李東霖,郭懷娟,王 穎,嚴(yán)雪冰,陸美玲

(揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科,江蘇 揚(yáng)州,225000)

結(jié)直腸癌(CRC)作為常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤,近10年來(lái)在中國(guó)發(fā)病率逐年增高[1]。研究[2]表明,腸道菌群可作為 CRC 診斷及治療的潛在標(biāo)志物。具核梭桿菌(Fn)作為口腔來(lái)源的厭氧菌,在CRC的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[3]。本課題組前期通過(guò)宏基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn),Fn在CRC患者腸道中豐度顯著高于健康人群,且Fn可通過(guò)促進(jìn)CRC細(xì)胞代謝產(chǎn)生環(huán)氧十八碳烯酸介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[4]。在臨床研究[5]中,Fn豐度與CRC患者的總生存期(OS)、無(wú)病生存期(DFS)及腫瘤特異性生存期(CSS)呈顯著負(fù)相關(guān)。盡管Ⅱ期CRC術(shù)前不伴有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,但是仍有相當(dāng)一部分患者術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,因而尋找可靠預(yù)后標(biāo)志物對(duì)于改善Ⅱ期CRC患者的總體預(yù)后顯得尤為重要[6]。本研究通過(guò)回顧性研究明確Fn豐度對(duì)Ⅱ期CRC患者預(yù)后的影響,為腸道菌群標(biāo)志物在CRC診療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月—2018年12月在揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除的CRC樣本及匹配的臨床信息。臨床信息包括性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期、清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化程度、腫瘤最大直徑、糞便隱血(OB)試驗(yàn)結(jié)果、血清癌胚抗原(CEA)、腫瘤組織Ki-67表達(dá)水平及隨訪資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 未進(jìn)行術(shù)前新輔助化療或放療者;② 符合美國(guó)癌癥分期聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第8版術(shù)后病理TNM分期為Ⅱ期的CRC者;③ 臨床資料完整者;④ 知情同意使用臨床樣本及資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 伴有其他未治愈的原發(fā)惡性腫瘤者;② 術(shù)后因感染、心血管疾病或其他非腫瘤原因死亡的患者;③ 術(shù)前半年行抗生素治療者。本研究已經(jīng)通過(guò)揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑和儀器

組織DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司,實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)購(gòu)自日本TAKARA公司。Fn的基因及內(nèi)參β-actin引物購(gòu)自上海生工生物工程公司,Fn的基因引物上游：5′-AAGCGCGTCT AGGTGGTTATGT-3′,下游：5′-TGTAGTTCCGCTTACCTCTCCAG-3′;β-actin基因引物上游：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′,下游：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)

根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)配置緩沖液buffer ATL、buffer AL、buffer AW1及buffer AW2。將組織樣本加入buffer ATL和磷酸鹽緩沖液(PBS)混合溶液中研磨,隨后加入蛋白酶K并充分振蕩。將樣本置于水浴鍋中至組織完全裂解,加入RNase A去除殘存RNA,加入buffer AL和無(wú)水酒精充分混勻。將樣本置于離心管中,加入buffer AW2溶液,室溫離心3 min(12 000 g)。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增體系配置如下：SYBR Premix Ex Taq溶液(10.0 μL),上游及下游引物(均0.4 μL),DNA模板(2.0 μL),加入無(wú)RNA 酶的水至總體積為20 μL。聚合酶鏈反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性1 min,60 ℃退火20 s,56 ℃延伸60 s,共40個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參基因β-actin作為對(duì)照,根據(jù)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過(guò)2-△△Ct方法計(jì)算Fn的基因相對(duì)表達(dá)量,根據(jù)中位數(shù)法確定Fn高豐度組和Fn低豐度組。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

該研究起點(diǎn)為患者手術(shù)日期,終點(diǎn)為疾病進(jìn)展日期、因CRC死亡日期或最后一次隨訪日期,最終評(píng)價(jià)指標(biāo)包括CSS和DFS。CSS定義為手術(shù)日期至因腫瘤死亡或隨訪截止日期,DFS定義為手術(shù)日期至腫瘤進(jìn)展日期。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Fn豐度與患者臨床病理特征關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),采用Kaplan-Meier法在GraphPad Prism 8軟件上繪制生存曲線并進(jìn)行Log-rank生存檢驗(yàn)。通過(guò)單因素及多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析Fn豐度與CRC患者CSS及DFS的關(guān)系,P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤組織中Fn豐度與Ⅱ期CRC患者臨床特征的相關(guān)性

151例Ⅱ期CRC患者中,腫瘤組織Fn高豐度組及Fn低豐度組分別包括76、75例患者。Fn豐度與性別(P=0.57)、年齡(P=0.16)、腫瘤部位 (P=0.89)、T分期(P=0.94)、腫瘤直徑(P=0.92)、清掃淋巴結(jié)數(shù)目(P=0.54)、神經(jīng)/血管侵犯(P=0.17)、組織分化(P=0.74)、OB試驗(yàn)結(jié)果(P=0.37)、血清CEA水平(P=0.57)及Ki-67表達(dá)(P=0.95)均無(wú)顯著相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 Fn豐度與Ⅱ期CRC患者臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.2 腫瘤組織中Fn豐度對(duì)Ⅱ期CRC患者CSS及DFS的影響

151例Ⅱ期CRC患者中,生存分析曲線表明,Fn高豐度組較Fn低豐度組CSS和DFS更短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。見(jiàn)圖1。單因素COX回歸分析表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化及Fn豐度與Ⅱ期CRC患者CSS顯著相關(guān)(P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤部位、T分期、腫瘤直徑、OB試驗(yàn)結(jié)果、CEA水平及Ki-67表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。多因素COX回歸分析表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目<12枚、神經(jīng)/血管侵犯、低分化及Fn高豐度是影響患者CSS的獨(dú)立預(yù)后不良因素。見(jiàn)表2。單因素分析表明,Ⅱ期CRC患者DFS與清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化及Fn豐度顯著相關(guān),而與性別、年齡、腫瘤部位、T分期、腫瘤直徑、OB試驗(yàn)結(jié)果、CEA水平及Ki-67表達(dá)均無(wú)顯著相關(guān)性。多因素分析表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目<12枚、神經(jīng)/血管侵犯、低分化及Fn高豐度是影響Ⅱ期CRC患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

表2 Ⅱ期CRC患者CSS的單因素及多因素分析

表3 Ⅱ期CRC患者DFS的單因素及多因素分析

2.3 亞組分析

將Ⅱ期CRC患者分為高危組(n=114)和低危組(n=37),其中高危組患者至少含有以下1個(gè)高危因素：① T分期為T(mén)4期;② 清掃淋巴結(jié)數(shù)目<12枚;③ 伴有血管神經(jīng)侵犯;④ 組織分化為低分化。在Ⅱ期低危組中,生存分析表明,腫瘤組織中Fn豐度與患者的CSS和DFS無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.22、P=0.47)。Ⅱ期高危組中,生存分析表明,腫瘤組織中Fn豐度與CRC患者的CSS和DFS呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

在Ⅱ期高危組CRC患者中,單因素分析表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化及Fn豐度與患者CSS顯著相關(guān),而與性別、年齡、腫瘤部位、T分期、腫瘤直徑、OB試驗(yàn)結(jié)果、CEA水平及Ki-67表達(dá)均無(wú)相關(guān)性。多因素分析結(jié)果表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化及Fn豐度是影響患者CSS的獨(dú)立不良預(yù)后因素。見(jiàn)表4。單因素分析表明,高危組Ⅱ期CRC患者DFS與清掃淋巴結(jié)數(shù)目、神經(jīng)侵犯、組織分化及Fn豐度顯著相關(guān),而與性別、年齡、腫瘤部位、T分期、腫瘤直徑、OB試驗(yàn)結(jié)果、CEA水平及Ki-67表達(dá)均無(wú)相關(guān)性。多因素分析結(jié)果表明,清掃淋巴結(jié)數(shù)目<12枚、神經(jīng)/血管侵犯、低分化及Fn高豐度是影響高危組Ⅱ期CRC患者DFS的獨(dú)立不良預(yù)后因素。見(jiàn)表5。

表4 高危組Ⅱ期CRC患者CSS的單因素及多因素分析

表5 高危組Ⅱ期CRC患者DFS的單因素及多因素分析

3 討 論

CASTELLARIN M等[7]通過(guò)RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),Fn顯著富集于CRC組織,且其豐度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)Fn豐度與接受化療的Ⅲ/Ⅳ期CRC患者的預(yù)后呈顯著負(fù)相關(guān),而與EMT及腫瘤干細(xì)胞分子表型呈正相關(guān)[8]。研究[9]顯示,Fn上調(diào)CRC細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)并介導(dǎo)下游EMT轉(zhuǎn)錄因子的翻譯,最終促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Fn還可以通過(guò)促進(jìn)脂肪酸氧化減少CRC干細(xì)胞的脂質(zhì)積累,進(jìn)而增強(qiáng)其自我更新能力[10]。Fn通過(guò)激活Toll樣受體4信號(hào)通路調(diào)控下游微小RNA-18a/4802表達(dá)水平,進(jìn)而介導(dǎo)CRC細(xì)胞發(fā)生自噬并對(duì)化療藥物產(chǎn)生抵抗[11]。既往研究[12]表明,15%～25%的Ⅱ期CRC患者會(huì)在術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或因腫瘤死亡,因而亟需尋找可靠生物標(biāo)志物用于識(shí)別術(shù)后預(yù)后不良的高風(fēng)險(xiǎn)人群。鑒于前期證據(jù)表明Fn在CRC惡性進(jìn)展及耐藥中發(fā)揮重要作用,本研究擬通過(guò)回顧性分析明確其是否可以作為Ⅱ期CRC患者預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。

本研究的卡方分析結(jié)果表明,Fn豐度與常見(jiàn)臨床參數(shù)如年齡、性別、腫瘤位置等無(wú)顯著相關(guān)性,上述結(jié)果與XIE Y X等[13]最新研究結(jié)果一致。在生存分析中,Fn高豐度組患者較Fn低豐度組患者有著更差的CSS和DFS,提示其可能與CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。最后,單因素及多因素分析表明,Fn豐度為Ⅱ期CRC患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素,提示Fn具有成為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能。一項(xiàng)納入3 626例CRC患者的循證醫(yī)學(xué)研究[14]表明,Fn高豐度不僅與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及微衛(wèi)星不穩(wěn)定顯著相關(guān),而且提示更差的總生存期(OS)和DFS。然而,也有研究[15]發(fā)現(xiàn),Fn豐度與腫瘤位置相關(guān),但與CRC患者OS無(wú)顯著相關(guān)性。在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中,盡管Fn在右半結(jié)腸的豐度與OS無(wú)顯著相關(guān)性,但是與一線及二線治療后的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)呈負(fù)相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),Fn豐度與CRC患者免疫治療效果呈正相關(guān),暗示Fn有可能通過(guò)改變腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮抑癌效應(yīng)[17]。因此,Fn是否能夠成為可靠的CRC預(yù)后標(biāo)志物仍有待于更多的臨床研究確認(rèn)。此外,最新研究[18]發(fā)現(xiàn),唾液Fn豐度與CRC患者的預(yù)后顯著相關(guān),因此動(dòng)態(tài)檢測(cè)上述臨床樣本中Fn豐度是否能夠成為監(jiān)測(cè)CRC復(fù)發(fā)的新非侵襲診斷方法也是未來(lái)值得探索的方向。

Ⅱ期CRC高?；颊呤侵赴橛蠺4、腫瘤低分化、血管侵犯等因素的風(fēng)險(xiǎn)人群,但傳統(tǒng)臨床病理因素并不能充分預(yù)測(cè)這類患者的預(yù)后,進(jìn)而導(dǎo)致治療不足或治療過(guò)度[19]。此外,臨床研究[20]甚至發(fā)現(xiàn),部分Ⅱ期高?；颊叩男g(shù)后生存率顯著低于部分Ⅲ期患者,因而尋找可靠預(yù)后標(biāo)志物對(duì)于改善Ⅱ期高?；颊叩目傮w預(yù)后顯得尤為關(guān)鍵。本研究亞組分析表明,Fn豐度為Ⅱ期高危CRC患者預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。由于多數(shù)Ⅱ期高危CRC患者接受術(shù)后輔助化療,因此推斷Fn感染可能導(dǎo)致傳統(tǒng)輔助化療后腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展。在接受新輔助放化療的局部進(jìn)展期直腸癌患者中,腫瘤組織中Fn豐度與腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[21]。在接受5-Fu為基礎(chǔ)的化療方案的CRC患者中,腫瘤組織中高Fn豐度提示更短的無(wú)疾病復(fù)發(fā)生存時(shí)間[22]。在相關(guān)機(jī)制研究中,Fn感染可介導(dǎo)CRC細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗能力[11,23]。HONG X L等[24]研究發(fā)現(xiàn),Fn感染可通過(guò)激活Hedgehog信號(hào)通路增強(qiáng)CRC細(xì)胞的干性,進(jìn)而介導(dǎo)化療抵抗。本研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選出CRC干細(xì)胞CD133+CD44+亞群,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Fn感染可通過(guò)介導(dǎo)EMT增強(qiáng)上述細(xì)胞亞群內(nèi)外惡性潛能[25]。已知腫瘤干細(xì)胞在促進(jìn) CRC 化療抵抗中扮演著重要角色,因此本研究推斷Fn感染也可通過(guò)影響 CRC 干細(xì)胞的生物學(xué)特性來(lái)降低腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性[26]。

本臨床研究存在如下局限性：首先,受樣本量所限,Fn在Ⅱ期及其他分期CRC患者中的臨床價(jià)值仍待于更多大樣本回顧性研究來(lái)確證;其次,本研究聚焦于腫瘤組織中Fn豐度與臨床結(jié)局的相關(guān)性,但糞便中Fn豐度是否與CRC復(fù)發(fā)進(jìn)展相關(guān)尚未清楚;再次,能否基于Fn豐度及Ⅱ期高危因素構(gòu)建優(yōu)于傳統(tǒng)TNM分期體系的新型預(yù)后評(píng)估模型也是未來(lái)值得探索的方向。最后,亟需前瞻性臨床試驗(yàn)明確是否能夠通過(guò)微生態(tài)干預(yù)手段(如抗生素、益生菌/益生元、糞菌移植等)影響腸道中Fn豐度,進(jìn)而降低Ⅱ期CRC患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,腫瘤組織中Fn豐度與Ⅱ期CRC患者CSS及DFS呈負(fù)相關(guān),并且可作為預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。Fn豐度與Ⅱ期低危患者預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性,但是可作為評(píng)估Ⅱ期高?；颊哳A(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。上述研究成果不僅為Ⅱ期CRC患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層提供新的生物標(biāo)志物,而且進(jìn)一步推動(dòng)腸道菌群基礎(chǔ)研究成果向腫瘤臨床診療的轉(zhuǎn)化。