許媛媛,盧伊凝,馬士杰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 消化科,江蘇 淮安,223300)

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤,目前多采用手術(shù)結(jié)合放化療方式進行治療,但部分患者因產(chǎn)生耐藥性或放射抵抗性而療效欠佳,故尋找安全有效的治療藥物對改善患者預(yù)后具有重要意義[1-2]。相關(guān)研究[3-4]將中草藥用于胃癌的治療中,發(fā)現(xiàn)其可通過影響胃癌細胞生物學(xué)行為而減緩胃癌發(fā)展進程。白頭翁屬于毛茛科植物白頭翁的干燥根,具有抗炎、抗腫瘤作用。研究[5]表明,白頭翁皂苷類化合物具有抗腫瘤作用,但白頭翁皂苷對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響尚不明確。環(huán)狀RNA(circRNA)是由5′端與3′端以共價鍵結(jié)合形成的閉合RNA分子,在胃癌等腫瘤中表達異常且具有高穩(wěn)定性。環(huán)狀RNA核受體相互作用蛋白1 (circNRIP1)作為circRNA成員之一,能通過調(diào)控細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)以及Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路介導(dǎo)腫瘤細胞的發(fā)展[6]。研究[7]表明,胃癌細胞中circNRIP1表達水平增高,下調(diào)circNRIP1可促進胃癌細胞凋亡。另有研究[8]指出,circNRIP1高表達與胃癌的轉(zhuǎn)移潛力和復(fù)發(fā)風(fēng)險密切相關(guān)。此外,circNRIP1可通過調(diào)控葡萄糖代謝而參與胃癌發(fā)生過程[9]。本研究探討白頭翁皂苷對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,并分析其機制是否與調(diào)控circNRIP1有關(guān),以期為胃癌的臨床治療提供新的方向與思路。

表3 4組細胞circNRIP1表達量比較

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胃癌細胞HGC-27購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫;白頭翁皂苷購自南京春秋生物科技有限公司(純度≥98%);DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購自美國Gibco公司;Trizol試劑由上海源葉生物公司提供;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑由北京普利萊公司提供;反轉(zhuǎn)錄和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自北京天根生化;pcDNA、pcDNA-circNRIP1購自上海吉滿生物;si-NC、si-circNRIP1由廣州銳博生物公司提供;兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體均由北京普利萊基因技術(shù)有限公司提供;CCK-8試劑、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠均由北京索萊寶科技有限公司提供;GAPDH抗體、帶有辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均購于上海翌圣生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：將HGC-27細胞種植于6孔細胞培養(yǎng)板中,加入不同濃度白頭翁皂苷(12.5、25.0、50.0 μmol/L)培養(yǎng)24 h[10],分別設(shè)為低白頭翁皂苷組、中白頭翁皂苷組、高白頭翁皂苷組,另將正常培養(yǎng)的HGC-27細胞設(shè)為對照組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-circNRIP1轉(zhuǎn)染至HGC-27細胞,分別設(shè)為si-NC組、si-circNRIP1組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA-circNRIP1、pcDNA轉(zhuǎn)染至HGC-27細胞,分別設(shè)為pcDNA-circNRIP1組、pcDNA組。分別向HGC-27細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-circNRIP1,然后將50.0 μmol/L白頭翁皂苷加至細胞中培養(yǎng)24 h,分別記為白頭翁皂苷+pcDNA組、白頭翁皂苷+pcDNA-circNRIP1組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力：將收集好的各組HGC-27細胞置入96孔板中,每孔均加入CCK-8溶液10 μL,置入恒溫培育箱中持續(xù)培育2 h,使用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處光密度(OD)值并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力：將各組HGC-27細胞以每孔500個分別接種于6孔板中,繼續(xù)培育至出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆團,棄培養(yǎng)基并加入500 μL甲醇,持續(xù)固定20 min后加入濃度1%的結(jié)晶紫染色液400 μL,持續(xù)染色15 min,拍照并觀察細胞克隆情況。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力：① 侵襲實驗。收集各組HGC-27細胞,在加入稀釋的Matrigel基質(zhì)膠的上室進行接種(每孔1×105個),并將600 μL血清培養(yǎng)液置入其下室,共同置入培育箱,持續(xù)48 h后,棄去培養(yǎng)液,加入4%濃度的多聚甲醛完成固定,時間20 min,然后用1%濃度結(jié)晶紫染色液染色10 min,再用顯微鏡觀察細胞侵襲情況。② 遷移實驗。收集各組HGC-27細胞接種于上室(每孔1×105個),后續(xù)實驗步驟同侵襲實驗。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測circNRIP1表達：向各組HGC-27細胞中加入1 mL Trizol試劑,有效提取細胞總DNA,各組DNA濃度測定均采用紫外分光光度計完成。建立反轉(zhuǎn)錄體系,分別為5×g DNA Buffer 2 μL,2 μL 10×King RT Buffer,1 μL FastKing RT Enzyme Mix,2 μL FQ-RT Primer Mix,2 μg RNA,并將20 μL RNase-Free ddH2O作為補足體系。qRT-PCR擴增操作在cDNA模板基礎(chǔ)上進行。使用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測circNRIP1相對表達量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達：將RIPA裂解液分別加入各組HGC-27細胞中,提取細胞總蛋白后,采用二喹啉甲酸(BCA)方法分別檢測相關(guān)蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法對40 μg蛋白進行電泳操作,并將分離好的蛋白凝膠轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,加入5%濃度的脫脂牛奶進行封閉操作,持續(xù)時間2 h;將E-cadherin一抗(1∶1 000稀釋)、N-cadherin一抗(1∶1 000稀釋)和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶3 000稀釋)與PVDF膜共同在4 ℃環(huán)境下孵育一夜,再將膜繼續(xù)與二抗(1∶5 000稀釋)在37 ℃恒溫環(huán)境中孵育2 h,應(yīng)用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 白頭翁皂苷對HGC-27細胞增殖能力和克隆形成能力的影響

對照組、低白頭翁皂苷組、中白頭翁皂苷組、高白頭翁皂苷組細胞增殖抑制率依次升高,細胞克隆形成數(shù)量依次減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 4組細胞增殖抑制率和細胞克隆形成數(shù)量比較

2.2 白頭翁皂苷對HGC-27細胞遷移、侵襲能力的影響

對照組、低白頭翁皂苷組、中白頭翁皂苷組、高白頭翁皂苷組細胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量依次減少,N-cadherin蛋白表達依次降低,E-cadherin蛋白表達依次升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表2。

表2 4組細胞遷移、侵襲數(shù)量和E-cadherin、N-cadherin蛋白表達情況比較

2.3 白頭翁皂苷對HGC-27細胞中circNRIP1表達的影響

對照組、低白頭翁皂苷組、中白頭翁皂苷組、高白頭翁皂苷組circNRIP1表達量依次降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

2.4 過表達和抑制circNRIP1后circNRIP1轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果

與pcDNA組比較,pcDNA-circNRIP1組circNRIP1表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與si-NC組比較,si-circNRIP1組circNRIP1表達量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組circNRIP1轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果比較

2.5 抑制circNRIP1對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲的影響

si-circNRIP1組細胞增殖抑制率和E-cadherin蛋白水平高于si-NC組,N-cadherin蛋白水平低于si-NC組,細胞克隆形成數(shù)量、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量少于si-NC組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3、表5。

表5 抑制circNRIP1對HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)指標(biāo)的影響

2.6 過表達circNRIP1對白頭翁皂苷處理的HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲的影響

白頭翁皂苷+pcDNA-circNRIP1組細胞增殖抑制率和E-cadherin蛋白水平低于白頭翁皂苷+pcDNA組,N-cadherin蛋白水平高于白頭翁皂苷+pcDNA組,細胞克隆形成數(shù)量、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量多于白頭翁皂苷+pcDNA組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4、表6。

表6 過表達circNRIP1對白頭翁皂苷處理的HGC-27細胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)指標(biāo)的影響

3 討 論

既往研究[11]顯示,circRNA在胃癌組織和相關(guān)細胞系中異常表達,且對胃癌細胞生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響,例如環(huán)狀RNA人抗原R(circ-HuR,hsa_circ_0049027)在胃癌組織和細胞系中表達下調(diào),上調(diào)其表達則可抑制胃癌細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,機制可能是circ-HuR與CCHC型鋅指核酸結(jié)合蛋白(CNBP)相互作用并抑制人抗原R(HuR)表達,進而抑制腫瘤進展。胃癌組織和患者血清中的環(huán)狀RNA SH3結(jié)構(gòu)域激酶結(jié)合蛋白1(circSHKBP1,hsa_circ_0000936)表達均增加,且其與較高的TNM分期和較低的存活率有關(guān),circSHKBP1過表達可促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成,并充當(dāng)微小RNA-582-3p(miR-582-3p)的海綿分子增加HuR表達,還可與熱休克蛋白90(HSP90)結(jié)合,抑制HSP90泛素化,促進胃癌發(fā)展[12]。

從天然植物中提取的活性成分如齊墩果酸具有抗胃癌作用,其機制可能與調(diào)控相關(guān)信號通路表達有關(guān)[13]。研究[14]顯示,白頭翁皂苷能抑制肺癌細胞增殖并促進細胞凋亡。另有研究[15]報道,白頭翁皂苷可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖及糖酵解。本研究結(jié)果顯示,隨著白頭翁皂苷濃度的升高,胃癌細胞增殖抑制率升高,細胞克隆形成數(shù)量減少,提示白頭翁皂苷可抑制胃癌細胞增殖且具有濃度依賴性。E-cadherin、N-cadherin為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)標(biāo)志物,若兩者表達失調(diào),可促進EMT,進而促進細胞遷移與侵襲[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),白頭翁皂苷以濃度依賴性方式抑制胃癌細胞遷移與侵襲,并上調(diào)E-cadherin蛋白表達和下調(diào)N-cadherin蛋白表達,提示白頭翁皂苷可在一定程度上抑制胃癌細胞遷移與侵襲活性。

circNRIP1在胃癌組織或細胞系中表達水平升高,敲低circNRIP1可抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)表達,微小RNA-149-5p(miR-149-5p)過表達可減弱circNRIP1對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響,同時circNRIP1可充當(dāng)miR-149-5p海綿分子而影響AKT1表達,進而促進胃癌發(fā)生與發(fā)展[8]。circNRIP1在抗紫杉醇(PTX)的卵巢癌組織和細胞中高表達,沉默circNRIP1可抑制卵巢癌細胞PTX抗性,circNRIP1可充當(dāng)微小RNA-211-5p(miR-211-5p)海綿分子,抑制miR-211-5p表達可減弱沉默circNRIP1對卵巢癌細胞PTX抗性的抑制作用,miR-211-5p靶向結(jié)合同源框C8(HOXC8),HOXC8過表達可減弱miR-211-5p對卵巢癌細胞PTX抗性的抑制作用,circNRIP1、miR-211-5p可共同調(diào)節(jié)HOXC8表達[18]。circNRIP1在宮頸癌組織、細胞中表達上調(diào),其表達與淋巴血管間隙浸潤相關(guān),可促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲,微小RNA-629-3p(miR-629-3p)通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酶4A1(PTP4A1)、ERK1/2抑制宮頸癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移,circNRIP1可通過充當(dāng)miR-629-3p的海綿分子而調(diào)節(jié)PTP4A1/ERK1/2通路,circNRIP1可能成為宮頸癌的潛在治療靶點[19]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)白頭翁皂苷處理后,胃癌細胞circNRIP1表達量降低,提示白頭翁皂苷可能通過抑制circNRIP1而發(fā)揮抗胃癌進展作用。本研究進一步驗證circNRIP1可否作為白頭翁皂苷治療胃癌的潛在靶點,結(jié)果顯示,抑制circNRIP1表達可減弱胃癌細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,而過表達circNRIP1可拮抗白頭翁皂苷對胃癌細胞生長與轉(zhuǎn)移的抑制作用。由此提示,白頭翁皂苷對circNRIP1表達具有調(diào)控作用,并通過這一機制降低胃癌細胞生長與轉(zhuǎn)移活性。

綜上所述,白頭翁皂苷對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲活性具有明顯抑制作用且呈現(xiàn)濃度依賴性,其作用機制與抑制circNRIP1表達有關(guān)。circNRIP1或可成為白頭翁皂苷治療胃癌的潛在靶點,這為白頭翁皂苷對胃癌調(diào)控機制的研究提供了一定的理論依據(jù)。