確無支原體感染。將miR-1291 mimic質(zhì)粒、miR-NC質(zhì)粒、miR-1291 inhibitor質(zhì)粒、miR inhibitor質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至取傳3代的SGC-7901細(xì)胞,依次設(shè)為miR-1291組、miR-NC組、miR-1291 inhibitor組、miR inhibitor組。將BAMBI mimic質(zhì)粒、Vector質(zhì)粒、sh-BAMBI質(zhì)粒、sh-NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,依次設(shè)為BAMBI組、Vector組、sh-BAMBI組、sh-NC組。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將SGC-7901細(xì)胞接種至96孔板中(2 000個(gè)/孔),分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃孵育30 min,上機(jī)檢測(cè)450 nm處光密度(OD)值。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

遷移實(shí)驗(yàn)：首先用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,將1×105個(gè)細(xì)胞種植到Transwell小室(8 μm)的上室中,下室中加入正常RPMI 1640培養(yǎng)基。侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在上室中鋪入4%基質(zhì)膠,37 ℃孵育10 min,其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后去除培養(yǎng)基,去除上室中的細(xì)胞,洗滌3次,用4%多聚甲醛固定10 min,洗滌3次,用0.1%結(jié)晶紫染色3 min,洗滌3次后晾干,拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

提取各組細(xì)胞總RNA,鑒定RNA濃度及純度,然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為30 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。按照Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green?Kit及TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明進(jìn)行PCR,循環(huán)條件為95℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán),構(gòu)建溶解曲線,相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。內(nèi)參使用GAPDH、U6。引物序列如下：miR-1291上游引物5′-CGTGGCCCTGACTGAAGACC-3′,下游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;BAMBI上游引物5′-CCCAGTGGTACTTTGGTGCC-3′,下游引物5′-GCGGTCATGTACTTCTGTCCC-3′;GAPDH上游引物5′-CCTTGCACATGCCGGAG-3′,下游引物5′-GCACAGAGCCTCGCCTT-3′。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞BAMBI、TGF-β、SMAD4蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞,加入蛋白裂解液提取總蛋白,測(cè)蛋白濃度。配制5%濃縮膠及10%分離膠,每孔中加入30 μg蛋白,70 V電壓下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入BAMBI (1∶1 000)、TGF-β(1∶1 000)、SMAD4 (1∶1 000)及β-actin (1∶1 000),4 ℃冰箱過夜,第2天膜洗滌3次,加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h,洗滌3次,加入發(fā)光液,上機(jī)曝光,使用Image J軟件分析條帶灰度值,蛋白的相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白與β-actin的比值表示。

1.8 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-1291與BAMBI的靶向關(guān)系

通過TargetScan在線網(wǎng)站(http：//www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-1291與BAMBI的靶向關(guān)系。

1.9 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將miR-1291 mimic質(zhì)粒、miR-NC質(zhì)粒分別與WT-BAMBI質(zhì)粒、MUT-BAMBI質(zhì)粒兩兩組合后轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中,設(shè)為miR-1291+WT-BAMBI組、miR-1291+MUT-BAMBI組、miR-NC+WT-BAMBI組、miR-NC+MUT-BAMBI組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶相對(duì)活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織、正常胃組織miR-1291表達(dá)情況

公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,胃癌組織的miR-1291表達(dá)水平為(0.85±0.11),低于正常胃組織的(2.02±0.23),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.33,P<0.01)。

2.2 SGC-7901、GES-1細(xì)胞miR-1291表達(dá)情況

SGC-7901細(xì)胞miR-1291表達(dá)水平低于GES-1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.74,P<0.01),見圖1。

2.3 各組細(xì)胞miR-1291表達(dá)情況

miR-1291組細(xì)胞miR-1291表達(dá)水平高于miR-NC組,miR-1291 inhibitor組細(xì)胞miR-1291表達(dá)水平低于miR inhibitor組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

2.4 miR-1291對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

miR-1291組細(xì)胞72 h時(shí)OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)低于或少于miR-NC組,miR-1291 inhibitor組細(xì)胞72 h時(shí)OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)高于或多于miR inhibitor組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖3。

2.5 SGC-7901、GES-1細(xì)胞的BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表達(dá)情況

SGC-7901細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBImRNA表達(dá)水平高于GES-1細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

2.6 各組細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBI mRNA表達(dá)情況

BAMBI組細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBImRNA表達(dá)水平高于Vector組,sh-BAMBI組細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBImRNA表達(dá)水平低于sh-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖5。

2.7 BAMBI對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

BAMBI組細(xì)胞72 h時(shí)OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)高于或多于Vector組,sh-BAMBI組細(xì)胞72 h時(shí)OD值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)低于或少于sh-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

2.8 miR-1291與BAMBI的靶向關(guān)系

生物學(xué)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-1291與BAMBI存在堿基結(jié)合位點(diǎn)。miR-1291+WT-BAMBI組細(xì)胞熒光素酶活性低于miR-NC+WT-BAMBI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);miR-1291+MUT-BAMBI組細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC+MUT-BAMBI組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-1291組細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBImRNA表達(dá)水平低于miR-NC組,miR-1291 inhibitor組細(xì)胞BAMBI蛋白、BAMBImRNA表達(dá)水平高于miR inhibitor組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖7。

2.9 BAMBI對(duì)細(xì)胞TGF-β、SMAD4蛋白表達(dá)的影響

BAMBI組TGF-β、SMAD4蛋白水平低于Vector組,sh-BAMBI組TGF-β、SMAD4蛋白水平高于sh-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖8。

3 討 論

近年來,胃癌發(fā)病率逐年上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì),多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,盡管放化療、手術(shù)及免疫療法一定程度上改善了患者預(yù)后,但是總體預(yù)后仍不佳。因此,明確胃癌增殖、轉(zhuǎn)移機(jī)制和尋找診斷生物學(xué)標(biāo)志物、有效治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。研究[10]發(fā)現(xiàn),miRNA在腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中扮演著重要角色。miR-1291位于SNORA34基因上,在多種腫瘤組織中差異表達(dá),參與腫瘤進(jìn)展[11-12]。WANG J Q等[13]發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中miR-1291呈低表達(dá),上調(diào)miR-1291可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。另有研究[14]發(fā)現(xiàn),miR-1291與早期乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外,黑色素瘤細(xì)胞來源的長鏈非編碼RNA ELFN1-AS1可通過靶向調(diào)控巨噬細(xì)胞miR-1291表達(dá),促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化,進(jìn)而抑制腫瘤生長[15]。本研究結(jié)果顯示,miR-1291在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中低表達(dá),上調(diào)miR-1291可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,下調(diào)miR-1291可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,提示miR-1291是胃癌的抑癌基因。

miRNA一般通過與下游靶基因結(jié)合而發(fā)揮作用,研究[16-17]發(fā)現(xiàn),雌激素相關(guān)受體α(ERRα)、人調(diào)停蛋白復(fù)合體亞基1(MED1)與miR-1291存在靶向關(guān)系。為進(jìn)一步明確miR-1291的下游靶基因,本研究利用在線生物信息學(xué)工具進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)BAMBI可能是miR-1291的作用靶點(diǎn),進(jìn)一步行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)后證實(shí)兩者存在靶向調(diào)控關(guān)系。BAMBI基因位于10號(hào)染色體,在調(diào)控細(xì)胞生理、病理及信號(hào)傳遞中扮演著重要角色。研究[18]發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中BAMBI呈高表達(dá),沉默BAMBI可通過激活TGF-β/Smad通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與遷移。此外,上調(diào)BAMBI可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[17]。本研究結(jié)果顯示,BAMBI在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),上調(diào)BAMBI可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,下調(diào)BAMBI可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,提示BAMBI是胃癌的促癌基因。TGF-β信號(hào)通路是細(xì)胞常見通路之一,在腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要調(diào)控作用,同時(shí)參與調(diào)控胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[18],靶向抑制該通路是目前治療胃癌的方法之一。BAMBI細(xì)胞外蛋白結(jié)構(gòu)與TGF-β相似,因而可與TGF-βⅠ型受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,且由于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)沒有磷酸酶活性,下游的Smads信號(hào)不能被磷酸化,最終抑制了TGF-β信號(hào)通路[19]。研究[20-21]證實(shí),BAMBI與TGF-β信號(hào)通路存在調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)BAMBI后細(xì)胞TGF-β、SMAD4蛋白水平下降,反之TGF-β、SMAD4蛋白水平上升,與上述結(jié)論相符。

綜上所述,miR-1291在胃癌細(xì)胞中低表達(dá),上調(diào)miR-1291可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,其機(jī)制可能是miR-1291負(fù)性調(diào)控BAMBI進(jìn)而抑制TGF-β通路,miR-1291或可成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。本研究存在不足之處,例如未能利用臨床樣本資料驗(yàn)證miR-1291、BAMBI與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,亦未通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確miR-1291、BAMBI對(duì)胃癌惡性生物學(xué)行為的影響,未來還需進(jìn)一步深入研究加以驗(yàn)證。