雷 艷,金鄭寶,詹世淮,王佳偉,孫春萍,張勝行

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院,福建 福州 350000)

乙型肝炎(簡稱乙肝)病毒(HBV)感染仍然是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題,目前HBV感染所致的肝硬化與肝癌是第十大死亡原因[1]。在過去的30年,得益于乙肝疫苗的接種,HBV表面抗原(HBsAg)的陽性率從1992年的約9.75%降至2014年的不到3.00%[2],然而基于中國人口眾多,仍約有8 000萬人HBsAg陽性。乙肝病毒DNA是病毒存在的直接依據(jù),HBV DNA是病毒復制的標志。按照ISO15189《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則》要求,同一臨床PCR實驗室采用不同儀器進行同一項目的檢測,應比對實驗檢驗結果的一致性[3]。本文按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)EP9-A3的文件要求[3],對實驗室ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx定量PCR儀檢測HBV DNA定量結果進行比對和偏移評估,評價其檢測結果的一致性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

參加并通過國家衛(wèi)生部室間質評的ABI-7500 PCR儀為參比儀器,ABI-ViiA7 Dx熒光定量PCR儀為實驗儀器。其他儀器包括:H-100型恒溫金屬浴、Sigma1-16K高速冷凍離心機、湖南湘儀有限公司CTK80自動脫蓋離心機、北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司CLASS Ⅱ TYPE B2生物安全柜。

1.1.2 試劑

中山大學達安基因診斷公司提供的HBV DNA核酸定量檢測試劑(批號為2021013);標準品、陰性對照品、陽性對照品試劑盒自帶;廣州邦德盛生物技術有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒DNA低值S2和中值S4標準質控品(批號為:2021001)。

1.1.3 標本來源

收集本院2021年4月份門診和住院患者中無溶血、脂血、黃疸的新鮮血漿樣本,選取40份ABI-7500熒光定量PCR儀檢測過的HBV DNA陽性血漿樣本分裝于1.5 mL EP管中,放于-20 ℃冰箱備用。HBV DNA濃度分布覆蓋整個線性范圍(102～108IU/mL)。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA核酸提取與擴增

1.5 mL EP管中加入450 L DNA提取液,4 μL內(nèi)標和200 μL經(jīng)3 500 r/min離心5 min后的臨床乙肝血漿樣本,振蕩混勻后置于100 ℃金屬浴10 min,12 000 r/min高速離心5 min,DNA上清備用。每次檢測均加入乙肝標準品(濃度2×103～2×106IU/mL)、陰性質控品、空白以及邦德盛公司的強陽性和弱陽性質控品。緩慢吸取離心過的20 μL DNA上清液加入反應管中,瞬時離心后放入PCR Ⅲ區(qū)的熒光定量PCR儀上擴增。

1.2.2 比對方法

按照NCCLS EP9-A3的文件建議,每天檢測10份樣本,連續(xù)檢測4 d,每份樣本均進行雙孔平行測定。擴增結束后將兩次測定結果轉化為10的對數(shù),取其平均值進行儀器間的比對分析。通過計算線性回歸方程、顯著性分析和相對偏倚進行HBV DNA結果比對。

1.3 統(tǒng)計學方法

1.3.1 離群值檢驗

按NCCLS EP9-A3文件進行離群值檢驗,將所有檢測結果進行對數(shù)轉化,以40份血漿樣本在兩臺儀器上測定差值的平均值的4倍作為離群值的判斷限,所有差值都在判斷限內(nèi)則無離群值。

1.3.2 兩臺儀器結果一致性分析

設定ABI-7500 PCR儀測定的濃度對數(shù)值為X值,在ABI-ViiA7 Dx上測定的濃度對數(shù)值為Y值,計算線性回歸方程:YABI-ViiA7Dx=aXABI-7500+b,并采用配對t檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.3.3 計算不同儀器的相對偏倚

將兩臺儀器兩次重復測定HBV DNA結果轉化為10的對數(shù),分別計算兩臺儀器上檢測結果的平均值,相對偏倚(%)=(ABI-ViiA7 Dx檢測結果均值-ABI-7500檢測結果均值)/ABI-7500檢測結果均值×100%,相對偏倚<±7.5%則在臨床檢測結果可接受范圍內(nèi)[4]。

2 結 果

2.1 離群值檢驗

ABI-7500差值的平均值為X′=0.123 6,ABI-ViiA7 Dx差值的平均值為Y′=0.186 5,離群值判斷限為0.494 4和0.746 0,結果表明兩臺儀器檢測HBV DNA的定量值均無離群(見圖1)。

圖1 40份臨床標本濃度離群值

2.2 兩臺儀器間結果比較

對兩臺儀器測定的40份臨床樣本的HBV DNA定量結果配對t檢驗分析可知P=0.256,P>0.05,差異無統(tǒng)計學意義,表明ABI-7500與ABI-ViiA7測定HBV DNA定量結果具有良好的一致性,符合臨床檢測的需要。

2.3 兩臺儀器結果一致性的比較

以ABI-7500檢測結果的對數(shù)值為X軸,以ABI-ViiA7 Dx檢測結果的對數(shù)值為Y軸,兩儀器檢測結果的線性回歸方程為YViiA7=0.998X7500+0.039 2(見圖2),r2=0.9919,r2>0.980,表明ABI-7500與ABI-ViiA7 Dx檢測HBV DNA的結果具有良好的相關性。

圖2 ABI-7500與ABI-ViiA7測定HBV DNA結果的一致性

2.4 計算相對偏倚

在兩臺定量PCR儀上測定的40份血漿樣本HBV DNA,相對偏倚均<±7.5%,符合ISO15189對臨床基因擴增檢驗實驗室內(nèi)檢測系統(tǒng)比對的標準要求,表明兩臺儀器均能用于HBV DNA定量檢測。

3 討 論

PCR技術自1985年由Kary Mullis開發(fā)以來,其在核酸檢測系統(tǒng)中的應用徹底改變了DNA和RNA的定量分析。熒光定量PCR法檢測HBV能夠衡量患者體內(nèi)病毒DNA復制的活躍度及病毒載量的高低[4]。HBV DNA定量與肝炎病毒感染機體后疾病的進程密切相關,能反映患者體內(nèi)乙肝病毒的復制水平。HBV DNA陽性是患者具有傳染性的標志,DNA測定對乙肝兩對半起補充作用,還能判斷肝功能異常是否由病毒引起[5],可評價抗病毒藥物的療效以及判定預后。臨床上將經(jīng)干擾素或拉咪呋啶治療后HBV DNA值小于103copies/mL作為陰性或臨床治愈的標準[6]。HBV DNA可檢出隱匿性慢性乙型肝炎,對乙肝病毒的防治具有重要作用。在HBV DNA的定量檢測過程中,不同型號PCR儀的光路系統(tǒng)或溫度模塊具有差異,HBV DNA在不同儀器上的定量值會有一定的偏差。隨著新的實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒的增加,HBV DNA定量一直在不斷發(fā)展。Lall等[7]通過線性回歸的散點圖、精密度、靈敏度及最低檢測線等方面對不同定量試劑進行性能驗證。本研究表明兩臺不同型號的熒光定量PCR儀測定40份臨床血漿樣本均無離群值出現(xiàn);線性回歸方程結果顯示r2=0.991 9,r2>0.980,表明兩臺儀器HBV DNA定量結果具有良好的相關性;兩儀器HBV DNA定量結果的相對偏倚均<±7.5%,檢測結果具有良好的一致性。

綜上所述,ABI-7500和ABI-ViiA7 Dx可同時用于臨床HBV DNA定量檢測。