魏云芳，唐健，張若鵬，3，何建萍

1.昆明學院醫(yī)學院醫(yī)學檢驗技術教研室，云南 昆明 650200；

2.昆明市婦幼保健院昆明學院附屬婦幼保健醫(yī)院醫(yī)學遺傳與產(chǎn)前診斷科，云南 昆明 650000；

3.大理大學臨床醫(yī)學院，云南 大理 671000

地中海貧血也稱為珠蛋白生成障礙性貧血，是一種常見的單基因隱性遺傳性疾病，目前對該病尚無特異性治療方法。地中海貧血可分為α和β兩種類型，其分子機制與α和β珠蛋白基因發(fā)生改變引起珠蛋白合成異常繼而導致溶血性貧血的發(fā)生有關。人類α-珠蛋白基因定位于16 號染色體pl3.3，包括ζ2、ψζ1、ψα2、ψα1、α2和α1基因，由于ζ2和ψζ1基因間以及α1和α2 基因之間存在廣泛的同源序列，兩個ζ 和2 個α基因之間往往易發(fā)生不同程度的同源重組，這導致了人類珠蛋白基因拷貝的增加或減少[1-2]，因此，α-地中海貧血基因型包括東南亞型缺失(--SEA)、-α3.7和-α4.2缺失，QS、CS 和WS 點突變，甚至一些未知突變[3-4]。α2-珠蛋白融合基因地中海貧血于2013 年首次通過DNA 序列分析在湖南永州一個患有Hb H 病的2 歲女孩中被鑒定[5]，其在人群患病情況及分布還不得而知，目前常規(guī)試劑盒不包含該基因位點的檢測，無法滿足臨床對不同疾病類型進行篩查需求。因此，本研究分別采用PCR-導流雜交法、反向點雜交法、缺口PCR (gap-PCR)以及高通量測序技術檢測1例α2-珠蛋白融合基因血標本，探討其在α-地中海貧血融合基因檢測中目前常規(guī)分子診斷方法的應用效果，分析其可能存在的缺陷與不足。

1 資料與方法

1.1 研究對象 該病例來源于昆明市婦幼保健院2020 年1 月1 日至12 月31 日婚育體檢中心的α2珠蛋白融合基因樣本，籍貫為云南省昆明市祿勸縣，漢族，男性，22歲，既往體健，否認輸血史，否認家族遺傳病史，無貧血貌，知情同意并簽署相關同意書。

1.2 標本收集 分別用EDTA-K2抗凝管采集兩份3 mL靜脈血，一份進行血細胞分析和血紅蛋白電泳檢測，另一份進行地中海貧血基因的測定。

1.3 表型分析 血細胞分析中觀察血紅蛋白(hemoglobin，Hb)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)等紅細胞參數(shù)；正常參考值：Hb，女性110～155 g/L，男性120～160 g/L，MCV 82～100 fL，MCH 26～34 pg。血紅蛋白電泳是將電泳出全部條帶的峰值記為100%，各個條帶所占的峰面積作為條帶的相對含量；正常參考值：HbA 94.5%～98%，HbF 0～2.0%，HbA 2 2.5%～3.5%。

1.4 地中海貧血基因常規(guī)檢測α-地中海貧血基因檢測試劑盒(gap-PCR 法)(深圳益生堂公司)、PCR-導流雜交法與反向點-雜交法(廣東凱普生物科技股份有限公司與亞能生物技術有限公司提供的試劑盒)檢測中國人群常見的α-地中海貧血基因。

1.5 高通量測序技術 利用高通量測序技術檢測地中海貧血基因(α+β)508 Plus(委托深圳華大醫(yī)學檢驗實驗室)。

2 結果

2.1 表型和基因型 血細胞分析發(fā)現(xiàn)紅細胞參數(shù)Hb 為171 g/L、MCV 為81.3 fL、MCH 為25.8 pg，均提示異常，血紅蛋白升高，MCV、MCH 輕度降低。血紅蛋白電泳分析HbA為98.06%，HbA2為1.94%，提示HbA2低于正常參考范圍，基因型為Fusion gene/αα。

2.2 地中海貧血基因常規(guī)檢測結果 PCR-導流雜交法在-α4.2突變位點見弱顯影，顯色程度淡，(圖1A)，反向點雜交法進行驗證時見-α4.2突變位點顯影明顯，呈強顯影(圖1B)，gap-PCR法未出現(xiàn)-α4.2缺失型陽性電泳條帶(1 400 bp)，即為-α4.2陰性(圖2A)，但在750～1 000 bp 區(qū)域可見融合基因條帶(圖2B)。

圖2 gap-PCR法檢測地中海貧血基因圖Figure 2 Detection of thalassemia genes by gap-PCR

2.3 高通量測序結果 檢測出nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C7 個融合基因突變位置，見圖3。

圖3 高通量測序融合基因位置圖Figure 3 Fusion gene locations by high-throughput sequencing

3 討論

3.1 地中海貧血融合基因形成過程 融合基因是指將兩個或兩個以上基因的編碼區(qū)首尾相連并置于同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下構成的嵌合基因。有研究發(fā)現(xiàn)，α2珠蛋白融合基因的形成是在減數(shù)分裂過程中，α2珠蛋白基因與Ψα1 發(fā)生了不同程度片段重組[5-6]，使α2珠蛋白基因的3'UTR改變導致大量α2珠蛋白基因轉錄本產(chǎn)生，引起α+-地中海貧血。

3.2 融合基因地中海貧血臨床表現(xiàn) 本研究中發(fā)現(xiàn)融合基因地中海貧血基因型為Fusion gene/αα，為雜合子狀態(tài)，血液表型存在輕度異常，但患者未出現(xiàn)貧血的癥狀及體征，表明由α2珠蛋白融合基因引起的α+-地中海貧血為靜止型，無需治療。在當融合基因和其他基因位點發(fā)生突變時，可能會造成不良結局。Huang等[5]的研究顯示α2珠蛋白融合基因合并--SEA時，可引起Hb H 病，引起慢性溶血性貧血，余文芳[7]的研究也證明了這一結果。慢性溶血性貧血可能是由于HbH對氧的親和力較HbA明顯增加，失去了正常的運氧功能進而出現(xiàn)溶血造成的。胡俊杰等[2]的研究表明α2珠蛋白融合基因伴有-α4.2缺失的患者呈小細胞低色素貧血表型，即MCV (68.1 fL)、MCH (20.5 pg)和Hb(115 g/L)均降低。然而在α2珠蛋白融合基因合并β41-42突變的患者則并沒有貧血(Hb 147 g/L)，僅表現(xiàn)為MCV(69.4 fL)及MCH(21 pg)的降低[5]。盡管融合基因的存在不是造成地中海貧血的決定性因素，但在地中海貧血基因篩查和基因診斷中不應忽視α2珠蛋白融合基因。

3.3 融合基因地中海貧血檢測方法α2珠蛋白融合基因為α+-地中海貧血基因，攜帶者表型通常為靜止型，未引起臨床醫(yī)生重視，這是導致其獻報道相對較少的原因之一[2，5，8-9]，也是導致臨床在地中海貧血基因篩查和診斷中未將其納入檢測位點范圍的原因之一，導致α2珠蛋白融合基因的檢出率低。因此，α2珠蛋白融合基因篩查和診斷具有一定的挑戰(zhàn)性。

PCR-導流雜交法與反向點-雜交法主要用于檢測α-地中海貧血基因--SEA、-α3.7和-α4.2三種缺失以及QS、CS 和WS 3 種點突變。而gap-PCR 法主要用于檢測--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAⅠ4 種缺失型α-地中海貧血基因，以及融合基因的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)，用PCR-導流雜交法檢測時，在-α4.2突變位點有弱顯影，反向點雜交法復核時，-α4.2突變位點呈強顯影，但經(jīng)α-地中海貧血gap-PCR試劑盒驗證時，未出現(xiàn)-α4.2缺失型陽性電泳條帶，進一步檢測融合基因，出現(xiàn)融合基因陽性電泳條帶。通過高通量測序技術顯示7 個差異堿基位點(nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C)，通過BLAST 對該同源序列進行比對顯示為α2珠蛋白融合基因。2021 年鞠愛萍[8]報道了廣州市2 例α2珠蛋白融合基因樣本通過gap-PCR、PCR-導流雜交法以及Sanger 測序技術，與本研究的結果基本一致。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在臨床中通過常規(guī)PCR-導流雜交法可能會誤判為-α4.2雜合子，當發(fā)生實驗結果弱顯影時不推薦進行反向點雜交法進行驗證，會導致-α4.2假陽性，可通過gap-PCR進行驗證或者通過基因測序來驗證是否為α2珠蛋白融合基因。Ju等[10]通過對α2珠蛋白融合基因進行基于實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR)的多色熔融曲線分析(multicolor melting curve analysis，MMCA)、常規(guī)gap-PCR、多重連接依賴性探針擴增技術、DNA 測序技術的檢測對比，發(fā)現(xiàn)基于qPCR 的MMCA 可以準確的檢測到α2珠蛋白融合基因?？傊瑢τ讦?珠蛋白融合基因的檢測方法有gap-PCR、基于qPCR 的MMCA、DNA 測序技術(包括sanger 測序及高通量測序技術)。目前的研究表明在該研究中發(fā)現(xiàn)了7 個差異堿基位點(nt34527T＞C、nt34531A＞C、nt34534G＞A、nt34537C＞A、nt34545G＞A、nt34555A＞G、nt34561T＞C)，Huang 等[5]的研究顯示出有七個突變位點(nt 284 C、nt 288 C、nt 291 A、nt 294 A、nt 302 G 和nt 308 C)，而在Ju 等[10]的研究中有8 個堿基發(fā)生了置換，胡俊杰等[2]在黎族人中利用α-珠蛋白基因測序技術研究顯示α2基因有8 個保守的堿基(nt875C、nt879C、nt882A、nt885A、nt893 A、nt903 G、nt909 C、nt918 G)發(fā)生堿基置換，這也驗證了α2珠蛋白基因可以發(fā)生不同程度的同源重組。通過本研究發(fā)現(xiàn)，在臨床中常規(guī)的檢測方法為-α4.2雜合子，即當發(fā)生實驗結果弱顯影或者強顯影時均需通過基因測序來驗證是否為α2珠蛋白融合基因，以此提高罕見基因突變的診斷率及精準醫(yī)學的精準診斷。