李逸軒 王逸瑋 周 靜 呂鵬飛 張 靜 龍文芳 許瓊軍 肖 莎 鄺仕成

1 海南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與全健康國際學(xué)院,Heinz Mehlhorn院士工作站,海南省海口市 571199;2 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科; 3 海南省人民醫(yī)院(海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院)藥學(xué)部

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上對(duì)于肺癌晚期的治療方法主要是化療和生物靶向治療,而鉑類藥物是常用的化療藥物之一,其抗腫瘤過程包括細(xì)胞攝取藥物、藥物水化/活化、鉑化DNA、細(xì)胞內(nèi)處理[2]。非編碼小分子RNA (microRNAs, miRNAs) 是真核生物中一類高度保守的長(zhǎng)21～25個(gè)核苷酸的小分子RNA,對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞繁殖、代謝、凋亡等生理過程發(fā)揮作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-SNP在評(píng)估腫瘤易感性和預(yù)后方面有著重要作用[4]。孫長(zhǎng)杰等[5]認(rèn)為miRNA多態(tài)有望提高腫瘤早期臨床檢出率。本研究選擇海南67例肺癌患者作為研究對(duì)象,采用質(zhì)譜法檢測(cè)血液樣品中12個(gè)miRNA-SNPs,分析比較miRNA-SNPs與肺癌鉑類藥物化療療效及生存情況的關(guān)聯(lián),為肺癌患者的早檢早治及提高預(yù)后等提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014年1月—2017年12月期間在海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院和海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院招募經(jīng)病理學(xué)診斷為腺癌、鱗癌、小細(xì)胞肺癌,且以接受鉑類藥物為主的患者作為研究對(duì)象,簽署知情同意書后收集其相關(guān)信息,并隨訪至2021年12月。鉑類藥物化療以3周為1個(gè)化療周期,2～3個(gè)化療周期后進(jìn)行療效評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)參照世界衛(wèi)生組織 (WHO) 的標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過海南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HYLL-2019-034號(hào))。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查 問卷調(diào)查內(nèi)容包括患者的人口基本信息(姓名、性別、年齡等)、吸煙情況(吸煙指數(shù)SI=每日吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、飲酒情況、家族腫瘤史、化療情況(鉑類藥物：化療周期、化療方案及化療效果等)及生存情況等。指標(biāo)定義：(1)吸煙情況：吸煙≥1支/d,且持續(xù)時(shí)間≥6個(gè)月,中度吸煙(SI≥400),不吸煙/輕度吸煙(SI<400)。(2)飲酒情況：飲酒≥3次/周,每次飲酒>50ml且持續(xù)時(shí)間≥ 6個(gè)月。(3)化療療效評(píng)價(jià)：依據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours,RECIST)[6]進(jìn)行評(píng)價(jià)。完全緩解 (CR)：所有目標(biāo)病灶消失,任何病理淋巴結(jié)(無論是目標(biāo)或非目標(biāo))的短軸必須減少到< 10mm。部分緩解 (PR)：目標(biāo)病灶直徑總和至少減少30%,以基線直徑總和為參考。進(jìn)展 (PD)：目標(biāo)病變直徑的總和至少增加20%,以研究中最小的總和作為參考(如果研究中最小,則包括基線總和)。除了相對(duì)增加20%外,總和還必須顯示絕對(duì)增加至少5mm。(一個(gè)或多個(gè)新病變的出現(xiàn)也被認(rèn)為是進(jìn)展)。穩(wěn)定 (SD)：既沒有足夠的收縮以符合PR,也沒有足夠的增加以符合PD,以研究中最小的總和直徑為參考。有效=CR+PR;無效=SD+PD?？傆行?(CR+PR)/總例數(shù)×100%。

1.3 DNA提取及其多態(tài)性分析 采用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管采集患者6ml外周靜脈血,4℃保存。DNA提取按照TaKaRa全血DNA試劑盒操作步驟進(jìn)行,委托上海生工生物工程股份有限公司采用質(zhì)譜法檢測(cè)11個(gè)miRNA-SNPs,結(jié)果均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用EpiData軟件對(duì)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)信息進(jìn)行雙人雙份錄入,Excel 2010整理導(dǎo)出數(shù)據(jù)表,應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢驗(yàn)不同miRNA基因型之間化療療效的差異運(yùn)用χ2檢驗(yàn)法,當(dāng)出現(xiàn)期望值<5時(shí)運(yùn)用Fisher’s精確概率法。通過多因素Logistic回歸分析對(duì)潛在的混雜因素如性別、年齡、吸煙、飲酒等因素進(jìn)行控制,得到校正P值、OR值及其95%CI。采用Kaplan-Meier方法計(jì)算總生存期 (Overall Survival),Logrank檢驗(yàn)對(duì)各基因型的生存率進(jìn)行了對(duì)比,Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估混雜因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況 67例肺癌患者中,男性占64.2%,女性占35.8%;年齡≥60歲占55.2%;中度吸煙占41.8%、飲酒者占25.4%;病理類型中腺癌占比最多,達(dá)49.3%。見表1。

表1 67例肺癌患者的基本情況

2.2 miRNA-SNPs與肺癌鉑類藥物化療療效的關(guān)聯(lián) 所納入病例經(jīng)化療后有效例數(shù)為22例,無效例數(shù)為45例。miRNA 608 (G>C) rs4919510位點(diǎn)CG+CC基因型和miRNA 27a (T>C) rs895819位點(diǎn)CT+CC基因型與化療療效明顯相關(guān) (分別為：OR=6.071,95%CI=1.259～29.286,P=0.025;OR=0.257,95%CI=0.081～0.818,P=0.021),且經(jīng)性別、年齡、吸煙、飲酒等混雜因素校正后,相關(guān)性仍存在 (分別為：OR=5.636,95%CI=1.114～28.527,P=0.037;OR=0.244,95%CI=0.072～0.824,P=0.023)。在校正性別、年齡、吸煙、飲酒等混雜因素后,miRNA 26a-1 (C>T) rs7372209位點(diǎn)TT基因型與化療療效相關(guān) (OR=13.519,95%CI=1.006～181.727,P=0.049)。見表2。

表2 miRNA-SNPs與肺癌鉑類藥物化療療效的關(guān)聯(lián)[n(%)]

2.3 miRNA-SNPs與肺癌生存率的關(guān)聯(lián) miRNA 608 rs4919510位點(diǎn)各基因型間,1年、3年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.596,P=0.008),其中,CC基因型1年、3年生存率分別為70%、30.0%,CG基因型分別為77.1%、60.5%,GG基因型分別為68.4%、26.3%;其他各miRNA-SNPs基因型與肺癌生存率間均無差異。見表3。

表3 miRNA-SNPs不同基因型與肺癌生存率的關(guān)聯(lián)[n(%)]

2.4 miRNA 608 (G>C)rs4919510位點(diǎn)不同基因型與OS的關(guān)聯(lián) 67例肺癌患者miRNA 608 (G>C) rs4919510位點(diǎn)不同基因型中,CC 基因型1年、5年生存率分別為70%、0.0%,CG 基因型分別為77.1%、7.9%,GG基因型分布為68.4%、0.0%;如圖1所示。但校正混雜因素,如性別、年齡、飲酒、吸煙后,構(gòu)建Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型,結(jié)果顯示CC、CG、GG三種基因型在2年后生存率出現(xiàn)明顯差異,GC基因型生存率相對(duì)較高,GG基因型生存率較低,但兩者間均無相關(guān)性。年齡<60歲、不飲酒患者的1年、5年生存率較高;而吸煙史對(duì)患者生存率影響較小。見表4。

圖1 miRNA 608 rs4919510位點(diǎn)的肺癌生存率a.GG、CG、CC的肺癌生存率 b.GG、CG+CC的肺癌生存率

表4 miRNA 608 rs4919510位點(diǎn)不同基因型與肺癌生存率的關(guān)聯(lián)[n(%)]

3 討論

鉑類藥物進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞后能夠識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞的DNA,形成 Pt-DNA加合物,影響部分DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。研究表明,人類基因組中約30%基因受miRNA調(diào)控,miRNA-SNP是導(dǎo)致藥物反應(yīng)性和疾病易感性的重要原因之一,從而影響基因功能[7]。

研究表明miRNA 196A2 rs11614913可影響肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[8],miRNA 27a rs895819與大腸癌關(guān)系密切[9],miRNA 146A rs2910164可降低乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[10]。本研究選擇的11個(gè)miRNA-SNPs與肺癌鉑類藥物化療療效的關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示,Logistic回歸分析miRNA 608 (G>C) rs4919510位點(diǎn)CG+CC基因型可顯著增加化療療效 (OR=6.071,95%CI=1.259～29.286,P=0.025),而miRNA 27a (T>C) rs895819位點(diǎn)CT+CC基因型的化療療效降低 (OR=0.257,95%CI=0.081～0.818,P=0.021)。Meta分析研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國人群中miRNA 608 rs4919510多態(tài)與肺癌發(fā)生相關(guān)聯(lián),CG vs CC的OR值為1.14 (95%CI=0.99～1.32)[11-13]。靳慶娥等[14]研究發(fā)現(xiàn)miRNA 27a rs895819 AG+GG基因型明顯增加非吸煙女性肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn) (OR=1.82,95%CI=1.01～3.28,P=0.038)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在校正性別、年齡、吸煙情況、飲酒情況后,miRNA 26a-1 rs7372209 TT基因型與化療療效也呈現(xiàn)相關(guān)性 (OR=13.519,95%CI=1.006～181.727,P=0.049),提示miRNA 26a-1 rs7372209位點(diǎn)突變型患者對(duì)鉑類藥物化療療效敏感。

鉑類化療藥物屬于細(xì)胞周期非特異性藥物,被廣泛應(yīng)用于肺癌、膀胱癌、卵巢癌、宮頸癌等常見惡性腫瘤的治療,其治療肺癌的有效率為15%～40%[15]。本研究中鉑類藥物治療肺癌的有效率為26.86%,進(jìn)一步對(duì)生存情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)miRNA 608 rs4919510位點(diǎn)各基因型間,1年、5年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=9.596,P=0.008),CG基因型患者的1年、5年生存率明顯較高;控制混雜因素性別、年齡、飲酒、吸煙后,GC基因型生存率相對(duì)較高,GG基因型生存率較低,但兩者間相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;年齡<60歲、不飲酒患者的1年、5年生存率較高,但吸煙史對(duì)患者生存率影響較小。

綜上,我們認(rèn)為miRNA 608(G>C) rs4919510、miRNA 26a-1 (C>T) rs7372209、miRNA 27a (T>C) rs895819位點(diǎn)多態(tài)會(huì)影響肺癌鉑類藥物的化療療效,其中,miRNA 608 (G>C) rs4919510位點(diǎn)多態(tài)可能會(huì)影響肺癌的生存率。但本研究存在樣本量較小、研究對(duì)象僅為海南人群等的問題,結(jié)論需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證,從而為肺癌患者鉑類藥物治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。