李兆英,歐陽愷昱,胡 葉,顏 菁,仝雨欣,易 好

(陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院,陜西 西安 710100)

草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是重要的農業(yè)害蟲,食性雜、分布廣、適應性和遷飛能力極強。其幼蟲主要以玉米、小麥、水稻、甘蔗等多種農作物為食,從2019年在我國云南首次發(fā)現后,現已擴散至我國的大部分省市,給農業(yè)生產造成了巨大的損失[1]。

為了有效防治草地貪夜蛾,國內研究者進行了大量的工作。魯艷輝等比較了氯蟲苯甲酰胺等6種不同化學殺蟲劑對草地貪夜蛾幼蟲的生物活性[2],為草地貪夜蛾的化學防控提供了參考。但是因為化學農藥對環(huán)境的影響以及草地貪夜蛾的抗性提高[3],更多的研究者在嘗試使用生物防治,如天敵昆蟲[4]、昆蟲病原線蟲[5]、病原微生物[6-7]等。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)簡稱為白僵菌,屬于絲孢類昆蟲病原真菌,致病性強,寄主范圍極其寬泛,現已廣泛應用于各種農林害蟲,如玉米螟(Ostriniafurnacalis)[8]、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[9]等的防治,并取得了良好的防治效果。白僵菌可以通過接觸昆蟲的體壁、節(jié)間膜、氣孔等侵染宿主,也可以在昆蟲進食、呼吸時,通過消化道、呼吸道等內部途徑侵入[10]。在適宜的溫度和濕度條件下,白僵菌分生孢子分泌各種胞外酶,并借助機械壓力穿透宿主體壁,進入體腔形成菌絲[11];菌絲依賴昆蟲血腔中的養(yǎng)分不斷地生長、繁殖,并侵染昆蟲的脂肪體、肌肉以及消化、呼吸系統等各個組織、器官;此外菌絲在生長過程中還會分泌各種毒素以及代謝產物,造成昆蟲的生理及代謝功能紊亂,最終死亡[12]。

本研究通過室內毒力測定以及石蠟切片和HE染色技術,研究白僵菌對草地貪夜蛾的毒力以及致病機理,為使用生物農藥白僵菌防治草地貪夜蛾以及明確病原真菌同昆蟲宿主之間的相互作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及昆蟲

供試球孢白僵菌購自鹽城市神威微生物菌種科技有限公司(8089508)。可濕性粉劑有效成分含量為200億孢子/g。供試草地貪夜蛾為室內人工飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件為溫度26±1 ℃,相對濕度70%～80%。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液制備

將稱量好的1 g球孢白僵菌粉刮入含有19 mL 0.05% Tween-80潤濕劑和100 mL蒸餾水的三角瓶中,在恒溫(26 ℃)磁力攪拌器上充分振蕩10～30 min,待分生孢子粉被完全打散后,用滴管吸取少量菌液滴入血球計數板中,測定孢子濃度,然后按照比例稀釋配制成1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109孢子/mL的孢子懸浮液。

1.2.2 球孢白僵菌對草地貪夜蛾的毒力測定

選取體型一致,生長健康且活動正常的3齡幼蟲200頭,集中稱重后計算平均體重,并測量體長,放入5個已加有飼料的蟲盒中,每個蟲盒40頭。將配置好的4種不同濃度的菌液均勻噴施于4個蟲盒中的蟲體及飼料上。對照蟲盒中不噴施菌液。所有處理均置于適合白僵菌生長的溫度(26±1 ℃)下,對照和各處理均重復3次。每隔24 h測量試蟲的體重和體長,并記錄幼蟲死亡數量、存活數量和死亡日期。

1.2.3 組織切片

取40頭健康草地貪夜蛾3齡幼蟲,置于加有飼料的蟲盒,噴施1.0×108孢子/mL菌液。每隔24 h觀察幼蟲癥狀,并選擇感染癥狀明顯的試蟲5頭,立即用多聚甲醛4 ℃固定過夜。梯度酒精75%、80%、90%、95%和100%脫水;二甲苯透明;石蠟包埋;橫向連續(xù)切片,切片厚度7 μm,切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,烘干備用;切片脫蠟后復水,蘇木精、伊紅染色;顯微攝影系統(Leica DM750)觀察拍照。

1.3 數據統計方法

生物測定數據采用SPSS27.0統計軟件進行數據統計分析,應用one-way ANOVA方差分析進行差異顯著性檢驗。采用Excel軟件繪制圖形,計算死亡率、校正死亡率。

死亡率(%)=死亡蟲數/處理總蟲數×100

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100

進行回歸分析,建立毒力回歸模型,分別計算劑量效應致死中濃度LC50值、致死中時間LT50值和相關系數(R)等參數。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌侵染草地貪夜蛾幼蟲的毒力測定

從表1可以看出,球孢白僵菌對草地貪夜蛾的殺蟲活性同孢子的濃度有關。因濃度為1.0×106孢子/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液對草地貪夜蛾幼蟲的死亡率幾乎無影響,故未列出。而濃度為1.0×107和1.0×108孢子/mL的白僵菌在第6 d后對草地貪夜蛾幼蟲的死亡率>50%;第9 d時,草地貪夜蛾幼蟲的校正致死率>95%。其中1.0×109孢子/mL的幼蟲死亡率低于其它兩個濃度處理。分析LT50發(fā)現,1.0×108孢子/mL致死時間最短。綜合死亡率還是致死時間分析,1.0×108孢子/mL的殺蟲效果最佳;而1.0×107孢子/mL的殺蟲效果同1.0×108孢子/mL接近;但是最大濃度(1.0×109孢子/mL)菌液的殺蟲效果并不理想。

表1 不同濃度球孢白僵菌對草地貪夜蛾3齡幼蟲的室內毒力

從表2可以看出,隨著處理時間的延長,LC50值呈下降趨勢,接菌后5～7 d,LC50值由1.4×109孢子/mL 降低到8.1×106孢子/mL,第9 d的LC50值僅為5 d時的0.32%。

表2 球孢白僵菌對草地貪夜蛾3齡幼蟲的致死中濃度

由圖1可以看出,除菌液濃度為1.0×106孢子/mL處理的草地貪夜蛾3齡幼蟲,其在發(fā)育早期(3～5 d),體重和體長略大于正常個體外,其余幼蟲的體重和體長均小于正常個體。其中,高濃度菌液(1.0×109孢子/mL)對個體的發(fā)育影響尤其明顯,其體重和體長都顯著小于正常個體;處理2～3 d后,幼蟲體色發(fā)黑、僵硬,對觸碰反應遲鈍,發(fā)育基本停滯。

圖A,B中數據為平均數±標準誤,柱上不同小寫字母表示經LSD法檢驗在0.05水平差異顯著。圖1 草地貪夜蛾3齡幼蟲平均體重(A)和平均體長(B)隨接種時間變化圖

2.2 球孢白僵菌侵染草地貪夜蛾幼蟲的組織病理學變化

正常草地貪夜蛾的體壁由表皮層(cuticle)、真皮細胞層(epidermis)和基膜(basement membrane)組成,表皮層較薄,分層不明顯(圖2,B)。體壁下的脂肪體呈帶狀,脂肪體細胞略呈方形,排列整齊,胞核橢圓形;體壁肌由排列整齊的平行肌纖維組成(圖2,A,B);中腸圓筒形,其結構由外向內可分為縱肌(longitudinal muscle)、環(huán)肌(circular muscle)、基膜(basement membrane)、腸壁細胞(epithelium,腸上皮)和圍食膜(peritrophic membrane)。正常中腸腸壁結構完整,圓筒形的上皮細胞和杯狀細胞排列整齊,紋狀緣緊密而清晰;環(huán)肌和縱肌呈格子狀排列,規(guī)則而連續(xù)(圖2,A,C)。

A,B：健康草地貪夜蛾幼蟲的組織結構;C：健康草地貪夜蛾幼蟲中腸的組織結構;D,E：處理48 h草地貪夜蛾幼蟲的組織結構;F,G,H：處理96 h草地貪夜蛾幼蟲的組織結構;I：處理120 h草地貪夜蛾幼蟲的組織結構;J：處理120 h草地貪夜蛾中腸的組織結構;K：處理144 h草地貪夜蛾幼蟲的組織結構;L：處理144 h草地貪夜蛾中腸的組織結構.In：體壁;Cu：表皮;Ep：真皮;BM：基膜;IF：節(jié)間褶;Mu：肌肉;FB：脂肪體;Tr：氣管;VNC：腹神經索;MT：馬氏管;DBV：背血管;ME：中腸上皮;CM：環(huán)肌;LM：縱肌;PM：圍食膜;SB：紋狀緣;ML：腸腔;Sp：孢子;Hy：菌絲;Cy：包囊。圖2 白僵菌侵染草地貪夜蛾3齡幼蟲的組織病理變化

球孢白僵菌處理48 h后,可見大量的分生孢子附著在草地貪夜蛾幼蟲的體壁表面(圖2：D,E),但未見內部結構有明顯變化(圖2：D,E)。處理96 h后,菌絲突破表皮層,表皮層同真皮層分離,但是真皮細胞層和基膜依然連續(xù)(圖2：F,G,H);幼蟲會在體壁局部形成包囊,包裹真菌孢子(圖2：G);體壁下的脂肪體以及氣管、肌肉、中腸等組織結構完整,未見明顯的組織病變(圖1：H)。處理120 h后,幼蟲的體壁褶皺、斷裂,菌絲侵入體腔;壁脂肪體細胞分離;肌肉束松散(圖2：I);腸道內有真菌孢子出現,中腸上皮細胞層同肌肉層分離,局部上皮細胞排列變得疏松,細胞變形、間隙增加,紋狀緣脫落、變形;圍食膜崩潰;馬氏管變形、破裂(圖2：J)。處理144 h后,體壁崩潰,菌絲充滿體腔;壁脂肪體細胞空泡化;肌纖維松散、斷裂(圖1：K);中腸嚴重破壞,局部斷裂,上皮細胞排列雜亂且從底膜脫落,細胞溶解并出現空洞(圖2：L);試蟲個體開始死亡。

3 結論與討論

3.1 球孢白僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的毒力分析

球孢白僵菌侵染草地貪夜蛾3齡幼蟲時,白僵菌的孢子首先附著在幼蟲體壁表面,經過1～2 d的潛伏期,孢子萌發(fā),大量孢子布滿蟲體表面,后侵入蟲體。在侵染早期(1～2 d),幼蟲會出現興奮、觸碰逃竄等行為,到3 d以后,幼蟲蟲體發(fā)黑,僵硬、卷曲,并失去活力,行動遲緩,進食量減少,生長變得緩慢;6 d左右,試蟲開始死亡。

有研究表明,真菌在感染宿主時可能會遇到選擇壓力,因此會發(fā)展出操縱宿主行為的策略,如改變宿主的行為,包括取食行為、攻擊性、行為方式、運動活躍度、趨向性等[13]。然而,宿主行為變化并不一定都對寄生者有益,這也可能是宿主為了降低感染的病理副作用而形成的適應[13]。推測草地貪夜蛾幼蟲對不同濃度的菌液侵染采取不同的防御策略：對于較低濃度(1.0×106孢子/mL)的菌液,在處理早期(3～5 d),其幼蟲體重和體長都會略微大于正常個體。分析其原因,可能是外來致病真菌的刺激,誘導了幼蟲取食量的增加,導致幼蟲試圖通過加快生長發(fā)育速度,以增強抵抗力來降低侵害。而對于高濃度(1.0×109孢子/mL)的菌液,幼蟲停止進食,也基本停止生長發(fā)育,進入類似蟄伏的狀態(tài),這種策略會導致侵入者的營養(yǎng)不足;同時過高的菌種密度,導致種群內對營養(yǎng)和空間的競爭加劇,繁殖力下降;此外,高密度的菌種產生的過量的代謝物,也會抑制種群數量的再增加,從而降低對宿主的侵害,使真菌的殺蟲效率降低[14]。由此看來,在使用白僵菌來殺滅草地貪夜蛾時,要注意施用濃度：濃度過小,會刺激害蟲引起應激反應,短期內增加取食量,加大危害力度;而濃度過大,則會刺激害蟲進入蟄伏狀態(tài),且會造成菌種之間的競爭,降低殺蟲效率。應該根據致病菌的特點,尋找合理的施用濃度,以達到較好的防治效果。本研究表明,球孢白僵菌的濃度為1.0×108孢子/mL時殺蟲效果最好,推薦用于防治草地貪夜蛾。

室內毒力測定也表明,球孢白僵菌在適宜的條件下,分生孢子才更易于萌發(fā)和侵染,并表現出有效的毒力,其中濕度條件尤為關鍵,當濕度小于40%時,白僵菌的萌發(fā)效率明顯下降。所以在田間應用時,最好選在雨后等空氣濕度較大時噴施,效果最佳。當然,除了濕度之外,還應考慮到噴施時的溫度、光照等多種不同環(huán)境因素,應根據各地的不同環(huán)境條件具體考量[15]。

3.2 球孢白僵菌侵染對昆蟲幼蟲體壁的影響

昆蟲寄生真菌可通過體壁、節(jié)間膜、消化道、呼吸道等途徑感染宿主,其中體壁是入侵的主要方式之一,而宿主體表的結構特征對昆蟲真菌的侵染行為和致病性有著重要的影響[16]。昆蟲成蟲,其體壁大部分骨化,節(jié)間褶前有一條未骨化的膜質區(qū)——節(jié)間膜,成為體節(jié)之間的分界,而這里連同昆蟲的足和頭部,成為病原真菌體壁侵染的薄弱點[17]。王曉紅等通過掃描電鏡觀察白僵菌侵染桑天牛Aprionagermari幼蟲體表的過程發(fā)現,幼蟲體表的節(jié)間膜成為白僵菌侵入的薄弱區(qū)[18]。本研究結果顯示,因昆蟲幼蟲和成蟲體壁構造的差異,幼蟲相鄰體節(jié)之間的環(huán)形凹陷,即節(jié)間褶(intersegmental fold)作為縱肌的附著點,表皮層會褶皺增厚,故這里并不利于真菌的侵入,而其侵入點一般會選在節(jié)間褶之間的平緩結構區(qū)里。此外,因幼蟲頭部的外骨骼高度幾丁質化,白僵菌也很少從這里侵入。

在白僵菌對草地貪夜蛾幼蟲的侵染過程中,在最初的兩天內,白僵菌分生孢子大量聚集在幼蟲體壁表面,沒有觀察到侵入的痕跡,幼蟲體壁的表皮層對真菌起到了第一層阻隔的作用。到第4 d左右,白僵菌侵染并分解表皮層,進入表皮層和真皮細胞層之間,但是真皮細胞層和基膜完整而連續(xù),對白僵菌起到了第二層阻隔的作用。真皮層和基膜很好地保護了幼蟲體腔內的脂肪體、肌肉和中腸等結構,阻擋了真菌對內部臟器的損傷;同時,幼蟲還形成了類似包囊的結構,包裹住真菌孢子,這些都明顯延緩了真菌對草地貪夜蛾的侵染速度。

林華峰等的研究發(fā)現,白僵菌在浸染松毛蟲Dendrolimuspunctatus時,會造成菌蟲表皮層的分層現象,真菌最先侵入內表皮,而上表皮和外表皮的褶皺、斷裂則是同體腔內脂肪體組織的變形、破裂以及肌肉的溶解同時發(fā)生[19]。但是在白僵菌侵染草地貪夜蛾體壁的過程中,并沒有看到表皮層明顯的分層現象,這可能是由于草地貪夜蛾的表皮層較薄,分層不明顯的緣故。而且,白僵菌是在破壞了體壁結構后,才侵入體腔進而侵染中腸等內部結構。同樣的現象也發(fā)生在白僵菌在對甜菜夜蛾幼蟲體壁的侵染過程中,在處理的第3 d左右,真菌完全侵蝕了表皮層結構,并沿著表皮層區(qū)域形成了一層真菌帶,隨后開始侵染真皮層和基膜(數據未發(fā)表)。由此看來,白僵菌對于不同昆蟲種類的侵染過程存在差異,這可能同昆蟲體壁的厚度及結構差異有關,對于體壁較厚的昆蟲,如松毛蟲、蠐螬等,白僵菌會采用侵入釘(infection peg)的方式來突破堅硬的上表皮和外表皮,直接侵染表皮層中最軟的結構——內表皮,進而侵染體腔內臟器;而對于如草地貪夜蛾以及甜菜夜蛾這樣體壁較薄的種類,白僵菌會在破環(huán)了體壁結構后,再入侵體腔。此外,這種現象的產生可能也同前述的真皮層和基膜對白僵菌的第二層阻隔作用有關,對侵染上表皮和外表皮同侵染真皮和基膜所花費的時間、營養(yǎng)等成本的差異,也會影響白僵菌的侵染方式。

3.3 球孢白僵菌侵染對昆蟲幼蟲中腸的影響

中腸作為昆蟲消化食物和吸收營養(yǎng)的主要場所,也成為各種微生物攻擊的目標。本研究結果表明,通過體壁侵入的白僵菌會在大約第5 d左右侵染到中腸肌肉層,造成腸壁肌纖維的松散、分離,但是腸壁上皮細胞基本完好。到大約第6 d后,菌絲侵入腸腔內,腸壁細胞以及肌肉層受到嚴重破壞,中腸組織崩潰,試蟲開始死亡。

研究表明,白僵菌在突破昆蟲體壁或消化道壁屏障進入昆蟲血腔后,以消耗宿主營養(yǎng)、干擾代謝、分泌毒素及破壞宿主組織結構等方式引起宿主死亡[10]。但是真菌致死昆蟲的主要原因,現在仍然存在爭議。一些研究者認為,白僵菌的侵入對寄主的組織器官沒有造成太大影響[20];但也有人認為,侵入者對宿主肌肉、脂肪體等的損傷是造成宿主死亡的主要原因[10]。本研究結果表明,白僵菌侵入草地貪夜蛾體壁后,對內部組織結構的影響隨著其的蔓延程度逐漸展開,但是相較于對中腸組織結構的破壞程度,對脂肪體以及肌肉的影響較慢,且不明顯,故認為白僵菌對草地貪夜蛾消化道的損傷是造成試蟲死亡的主要原因。孫魯娟和吳孔明在對白僵菌侵染棉鈴蟲H.armigera的研究結果也表明,在試蟲死亡前,只有體壁及腸壁細胞發(fā)生較明顯的病變,而其他大部分器官是在棉鈴蟲死亡后才遭到破壞的[21]。

昆蟲的血淋巴對進入體內的病原物會產生免疫反應,其免疫機制主要有血細胞的吞噬、成瘤和包被作用以及經誘導產生抗菌肽的殺菌作用,但是它們的防御機制并不能有效地抑制真菌的生長。同時侵入血淋巴的病原真菌可能會因為昆蟲血腔內部的天然防御反應,優(yōu)先入侵宿主的消化道,所以在實驗中可觀察到受感染的昆蟲幼蟲出現攝食抑制等現象,尤其是高濃度的真菌感染。同時,這也是宿主為了降低真菌的侵染力以及感染的病理副作用而形成的適應性反應。但是,隨著時間的延長,宿主的生理應激(饑餓、營養(yǎng)消耗和入侵真菌產生毒素等)以及防御機制會逐漸失效,最終導致宿主死亡[22]。

病原真菌同宿主之間的相互作用、相互斗爭是一個漫長而復雜的過程,對于病原真菌對昆蟲的致病機理已有研究,但是還有許多問題迄待解決。對于白僵菌對草地貪夜蛾致病機理的深入研究,既可為草地貪夜蛾的防治提供科學依據,也可為進一步挖掘白僵菌的應用潛能提供參考。