段有升，王 路，張麗娜

（新疆巴州人民醫(yī)院1.放療科2.檢驗(yàn)科，新疆 庫(kù)爾勒 841000）

食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）是食管癌常見(jiàn)病理類型之一，且占比較大。隨著人們生活方式的日益轉(zhuǎn)變以及人口老齡化趨勢(shì)的加劇，ESCC 的發(fā)病率正呈逐年攀升的趨勢(shì)[1]。由于ESCC 患者發(fā)病早期癥狀相對(duì)隱匿，從而使得大多數(shù)患者首次確診便已是中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，導(dǎo)致預(yù)后不良[2]。如何有效預(yù)測(cè)ESCC 患者的預(yù)后是廣大醫(yī)務(wù)工作者共同關(guān)注的熱點(diǎn)。微小RNA（miRNA）是近年來(lái)人類新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈RNA[3]，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，可能與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展息息相關(guān)。microRNA-31 是miRNA 家族的重要成員之一[4]，可能參與了腫瘤惡性生物學(xué)行為的調(diào)控過(guò)程。Gas6 和Axl 已被證實(shí)在多種腫瘤組織以及細(xì)胞中高表達(dá)[5]，上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）的一些轉(zhuǎn)錄因子可被Gas6/Axl 復(fù)合物激活，Gas6 與 Axl 的綁定（Gas6/Axl復(fù)合物）可能通過(guò)調(diào)控上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)一步參與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[6]。癌胚抗原（CEA）、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原（SCC）、細(xì)胞角蛋白19 片段抗原21-1（CYFRA21-1）作為腫瘤預(yù)后的有效生物學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)中。本文主要是研究microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC 中的表達(dá)及其與患者預(yù)后和CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析新疆巴州人民醫(yī)院2017 年1 月至2017 年8 月收治的80 例ESCC 患者的病歷資料。其中男性47 例，女性33 例；年齡41 ～78 歲，平均（62.34±6.28）歲；接受文化教育年限6 ～16 年，平均（10.49±1.38）年；體質(zhì)指數(shù)19 ～32 kg/m2，平均（23.15±1.22）kg/m2；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期31 例，Ⅲ～Ⅳ期49 例。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）受試者經(jīng)病理檢查確診；（2）入組前并未接受相關(guān)治療；（3）臨床資料完整；（4）可正常交流溝通。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性病變；（2）心、肺、腦等臟器發(fā)生重大病變；（3）存在精神障礙；（4）治療期間因故退出或失訪。所有患者或患者家屬均已簽署同意書(shū)，研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。無(wú)菌條件下收集癌組織及癌旁正常食管組織（距離癌組織＞3 cm），各80 例。

1.2 研究方法

（1）microRNA-31 檢測(cè)：分別于患者手術(shù)后采集癌組織以及癌旁正常組織，根據(jù)miRNA easy 迷你試劑盒說(shuō)明書(shū)完成總RNA 的提取，并以紫外分光光度計(jì)完成RNA 濃度、純度的測(cè)量，光密度值A(chǔ)260/A280 ＞1.8 為最佳。隨后使用Prime Script miRNA cDNA 合成試劑盒完成cDNA 合成，一應(yīng)操作均遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。之后開(kāi)展PCR 擴(kuò)增，借助ABI 7500 PCR 儀完成擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL，所有樣本重復(fù)測(cè)量3 次，以平均值作為最終結(jié)果。反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40 個(gè)循環(huán)。然后制作溶解曲線，參數(shù)如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃15 s。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：上游：5'-TGTTTTGAGCGGGGGTCAAGAGC-3'，下 游：5'-CTCTCATTTGCTATATTCA-3'。（2）Gas6、Axl 表達(dá)檢測(cè)：檢測(cè)方式選用免疫組織化學(xué)法，首先取切片完成石蠟包埋處理，之后進(jìn)行脫水、抗原修復(fù)、血清封閉，滴加鼠抗人Gas6（1:200）、Axl（1:250）以及二抗孵育觀察。依次放入梯度酒精及二甲苯。顯微鏡100 倍視野下隨機(jī)選取10 個(gè)視野。染色結(jié)果取染色強(qiáng)度( 0: 無(wú)染色，1: 輕度，2: 中度，3: 高度) 和染 色 范 圍( 0 為1% ～9% ; 1 為10% ～24% ; 2 為25% ～50% ; 3 為51% ～75% ; 4 為＞75% ) 乘積。兩項(xiàng)評(píng)分乘積≥3 為陽(yáng)性表達(dá)，乘積＜3 為陰性表達(dá)。（3）血清CEA、SCC、CYFRA21-1 水平檢測(cè)：術(shù)前采集所有患者空腹靜脈血3 mL，離心處理后送檢。離心參數(shù)：半徑8 cm，速率以3500 r/min 為宜，時(shí)長(zhǎng)選擇10 min。其中CEA 及CYFRA21-1 水平的檢測(cè)借助Elecsys2010 儀器完成，相關(guān)試劑及儀器均購(gòu)自瑞士羅氏公司，檢測(cè)方式選用電發(fā)光免疫測(cè)定法。SCC水平的檢測(cè)借助美國(guó)Abbott 公司的IM x System 進(jìn)行，具體操作遵循儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。（4）分組方式：對(duì)所有患者均開(kāi)展5 年的隨訪觀察，隨訪方式采用門(mén)診、電話結(jié)合的方法，隨訪截止時(shí)間為2022 年10 月1 日，無(wú)失訪患者。將患者按照預(yù)后狀況的差異分作死亡組32 例及存活組48 例。死亡組32 例患者中有Ⅰ～Ⅱ期患者13 例，Ⅲ～Ⅳ期患者19 例，占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.079，P＞0.05）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達(dá)對(duì)比

ESCC 組織中microRNA-31、Gas6 和Axl 的表達(dá)水平均高于癌旁正常組織（P＜0.05），見(jiàn)表1。Gas6和Axl 在食管癌組織中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在正常食管組織中低表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 Gas6 和Axl 在食管癌組織、正常食管組織中的表達(dá)情況（SP法，40 倍）

表1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達(dá)對(duì)比（± s）

表1 microRNA-31、Gas6 和Axl 在不同食管組織中的表達(dá)對(duì)比（± s）

組織 例數(shù) microRNA-31 Gas6 Axl癌組織 80 28.37±2.41 10.49±1.23 10.78±1.14癌旁正常組織 80 13.05±1.77 2.62±0.04 2.44±0.25 t 值 45.826 57.200 63.92 P 值 0.000 0.000 0.000

2.2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系分析

ESCC 死亡患者microRNA-31、Gas6 和Axl 的表達(dá)水平均高于存活患者（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析（± s）

表2 microRNA-31、Gas6 和Axl 表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析（± s）

預(yù)后 例數(shù) microRNA-31 Gas6 Axl死亡 32 32.45±2.76 11.34±1.30 11.47±1.78存活 48 25.28±2.03 9.81±1.19 9.91±1.45 t 值 13.384 5.429 4.301 P 值 0.000 0.001 0.000

2.3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析

ESCC 死亡患者的CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)水平分別為（14.79±1.59）ng/mL、（1.52±0.24）ng/mL、（3.92±0.15）ng/mL，均高于存活患者的（3.48±1.01）ng/mL、（0.68±0.08）ng/mL、（2.24±0.07）ng/mL（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析（ng/mL，± s）

表3 CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系分析（ng/mL，± s）

預(yù)后 例數(shù) CEA SCC CYFRA21-1死亡 32 14.79±1.59 1.52±0.24 3.92±0.15存活 48 3.48±1.01 0.68±0.08 2.24±0.07 t 值 38.943 22.505 67.496 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 表達(dá)與CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關(guān)性分析

ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 的表達(dá)與CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)水平均呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 表達(dá)與CEA、SCC、CYFRA21-1 的相關(guān)性分析

3 討論

ESCC 具有癥狀隱匿的特點(diǎn)，部分患者直至疾病晚期仍無(wú)明顯癥狀表現(xiàn)，從而導(dǎo)致其臨床早期檢出率較低，預(yù)后不良[7]。臨床上亟需尋找可在病變?cè)缙谔禺愋宰R(shí)別ESCC 的分子標(biāo)志物，以便為相關(guān)臨床早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供指導(dǎo)依據(jù)。不少研究證實(shí)，miRNA在調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí)，其自身亦可發(fā)揮促癌或抑癌基因的功能[8-9]。其中microRNA-31 在差異性腫瘤中的表達(dá)不同，如在結(jié)直腸癌以及肺癌中普遍存在高表達(dá)，而在乳腺癌及卵巢癌中存在低表達(dá)，且在腺癌和鱗癌中的表達(dá)亦明顯不同。故此，通過(guò)研究microRNA-31 在ESCC 中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性有助于相關(guān)臨床早期診斷和預(yù)后評(píng)估。有研究指出，Gas6、Axl 在血液腫瘤以及其他實(shí)體惡性病變中存在異常高表達(dá)[10-11]，而這是腫瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，ESCC 組織中microRNA-31、Gas6 和Axl 表達(dá)水平均高于癌旁正常組織。提示microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC患者中均存在異常高表達(dá)。究其原因，microRNA-31可能通過(guò)靶向調(diào)控多種下游靶基因或（和）蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步發(fā)揮促癌基因的作用，介導(dǎo)了ESCC 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[12]。而Gas6 和Axl 可能通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體進(jìn)行相關(guān)調(diào)控，進(jìn)一步促進(jìn)了疾病的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程，發(fā)揮了促癌基因作用[13]。馮儒學(xué)等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-31 在晚期腫瘤患者中存在異常高表達(dá)，這為本文提供了強(qiáng)有力的佐證。另外，ESCC 死 亡 患 者microRNA-31、Gas6 和Axl 表達(dá)水平均高于存活患者。證實(shí)了上述三項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平和ESCC 患者的預(yù)后密切相關(guān)，即隨著其表達(dá)水平的升高，ESCC 患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)升高。考慮其原因是，microRNA-31 的異常高表達(dá)會(huì)直接導(dǎo)致其靶基因出現(xiàn)致瘤性改變，促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步導(dǎo)致臨床治療難度的增加，對(duì)預(yù)后造成負(fù)面影響[15]。Gas6 和Axl 可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，從而促進(jìn)病情的加劇，導(dǎo)致預(yù)后不良[16]。此外，ESCC 死亡患者的CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)水平均高于存活患者。這反映了隨著血清CEA、SCC 及CYFRA21-1 表達(dá)水平的升高，ESCC 患者的預(yù)后會(huì)變差。分析其原因是，上述三項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)在ESCC患者中的表達(dá)水平高低受臨床分期、分化程度以及浸潤(rùn)情況的影響，其中腫瘤分期晚、病灶大、浸潤(rùn)程度深，會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織凋亡后溶解釋放至血液中的相關(guān)標(biāo)志物增多，導(dǎo)致預(yù)后相對(duì)較差。本文結(jié)果還顯示了ESCC 患者microRNA-31、Gas6、Axl 的表達(dá)與CEA、SCC、CYFRA21-1 表達(dá)水平均呈正相關(guān)。原因可能是microRNA-31、Gas6、Axl 的異常高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移，繼而引起血清中CEA、SCC 及CYFRA21-1 含量的增多。

綜上所述，microRNA-31、Gas6 和Axl 在ESCC中均呈異常高表達(dá)，且隨著其表達(dá)水平的升高，ESCC患者的預(yù)后會(huì)變差，聯(lián)合CEA、SCC、CYFRA21-1水平檢測(cè)可作為有效預(yù)測(cè)ESCC 患者預(yù)后的手段。本文存在一定的不足之處：如未對(duì)不同臨床分期、治療方式患者進(jìn)行分組對(duì)比研究，從而可能引起研究結(jié)果的偏倚，這有待在今后的研究中予以完善。