胡亮，周明，文慶，孫輝，丁野，羅疆南

1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001；2.湖南省藥品審核查驗中心，湖南 長沙 410013；3.湖南省藥品審評與不良反應(yīng)監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013

生脈飲來源于《醫(yī)學(xué)啟源》中生脈散，質(zhì)量標準收載在《中國藥典》2020 年版一部，具有益氣復(fù)脈，養(yǎng)陰生津的功效，處方包括紅參、麥冬、五味子3味藥材，主要用于氣陰兩虧，心悸氣短，脈微自汗［1-3］。本品處方中麥冬藥材為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心之功效，主治肺燥干咳，喉痹咽痛，津傷口渴，內(nèi)熱消渴等［3］。目前麥冬藥材多為栽培品，其在栽培過程中可能使用“壯根靈”類植物生長調(diào)節(jié)劑如多效唑、丁酰肼、矮壯素、縮節(jié)胺，這些成分能夠顯著促進麥冬塊根的形成，從而達到增加產(chǎn)量目的［4-7］。QuEChERS 法是一種最先應(yīng)用于果蔬中的農(nóng)藥殘留量檢測前處理方法，即Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe 英文字母的縮寫，這種方法具有簡單有效、安全快速的特點，非常適合于基質(zhì)復(fù)雜的樣品前處理，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測的樣品前處理中［8-10］。《中國藥典》2020 年版四部通則“2341 農(nóng)藥殘留量測定法”中亦有收載［11］。

藥材中殘留的生長調(diào)節(jié)劑隨著加工生產(chǎn)而轉(zhuǎn)移到成方制劑中，目前成方制劑中生長調(diào)節(jié)劑殘留量檢測方法報道較少。本實驗研究中生脈飲樣品因其含有多種成分，如多糖類、黃酮類、皂苷類等，且基底較為復(fù)雜，因此采用QuEChERS 法對樣品進行前處理，應(yīng)用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)，建立了樣品中4 種植物生長延緩劑殘留量的檢測方法，結(jié)果部分批次樣品中檢出多效唑，均未檢出丁酰肼、矮壯素、縮節(jié)胺，同時對檢出多效唑成分樣品進行了方法學(xué)驗證，并對樣品的檢測結(jié)果進行分析討論，為成方制劑中植物生長延緩劑殘留量檢測及限度制定提供了一定的參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Thermo UltiMate3000 超高效液相色譜儀，TSQ Endura 三重四極桿式質(zhì)譜系統(tǒng)，METTLER AE240電子分析天平（梅特勒-托利多，萬分之一），XSE205DU 電子分析天平（梅特勒-托利多，十萬分之一），超聲儀KQ500DE（500 W，40 KHz）；多效唑?qū)φ掌罚ㄅ枺篏752717，純度：99.6%），丁酰肼對照品（批號：G160456，純度：98.9%），矮壯素對照品（批號：G738578，純度：99.4%），縮節(jié)胺對照品（批號：978380，純度：96.1%）均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH；WondaPak QuEChERS 醋酸鈉提取包和固相萃取凈化管（日本Shimadzu 公司）；乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，其他試劑如甲醇、冰醋酸等為分析純，水為純化水。本研究共收集136 批次樣品，來源為國家藥品監(jiān)督管理局生脈飲品種抽驗工作抽驗樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate LP-C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈-0.1% 甲酸的5 mmol/L 乙酸銨溶液（55∶45）為流動相，柱溫為30 ℃，流速為0.2 mL/min，進樣量3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子（ESI+）模式，噴霧電壓為3.8 kV，鞘氣為30 ARB，輔助氣為10 ARB，離子傳輸管溫度350 ℃，蒸發(fā)溫度300 ℃，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測MRM。多效唑選擇m/z 294.0 →70.2、125.0作為檢測離子對，碰撞能量分別為20 V、36 V；丁酰肼選擇m/z 161.0 →61.3、143.0 作為檢測離子對，碰撞能量均為10 V；矮壯素選擇m/z 122.1 →58.3、62.3 作為檢測離子對，碰撞能量分別為27 V、21 V；縮節(jié)胺選擇m/z 114.2 →58.3、98.2 作為檢測離子對，碰撞能量分別為25 V 和26 V；碰撞氣體為高純度氬氣。取對照品溶液，進樣3 μL，按上述離子對測定的MRM 色譜峰的信噪比均應(yīng)大于10∶1。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取多效唑?qū)φ掌贰珘阉貙φ掌?、丁酰肼對照品和縮節(jié)胺對照品適量，置同一100 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到混合對照品溶液①（每1 mL 含多效唑107.8 μg、矮壯素104.8 μg、丁酰肼104.1 μg 和縮節(jié)胺136.4 μg），精密吸取混合對照品溶液①1 mL 置于100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，搖勻，得到混合對照品溶液②（每1 mL 含多效唑1.078 μg、矮壯素1.048 μg、丁酰肼1.041 μg、縮節(jié)胺1.364 μg）。

2.4 供試品溶液制備

精密量取生脈飲樣品15 mL，置50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中，精密加入含1%冰醋酸的乙腈15 mL，置于振蕩器上劇烈振蕩5 min（1 500 次/min），于冰浴中冷卻約30 min；加入QuEChERS 提取包，含無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4∶1，m/m）7.5 g，立即搖散，然后在振蕩器上劇烈振蕩5 min（1 500 次/min），離心5 min（8 000 r/min）。取上清液10 mL，置于已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，凈化管中加入QuEChERS 的凈化包［含無水硫酸鎂900 mg，N-丙基乙二胺（PSA）300 mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg，硅膠300 mg，石墨化炭黑90 mg］，通過渦旋使其充分混勻，再置于振蕩器上劇烈振蕩5 min（2 000 次/min）使凈化完全，離心5 min（8 000 r/min）；取上清液，濾過，即得供試品溶液。

2.5 樣品中4 種植物生長延緩劑篩查

14 批次生脈飲樣品檢出多效唑，檢出率為10.3%，均未檢出丁酰肼、矮壯素和縮節(jié)胺。檢出樣品涉及4 家生產(chǎn)企業(yè)，檢出多效唑典型色譜圖見圖1。同時，對檢出多效唑成分的樣品進行了方法學(xué)驗證。

圖1 生脈飲樣品中4種植物生長延緩劑篩查結(jié)果：A.混合對照品溶液；B.陽性樣品溶液

2.6 多效唑方法學(xué)驗證

2.6.1專屬性試驗以供試品溶液中未檢出多效唑成分的樣品作為陰性對照溶液，檢出多效唑成分的樣品作為陽性供試品溶液。實驗結(jié)果表明，陽性樣品溶液色譜保留時間、提取離子流色譜圖與多效唑?qū)φ掌飞V行為一致，陰性對照溶液在相應(yīng)的位置上無提取離子色譜峰，方法專屬性較好。詳見圖2。

圖2 多效唑?qū)傩栽囼灴疾旖Y(jié)果：A.多效唑?qū)φ掌啡芤海籅.陰性對照溶液；C.陽性樣品溶液

2.6.2線性關(guān)系考察精密量取“2.3”項下多效唑?qū)φ掌啡芤孩冢?.078 μg/mL）適量，加甲醇稀釋，分別得到不同濃度的多效唑?qū)φ掌啡芤海?31.2、215.6、107.8、43.12、21.56、5.39 ng/mL），按上述擬定的色譜條件精密吸取不同濃度對照品溶液各3 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，測定。以m/z 249.0 →70.2峰面積值為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程：Y=7 462.2X+55 189，r=0.997 5，表明多效唑在5.39～431.2 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.6.3精密度試驗精密吸取“2.6.2”項下的多效唑?qū)φ掌啡芤海?15.6 ng/mL）3 μL，注入UPLC-MS/MS儀，連續(xù)采集6 針，測定m/z294.0 →70.2 離子流色譜峰面積，RSD 為3.4%，結(jié)果顯示儀器精密度良好。

2.6.4重復(fù)性試驗取生脈飲樣品（商丘××有限公司，批號：19041331）適量，按“2.4”項下供試品制備方法平行提取6 份供試品溶液。精密吸取供試品溶液3 μL，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定m/z294.0 →70.2 的離子流色譜峰面積，并計算樣品中含量。經(jīng)檢測，樣品中多效唑的平均含量為16.36 ng/mL，RSD 為2.8 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5穩(wěn)定性試驗取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，常溫保存，于制備后0、6、12、18、24 h 分別進樣分析，測定m/z 294.0 →70.2 離子流色譜峰面積，RSD 為2.9%，供試品溶液在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.6.6加樣回收率試驗精密量取生脈飲陰性樣品15 mL，平行操作取樣6 份，置已精密加入濃度為107.8 ng/mL 的多效唑?qū)φ掌啡芤? mL 經(jīng)過氮氣吹干后的聚苯乙烯具塞離心管中，按擬定的方法平行制備供試品溶液。精密吸取3 μL，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以m/z 294.0 →70.2 的離子流色譜峰面積計算加樣回收率，多效唑回收率范圍為90.2%～97.7%，平均回收率為93.3%，RSD為3.0%，表明方法回收率較好。

2.6.7檢測限以m/z294.0 →70.2 作為檢測離子對進行檢測，取多效唑?qū)φ掌啡芤褐鸺壪♂?，注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，當(dāng)其信噪比約為3∶1時計算檢測限，結(jié)果為0.18 pg。

2.7 樣品測定

136 批次樣品中有14 批次檢出多效唑，檢出率為10.3%，涉及4 家生產(chǎn)企業(yè)，檢出范圍為10.2～121.9 ng/mL，具體檢出結(jié)果見表1。

表1 136批次生脈飲樣品中多效唑檢出結(jié)果表

查閱相關(guān)文獻［5-6］，麥冬藥材中多效唑使用較為頻繁。本研究按麥冬中多效唑0.5 mg/kg（水果谷物中最高殘留限量為0.2～0.5 mg/kg）進行折算，生脈飲中多效唑含量應(yīng)不得過100 ng/mL，結(jié)果檢出的14 批次樣品中2 批次超出擬定限度。

3 討論

在整個麥冬藥材種植過程中，植物生長延緩劑多效唑的使用比較普遍，也比較頻繁。植物生長延緩劑屬于農(nóng)藥，在不同國家的瓜果蔬菜中都有相應(yīng)的殘留量規(guī)定，由于多效唑在土壤中有較長的半衰期，因此存在危害非靶標的可能性。日本、韓國、新西蘭、澳大利亞等國規(guī)定多效唑的最高殘留限量（MRL）為0.5 mg/kg，我國對水果谷物類多效唑的MRL 規(guī)定為0.2～0.5 mg/kg［12-14］，對于中藥材和中成藥的殘留量暫時沒有相關(guān)規(guī)定。

參考食品中農(nóng)藥最大殘留限量標準（GB 2763-2021），對于生脈飲樣品中檢出多效唑的情況計算每日安全服用量：

ADI：每日允許攝入多效唑量；W：使用者體重。

N：多效唑殘留濃度（mg/kg）；O：使用原藥材量（kg）。

以每日允許攝入多效唑量（Acceptable Daily Intake）0.1 mg/kg×體重作為基準，依據(jù)《中國藥典》2020 年版一部麥冬項下最大使用量12 g、水果谷類多效唑最高殘留限量0.5 mg/kg 計算，按照成人體重暫以50 kg 折算，麥冬藥材成人每日最大安全服用量為10 kg，為藥典規(guī)定用量（12 g）的800 多倍。

整體而言，生脈飲樣品中檢出多效唑批次較少，可能與樣品生產(chǎn)工藝（滲漉提?。Ⅺ湺幉闹卸嘈н蚝坎桓叩纫蛩赜嘘P(guān)。按照成人體重50 kg 計算，多效唑每日允許攝入量為5 mg，生脈飲樣品規(guī)格為每支10 mL，用法用量為一次一支，一日三次。按每日最大服用量30 mL，樣品中多效唑最大含量121.9 ng/mL 計算，每日攝入量為3.657 μg，遠低于每日允許攝入量，從分析數(shù)據(jù)看樣品中檢出多效唑成分對人體的危害風(fēng)險較低。但藥品與食品相比，具有特殊性，多效唑在體內(nèi)的具體作用機制尚不明確，是否存在與各藥味中化學(xué)成分間相互反應(yīng)有待進一步地考證。為更好地對中藥安全性進行監(jiān)測，應(yīng)盡快完善并及時頒布植物生長調(diào)節(jié)劑殘留量安全標準。植物生長調(diào)節(jié)劑多效唑的體內(nèi)作用效果及作用機制等問題需要科學(xué)、嚴謹?shù)膶嶒炑芯?，在保障人民群眾用藥安全的前提下，更好地促進中藥產(chǎn)業(yè)鏈的健康持續(xù)發(fā)展。