吳輝晶,安華明,2,魯 敏,2

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴陽,550025;2 貴州省果樹工程技術(shù)研究中心,貴陽,550025)

無刺1號(Rosaroxburghiif.eseiosaKu)是薔薇科薔薇屬植物,是刺梨(R.roxburghii)的變型[1-2],本實(shí)驗(yàn)室無刺1號是在貴州省黔西縣所采集的無刺刺梨資源[3-4],果實(shí)和葉片均具有較高的抗氧化能力[5-6],每100 g鮮果中維生素C含量為1 977.34 mg[7];因其果皮表面無肉眼可見的針狀刺,與其他刺梨品種有明顯的外觀差別,但通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)[8-9],無刺1號的果皮表面存在不同形態(tài)的表皮毛。目前已開發(fā)出無刺1號的特異分子標(biāo)記,可快速鑒別無刺1號及其后代中的無刺單株,進(jìn)而能縮短育種周期[10]。

無刺1號因果皮無刺,可作為重要的鮮食刺梨資源進(jìn)一步選育大果種質(zhì),同時(shí)也可適量推廣種植,有利于解決目前刺梨果實(shí)僅用作加工且品種單一的問題。刺梨目前較為常見的繁育方式為扦插繁殖,其繁殖速度相對較慢。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立無刺刺梨快繁體系,既可保持母本的優(yōu)良性狀,也可提高繁殖效率,有利于種質(zhì)資源的保存[11]和優(yōu)質(zhì)種苗繁育。本研究以無刺1號的帶腋芽莖段為材料,研究了其腋芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)、馴化移栽的情況,建立了無刺1號的離體快繁體系,加速種苗繁育進(jìn)程,從而促進(jìn)刺梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來自貴州省貴陽市貴州大學(xué)刺梨種質(zhì)資源圃,取其當(dāng)年生營養(yǎng)枝,帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 4—9月于晴天采集生長健壯、無病蟲害無刺1號當(dāng)年生營養(yǎng)枝為外植體,將采集的營養(yǎng)枝首先用流水快速沖洗10 min,再用洗潔精浸泡30 min,期間間斷晃動。用自來水沖洗干凈,無菌水漂洗3次置于廣口瓶中存放。然后在無菌操作臺用75%酒精進(jìn)行浸泡(15、30 s),再用升汞消毒(8、10、12 min),消毒時(shí)不斷搖動。消毒后用無菌水清洗4～6次,將莖段用無菌濾紙吸干表面水分,并剪去兩端褐化部分,單芽放入培養(yǎng)基中誘導(dǎo)。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 用MS作為基本培養(yǎng)基,蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂濃度為6 g/L,pH值為 5.8。采用正交實(shí)驗(yàn)的方法,對生長素NAA(0.1、0.2 mg/L)和細(xì)胞分裂素6-BA(0.5、1、1.5 、2.0、2.5、3.0 mg/L)濃度進(jìn)行篩選,將處理好的帶芽莖段接入培養(yǎng)基中,試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理,每個(gè)處理15瓶,每瓶放置外植體4枚,每個(gè)處理重復(fù)3次,培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將萌發(fā)適宜大小的腋芽從基部切掉,與外植體分離,去掉老化的組織后接種到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的6-BA 和NAA。每個(gè)處理接種15瓶,每瓶接種4個(gè)苗,每處理重復(fù)3次。每天觀察其生長情況,28 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)及再生芽生長狀況。培養(yǎng)中獲得的健壯芽苗進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 取株高1.5 cm 的植株進(jìn)行生根誘導(dǎo),以1/2 MS為基本培養(yǎng)基,蔗糖濃度20 g/L,分別添加不同濃度的IBA和活性炭。每個(gè)處理接種15瓶,每瓶中接種2個(gè)苗,每處理重復(fù)3次。40 d后觀察每個(gè)處理的生根情況,統(tǒng)計(jì)生根率,平均每株根條數(shù)。

1.2.5 移栽煉苗 將生根良好、生長健壯的無刺1號組培瓶苗從組織培養(yǎng)室中移至普通實(shí)驗(yàn)室或溫室大棚內(nèi),將瓶蓋揭開1/3的開度,放置2 d,小心從培養(yǎng)基中取出根部,用無菌水沖洗3～4次。然后用多菌靈浸泡1 h后,移入滅菌蛭石中,在塑料杯子上下覆蓋30 d后,將植株從塑料杯子中移栽至蛭石∶腐殖土∶珍珠巖= 1∶1 ∶1 的基質(zhì)中,并用小拱棚覆蓋,進(jìn)行煉苗。煉苗過程中,保證基質(zhì)有足夠的水分,并采取一定的遮光措施,結(jié)果其成活率達(dá)(87.74±12.43)%,長勢良好。煉苗結(jié)果見圖1。

注:A、B為煉苗1個(gè)月后的生長情況;C 為煉苗6個(gè)月后的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

污染率/%=污染的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

萌芽率/%=腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

褐化死亡率/%=腋芽不萌發(fā)及褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

增殖系數(shù)=有效芽數(shù)/接種芽數(shù)(有效芽為高度大于1 cm 的芽)。

生根率/%=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100。

平均每株根條數(shù)=生根植株的總根數(shù)/生根植株數(shù)。

移栽成活率/%=成活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100。

采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05),用Word 2020、 Exce1 2013制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)期對外植體污染率的影響

不同取材時(shí)間對污染率的影響見圖2,4—9月,外植體的污染率逐月增加。4月接種,污染率最低,僅為7.71%;5月和6月分別增至12.15%和19.46%;7月污染率急劇上升為4月的4.27倍;7—9月污染率繼續(xù)上升,9月污染率達(dá)最高,為46.81%,是4月的6.24倍。外植體基部與培養(yǎng)基接觸部分生出黑色毛狀霉菌,極易擴(kuò)散。所以,無刺1號刺梨莖段組培快繁的最佳取材時(shí)期是4—5月春季生長期。

注:圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(p<0.05)。

2.2 消毒方法對外植體污染率、褐化死亡率及萌發(fā)率的影響

污染率、褐化死亡率及萌發(fā)率是植物組織培養(yǎng)體系的建立的基礎(chǔ)。不同消毒方法對無刺1號外植體污染率、褐化死亡率及萌發(fā)率的影響見表1,當(dāng)酒精消毒時(shí)間一定時(shí),外植體污染率和萌發(fā)率隨著升汞消毒時(shí)間的增加基本呈下降趨勢,顯著性大體上逐漸降低;隨著0.1% HgCl2處理時(shí)間的延長,外植體的污染率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但與此同時(shí),由HgCl2自身引起的外植體褐化程度也逐漸加劇,當(dāng)處理時(shí)間為8 min時(shí),除去褐化死亡及污染的影響,外植體萌發(fā)率達(dá)到所有處理中最高值,為88.14%,但其污染率較高。外植體消毒滅菌的方法除萌發(fā)率外,還需考慮污染率及褐化死亡率兩個(gè)指標(biāo)的表現(xiàn)。綜合上述3個(gè)指標(biāo),篩選出最適宜無刺1號外植體消毒滅菌的方法為:先用75%酒精消毒30 s,無菌水沖洗3～4次,然后用0.1% HgCl2消毒10 min,無菌水沖洗5～6次。

表1 不同消毒方法對無刺1號外植體污染率、褐化死亡率及萌發(fā)率的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

無刺1號莖段培養(yǎng)9 d后腋芽開始萌發(fā),基部切口變膨大,不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對無刺1號莖段萌發(fā)的影響見表2。不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對無刺1號初代誘導(dǎo)培養(yǎng)的各處理間差異顯著,無刺1號的腋芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的增加,在NAA濃度為0.1 mg/L 時(shí),呈現(xiàn)為“低—高—低”,在NAA濃度為0.2 mg/L時(shí),逐漸降低。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí),隨NAA濃度的升高,6-BA的濃度為 2 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率呈現(xiàn)為逐步升高,當(dāng)6-BA濃度升至3 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率在逐漸降低;當(dāng)6-BA的濃度為2.5 mg/L、NAA 的濃度為0.1 mg/L時(shí) ,腋芽誘導(dǎo)率達(dá)到最高90.63%。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對腋芽誘導(dǎo)的影響

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽增殖的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽增殖的影響見表3。無刺1號在腋芽處誘導(dǎo)出不定芽,增殖現(xiàn)象普遍出現(xiàn)在腋芽處,隨著6-BA濃度增加,誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)量也隨之增多,其增殖系數(shù)明顯提高。但當(dāng)6-BA濃度增至3 mg/L時(shí),生長受阻,誘導(dǎo)出的不定芽開始減少,出現(xiàn)葉片黃化的現(xiàn)象。NAA濃度增高對增殖有一定的抑制作用,隨著其濃度上升愈傷組織不斷增多,而不定芽分化率降低,且出現(xiàn)較嚴(yán)重的葉黃化現(xiàn)象。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí),增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增大;當(dāng)NAA濃度為0.2 mg/L時(shí),增殖系數(shù)也隨6-BA濃度的增加而增大,但小于NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)的增殖系數(shù)。因此,無刺1號最佳增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為MS + 1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對無刺1號不定芽增殖的影響

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導(dǎo)生根的影響

取生長優(yōu)良的無菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng),生長過程見圖3。不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導(dǎo)生根的影響見表4。在無任何植物植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2 MS培養(yǎng)基上,也能長出根,但是自然生根率和平均單株根數(shù)均低。在培養(yǎng)基添加生長素IBA或活性炭,組培苗生根率、平均單株根數(shù)均顯著提高。IBA在低濃度下,植株的根數(shù)較少,當(dāng)IBA質(zhì)量濃度升高至0.3 mg/L時(shí),生根率達(dá)到最高,濃度繼續(xù)增加,生根率不再增長,反而略有下降。在加入適量活性炭后,對植株的生根率也有所提高。處理4與各處理間的生根率存在顯著差異,為87.30%,平均根數(shù)為2.74。綜上,無刺1號刺梨最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+活性炭 0.5 mg/L,生根效果良好。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對無刺1號誘導(dǎo)生根的影響

注:A. 莖段的芽誘導(dǎo);B.增殖培養(yǎng);C.生根培養(yǎng)。

3 討論與結(jié)論

外植體的污染問題對快繁體系的建立具有重要的影響,污染的控制主要存在在3個(gè)方面:外植體、培養(yǎng)基和人工操作[12]。其中外植體的污染是最復(fù)雜難控的,與取材的時(shí)間、部位等有極大的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)4—5月取樣,污染率較低,且顯著低于7—9月;此外,在刺槐[13]、豫楸[14]、藍(lán)莓[15]等植物的研究中表明外植體取材時(shí)期最佳均在4—5月,與本研究結(jié)果一致。前人研究表明,4—5月是新枝的旺盛期,時(shí)間較短,接觸的灰塵、細(xì)菌等較少,且春季溫度偏涼爽,細(xì)菌滋生較少[16-17]。在無刺1號組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中污染率與植物的生長發(fā)育時(shí)期及外界環(huán)境有關(guān),除取樣時(shí)間外,消毒方法對污染率也存在一定影響,周成城等[18]研究表明,酒精和升汞配合使用對外植體消毒效果更佳。本研究結(jié)果表明以無刺1號莖段為外植體的最佳消毒濃度及時(shí)間為75%酒精和1%升汞消毒30 s。其升汞消毒時(shí)間不宜過長,否則會影響腋芽的萌發(fā)、增大褐化死亡的數(shù)量,這與魯藝[19]、李瑞靜[20]、胡計(jì)紅[21]等研究結(jié)果基本一致。

初代培養(yǎng)中,本研究使用1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的2種濃度組合下的無刺1號萌發(fā)率低、腋芽萌發(fā)晚。有研究表明[22-24],添加KT、GA3后的莖段萌發(fā)有所提高,但筆者添加后萌發(fā)率仍然很低,且基部愈傷較大,萌發(fā)時(shí)間較長。在此基礎(chǔ)上,增大6-BA濃度至2.5 mg/L,其誘導(dǎo)率提高至90.63%,誘導(dǎo)率大幅提高且生長狀態(tài)良好,這與武榮華[25]、劉文竹[26]、梁崢[27]等研究結(jié)果一致。

在增殖培養(yǎng)階段,植物生長調(diào)節(jié)劑濃度范圍過高或過低都會影響外植體的生長。6-BA、NAA組合能有效促進(jìn)叢生芽形成,最高增殖系數(shù)為3.94。這一結(jié)果與不同品種刺梨的研究結(jié)果存在一定差異:王小平[28]培養(yǎng)刺梨的最高增殖系數(shù)為4.2,廖安紅[29]培養(yǎng)“貴農(nóng)5號”的最高增殖系數(shù)為2.58,李斌等[30]培養(yǎng)無籽刺梨的最高增殖系數(shù)為5.56。由此可知,適合不同刺梨及近緣種材料的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合是不同的,基因型之間的組織培養(yǎng)效果差異明顯。

在生根培養(yǎng)階段,前人研究表明無機(jī)離子減半有利于生根[31]。因此,本試驗(yàn)以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的IBA 展開試驗(yàn),在未添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上,其生根率較低,而在添加相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2MS生根培養(yǎng)基上,生根率隨植物生長調(diào)節(jié)劑的增加而升高。本實(shí)驗(yàn)中,以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L的培養(yǎng)基生根效果最好,該結(jié)果與月季“雪山”[32]、無籽刺梨[33]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外,本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)IBA在 0～0. 4 mg/L 濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增加,生根率和生根數(shù)均呈上升趨勢。因此,本研究認(rèn)為在生根培養(yǎng)過程中應(yīng)加入適量植物生長調(diào)節(jié)劑以增加其生根率與生根數(shù),但濃度不宜過高。