林杰鑫 張續(xù)業(yè) 嚴凌楠 許惠濱

摘 要：利用真空滲透法將改造過的包含綠色熒光蛋白（GFP）基因的pRHVnGFP載體轉(zhuǎn)入生菜組織中，研究生菜的瞬時轉(zhuǎn)化體系。通過對比不同的農(nóng)桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103，在相同條件下的轉(zhuǎn)化效率，以及相同的農(nóng)桿菌菌株在不同的侵染條件下的轉(zhuǎn)化效率，最終確定以農(nóng)桿菌LBA4404侵染生菜，菌液濃度OD600為0.5，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態(tài)60 s（重復3次），作為侵染條件，可以獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。

關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白；生菜；瞬時轉(zhuǎn)化體系；農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化效率

中圖分類號：S 636.2? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：0253-2301（2023）03-0040-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.03.007

Abstract： The modified pRHVnGFP vector containing the green fluorescent protein （GFP） gene was transformed into the lettuce tissue by using the vacuum infiltration method to study the transient transformation system of lettuce. By comparing the conversion efficiency of different Agrobacterium strains EHA105， LBA4404 and GV3103 under the same conditions， and the conversion efficiency of the same Agrobacterium strain under different infection conditions， the infection conditions were finally determined as follows： the lettuce was infected with Agrobacterium LBA4404， the concentration of bacterial suspension OD600 was 0.5， acetosyringone was not added， and the pressure state was maintained for 60 s （repeated 3 times） after vacuuming. Under these conditions， the highest conversion efficiency could be achieved.

Key words： Green fluorescent protein； Lettuce； Transient transformation system； Agrobacterium； Conversion efficiency

植物生物反應(yīng)器是利用植物體或植物細胞表達外源基因，從而生產(chǎn)具有藥用價值或行使重要功能的蛋白質(zhì)、抗體、多肽、脂類等的一種新型生物反應(yīng)器[1]。相比于傳統(tǒng)的利用發(fā)酵罐作為生物反應(yīng)器進行生產(chǎn)，將植物生物反應(yīng)器打造成植物工廠來進行生產(chǎn)，具有成本低、周期短且不易感染動物源病毒的優(yōu)點[2]。20世紀90年代以來，我國愈加重視植物生物反應(yīng)器的研究，從“九五”計劃時選擇“利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗和生物可降解塑料”等4個研究課題作為探索性項目予以資助，到“十二五”期間，國家863計劃在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域設(shè)置了“動植物生物反應(yīng)器”主題項目對該領(lǐng)域進行持續(xù)支持[3]?，F(xiàn)如今已利用植物生物反應(yīng)器成功生產(chǎn)各種抗原蛋白[4]。而在國外，植物生物反應(yīng)器更是研究熱門，2022年2月24日加拿大在全球范圍內(nèi)首次批準了其本土研制的植物源新冠疫苗，引起了國內(nèi)外研究者的轟動，再次證明了植物生物反應(yīng)器前景廣闊[5]。

鑒于植物作為藥物蛋白質(zhì)表達和生產(chǎn)系統(tǒng)的重要性，其相關(guān)研究已開展近30年，其中，多葉植物如煙草、擬南芥、生菜等，具有高生物量、可溶性蛋白含量高，生產(chǎn)過程無須經(jīng)歷開花階段的特點使其在生產(chǎn)口服性疫苗方面適合作為反應(yīng)器的宿主[6]。然而，即使植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白具有天然的生產(chǎn)優(yōu)勢，仍需占有整個生產(chǎn)成本超80%的下游加工成本[7]。已報道在瞬時表達系統(tǒng)的應(yīng)用中，目前利用煙草作為宿主表達外源蛋白的周期在7 d左右，但因為煙草本身的性質(zhì)，其下游蛋白提純費用高且效率低；而生菜中含有與煙草相比更少的尼古丁等有毒化學物質(zhì)，所以在生產(chǎn)外源蛋白并提純應(yīng)用中生菜更加具有可行性[8]。本研究將以綠色熒光蛋白（GFP）基因作為報告基因，利用農(nóng)桿菌滲透法對比不同農(nóng)桿菌以及相同農(nóng)桿菌不同侵染條件下生菜的瞬時轉(zhuǎn)化效率，進而優(yōu)化生菜瞬時轉(zhuǎn)化條件，為后續(xù)生菜作為宿主在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 以生菜作為受體材料，生菜來自福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所福清基地。

1.1.2 菌種及質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5α，農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404和GV3103以及穩(wěn)定表達載體pRHVnGFP 均由閩江學院地理與海洋學院海洋與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)實驗室保存。

1.2 試劑

限制性核酸內(nèi)切酶Pst I和EcoR V，T4 DNA Ligase均購自上海TakaRa公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；農(nóng)桿菌生長培養(yǎng)基LB、YEB（酵母提取物肉湯、5 g·L-1蔗糖、5 g·L-1胰蛋白胨、6 g·L-1酵母提取物、0.24 g·L-1 MgSO4，pH 7.2）以及滲透培養(yǎng)基（10 mol·L-1 MES，10 mol·L-1 MgSO4）均購自廈門泰京生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 載體構(gòu)建 以穩(wěn)定表達載體pRHVnGFP為基礎(chǔ)載體，利用限制性核酸內(nèi)切酶Pst I和EcoR V對pRHVnGFP載體進行雙酶切，利用同源重組的方法，將Ubipro啟動子替換為35spro啟動子。同源重組引物為pRHVcGFP35SF （agatcccccgaattactgcagGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTG） 和pRHVcGFP35SR（atcccactggatctggatatcAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG）； 同源末端擴增引物為pRHVnGFP35sF （agatcccccgaattactgcagGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTG）和pRHVnGFP35sR（gcccttgctcaccatgatatcAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTG）。在T4 DNA Ligase的作用下16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在添加50 mg·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基上篩選，挑取單菌落進行菌液PCR檢測；提取質(zhì)粒，用Pst I/EcoR V酶雙酶切對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。將鑒定正確的陽性菌株送往生工生物工程（上海）有限公司測序以驗證啟動子是否正確。

1.3.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 采用凍融法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404和GV3103菌株，培養(yǎng)于含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，并挑取單菌落進行PCR檢測。

1.3.3 不同農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化效率對比 分別挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404和GV3103菌株的單克隆接種到0.5 L添加抗生素的YEB液體培養(yǎng)基（50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素）。將接種的培養(yǎng)物在搖床（220 r·min-1）中以28℃孵育48 h。通過添加YEB培養(yǎng)基測量OD600值并調(diào)節(jié)至3.5～4.5。然后收集培養(yǎng)液，離心（4500 r·min-1）10 min。將農(nóng)桿菌細胞重懸在滲透培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5。

將制備好的農(nóng)桿菌培養(yǎng)懸浮液置于2 L燒杯，置于干燥器中。用刀將前10%的生菜切除，將其倒置（核心向上）并輕輕地旋轉(zhuǎn)于細菌懸浮液中，并干燥器密封。將真空泵（Welch Vacuum，Niles，IL，USA）打開以抽空，保持壓力狀態(tài)30～60 s。然后打開該系統(tǒng)以釋放壓力，使?jié)B透液滲入組織內(nèi)的空間。該過程重復2～3次，直到清晰可見滲透液在生菜組織中有明顯擴散。然后將生菜組織從滲透液中輕輕取出，并用蒸餾水連續(xù)沖洗3次，轉(zhuǎn)移到塑料膜覆蓋的容器中。將處理的樣品在黑暗中保持4 d，利用 LUYOR3415RC手持熒光燈對eYGFP的表達量進行初步觀察分析并拍照記錄。

1.3.4 農(nóng)桿菌侵染條件優(yōu)化 在確定農(nóng)桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103的轉(zhuǎn)化效率以后，以轉(zhuǎn)化效率最高的農(nóng)桿菌菌株侵染生菜，優(yōu)化農(nóng)桿菌侵染條件，通過手持熒光燈對 eYGFP的表達量進行觀察分析并拍照記錄，最終確定最佳的農(nóng)桿菌侵染條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP基因的瞬時表達載體構(gòu)建

利用限制性核酸內(nèi)切酶Pst I和EcoR V對質(zhì)粒pRHVnGFP進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，與經(jīng)相同酶切后的35spro啟動子連接，將穩(wěn)定表達載體pRHVnGFP（圖1）的啟動子Ubipro替換為35spro啟動子，成功構(gòu)建1個GFP基因的瞬時表達載體（圖2）。

2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

利用35spro F/35spro R引物分別對轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105、LBA4404和GV3103感受態(tài)細胞的載體質(zhì)粒pRHVnGFP進行菌液PCR檢測（圖3），結(jié)果表明載體質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化3種農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，可用于后續(xù)生菜瞬時轉(zhuǎn)化。

2.3 不同農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的比較

由圖4可知，經(jīng)激發(fā)光照射在已轉(zhuǎn)化的生菜葉片區(qū)域可觀察到eYGFP 綠色熒光信號（圖 4b～d中紅色箭頭所示），紅色為自發(fā)熒光。通過對比發(fā)現(xiàn)，在相同的菌液濃度、真空滲透壓和滲透時間條件下，不同的農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA105和GV3103的轉(zhuǎn)化效率不同，其中，經(jīng)農(nóng)桿菌LBA4404侵染后生菜葉片上檢測到的eYGFP 綠色熒光信號最強（圖4b），EHA105次之，GV3103最低。

2.4 農(nóng)桿菌侵染條件優(yōu)化

由圖5可知，優(yōu)化農(nóng)桿菌LBA 4404真空滲透體系，以O(shè)D600為0.5的農(nóng)桿菌菌液，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態(tài)60 s（重復3次），作為侵染條件，這樣可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率（圖5b）。觀察經(jīng)激發(fā)光照射在已轉(zhuǎn)化的生菜葉片區(qū)域的eYGFP 綠色熒光信號（紅色箭頭所示），結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的eYGFP 綠色熒光信號，紅色為自發(fā)熒光。而常規(guī)侵染條件下觀察到的eYGFP 綠色熒光信號則較弱（圖5a）。

3 結(jié)論與討論

植物生物反應(yīng)器在表達系統(tǒng)的分類上可分為穩(wěn)定表達系統(tǒng)和瞬時表達系統(tǒng)。穩(wěn)定表達系統(tǒng)將外源基因?qū)胫参锛毎胁⑼瓿烧?，使其在生長過程中穩(wěn)定表達，周期長，且需要嚴格管理種植環(huán)境，但是對目標蛋白的表達穩(wěn)定。瞬時表達系統(tǒng)則是在外源基因?qū)胨拗骷毎螵毩⒂谒拗骷毎蚪M進行轉(zhuǎn)錄翻譯，完成外源蛋白的表達與積累，具有周期短、產(chǎn)量高和操作簡單的優(yōu)勢[9]。植物生物反應(yīng)器中兩種表達系統(tǒng)的目的都是完成對宿主細胞進行外源基因的導入，其中，穩(wěn)定表達系統(tǒng)在完成表達載體的構(gòu)建并進行穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)化之后，需在高要求條件下對轉(zhuǎn)化作物進行培育后才可收獲，成本高，周期長，對生產(chǎn)環(huán)境要求高易造成生物污染。而在瞬時表達系統(tǒng)中，可直接對已經(jīng)培育好的對應(yīng)農(nóng)作物或其離體葉片或愈傷組織進行病毒感染或農(nóng)桿菌浸染完成轉(zhuǎn)化，在幾小時或幾天內(nèi)完成目的蛋白的生產(chǎn)和積累，該過程完全在密閉容器中進行，最大限度杜絕了生物安全問題，并且只要完成表達載體的建庫即可做到相關(guān)蛋白的隨時有需求隨時可生產(chǎn)，且通過菌種的篩選以及培養(yǎng)濃度、侵染環(huán)境和侵染時間的調(diào)控還可提高瞬時轉(zhuǎn)化的效率[10]。研究還表明優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件時針對外源基因表達選擇適合的啟動子和增強子也可促進宿主植物中外源基因的表達，提高外源產(chǎn)物的產(chǎn)量[11]。

生菜為菊科萵苣屬的一個變種，不需要加工即可在人體或動物體內(nèi)的消化道中被有效吸收，且一年四季皆可收獲，培育條件簡單、生長周期短等特點奠定了其作為宿主在植物生物反應(yīng)器中應(yīng)用的巨大前景，其培育技術(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的成熟將大大降低其生產(chǎn)藥用蛋白的成本[12]。番茄、生菜和一些水果可生食，避免在加熱過程中使蛋白質(zhì)變性的特點已被廣泛用于生產(chǎn)食用疫苗的研究和開發(fā)當中[13-14]。當含有外源藥用蛋白的生菜以食用的方式使用時，可以極大程度減輕患者的精神壓力和經(jīng)濟壓力。目前生菜已經(jīng)成為一種非常高效，可重復，廉價的瞬時表達系統(tǒng)，可成功表達乙型肝炎amiRNA，小鼠食用后肝損傷得到了明顯逆轉(zhuǎn)[15]。未來生菜還將用于生產(chǎn)單克隆抗體和其他具有重要藥用價值的蛋白質(zhì)。

本研究以GFP基因為報告基因構(gòu)建一個植物瞬時表達載體，并利用農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化生菜構(gòu)建生菜瞬時表達系統(tǒng)，通過對比不同的農(nóng)桿菌菌株EHA105、LBA4404和GV3103的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)LBA4404最適合，轉(zhuǎn)化效率最高。在此基礎(chǔ)上，不斷優(yōu)化侵染條件，分別對比了3種農(nóng)桿菌菌液濃度（OD600分別為0.2、0.5和0.8），添加和不添加乙酰丁香酮，以及不同的真空滲透壓和滲透時間等條件下GFP 蛋白的表達情況，最終確定以O(shè)D600為0.5的農(nóng)桿菌LBA 4404，不添加乙酰丁香酮，抽真空并保持壓力狀態(tài)60 s（重復3次），作為侵染條件，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。完成生菜高效瞬時轉(zhuǎn)化體系條件優(yōu)化，能夠以生菜作為生物反應(yīng)器高效快速及時地表達外源蛋白，滿足生產(chǎn)需求。

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（責任編輯：柯文輝）