趙 婧 焦卓亞 王 娟 劉 璐 駢玉杰 王 丹

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室,山西省汾陽市 032200

環(huán)境顆粒物(Particulate matters,PM)是世界范圍內(nèi)主要公共健康問題,已有越來越多的流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)證實(shí),環(huán)境PM與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。不同類型的污染物在環(huán)境中通常共存[2],研究表明[3],PM的有害效應(yīng)是細(xì)顆粒物及其吸附的有毒污染物共同作用的結(jié)果,然而,更細(xì)的顆粒物和空氣污染物的聯(lián)合毒性仍然不清楚。納米二氧化硅(SiO2)廣泛存在于工業(yè)、醫(yī)藥和食品中[2],鎘(Cd)是一種廣泛分布的污染物[4],可能與環(huán)境中的納米SiO2共存。內(nèi)皮細(xì)胞功能的體外研究常使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)。因此,本文旨在研究納米SiO2和Cd對(duì)HUVECs的聯(lián)合暴露效應(yīng),通過評(píng)估HUVECs氧化損傷和DNA損傷來評(píng)價(jià)其聯(lián)合作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 HUVECs株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。納米SiO2(10～20nm,純度≥99.8%,杭州萬景新材料有限公司),氯化鎘(CdCl2)(西安化學(xué)試劑廠),活性氧(ROS)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)試劑盒(南京建城),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco,USA),單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試劑盒(Research Biolab,China)。所有其他化學(xué)品均屬分析級(jí),并可在市場(chǎng)上買到。多功能酶標(biāo)儀(BbiTeK,USA),CO2水套培養(yǎng)箱(Forma 3111,USA),臺(tái)式低溫離心機(jī)(eppendorf 5810R,GER),電泳儀、電泳槽(北京市六一儀器廠),熒光顯微鏡、熒光數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS,Japan)。

1.2 方法

1.2.1 納米SiO2和CdCl2的配制：用無菌三蒸水制備2mg/ml納米SiO2和50mmol/L CdCl2母液,高壓滅菌,在4℃環(huán)境中保存,使用前紫外照射30min,超聲處理15min,再將納米SiO2母液和CdCl2母液用培養(yǎng)液稀釋。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：HUVECs在添加10%滅活胎牛血清、青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱保存,然后收集對(duì)數(shù)生長階段的細(xì)胞,接種到96孔或24孔培養(yǎng)板,每孔150μl或1ml,接種密度5×104個(gè)/ml,24h后更換培養(yǎng)基,用PBS洗凈,然后每孔按總體積150μl或1ml添加指定的化學(xué)物質(zhì)。對(duì)照組(未添加任何藥物)、納米SiO2組(添加10μg/ml的納米SiO2)、CdCl2組(添加25μmol/L的CdCl2)、聯(lián)合組(添加10μg/ml的納米SiO2和25μmol/L的CdCl2)。各組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。以上濃度的設(shè)定都是建立在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的。每組均在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中放置24h,然后用于分析。

1.2.3 ROS水平測(cè)定：24h后,取出96孔培養(yǎng)板,PBS洗凈,加入100μl的DCFH-DA,37℃孵育30min,棄去培養(yǎng)液,無血清培養(yǎng)液潤洗3次,再將培養(yǎng)板置于多功能酶標(biāo)儀,對(duì)各組的DCF熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 SOD、GSH-Px活性和MDA含量的測(cè)定：24h后,取出24孔培養(yǎng)板,用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞,并在冰冷的RIPA裂解緩沖液中裂解30min。將裂解物按12 000r/min離心10min,收集上清液,并參照試劑盒說明書對(duì)SOD、GSH-Px活性及MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 DNA損傷測(cè)定： 24h后,用PBS洗凈,將10μl細(xì)胞懸液與90μl瓊脂糖混合,移至瓊脂糖包被的載玻片上,用蓋玻片遮蓋,在4℃下冷卻4min,將載玻片置于新鮮裂解液中,4℃避光2h,然后25V、300mA,電泳30min,用于DNA解鏈,載玻片用碘化丙啶(PI)染色后,再經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基于析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析,隨后進(jìn)行交互效應(yīng)和不同組間差異事后檢驗(yàn)。全部采用SAS8.2軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。臨界值設(shè)為P<0.05。

先通過雙因素方差分析得到F值和P值確定相互作用類型,然后比較因素A和B的聯(lián)合效應(yīng)(EA×B)和單獨(dú)效應(yīng)(EA或EB),相互作用類型判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)相加效應(yīng)：F<5,P>0.05,且EA×B>EA+EB;(2)協(xié)同效應(yīng)：F>5,P<0.05,且EA×B>EA+EB;(3)拮抗作用：F>5,P<0.05,且EA×B

2 結(jié)果

2.1 納米SiO2和Cd對(duì)細(xì)胞ROS生成的影響 納米SiO2組未觀察到ROS的顯著變化(見表1);與對(duì)照組相比,Cd暴露組或納米SiO2和Cd聯(lián)合暴露組的ROS生成增加,聯(lián)合暴露組的升高幅度更大。析因分析顯示,納米SiO2和Cd對(duì)細(xì)胞ROS生成有協(xié)同作用(F=107.896,P<0.01)。結(jié)果表明,納米SiO2的暴露使Cd的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。

表1 納米SiO2和Cd對(duì)HUVECs ROS生成的影響

2.2 納米SiO2和Cd對(duì)細(xì)胞SOD和GSH-Px活性的影響 SOD和GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶,其活性體現(xiàn)了細(xì)胞的酶促抗氧化能力。暴露于納米SiO2的細(xì)胞中觀察到SOD活性無顯著變化(見表2),然而,與對(duì)照組相比,暴露于Cd以及納米SiO2與Cd聯(lián)合暴露的細(xì)胞SOD活性顯著降低,與單獨(dú)暴露于Cd的細(xì)胞相比,在暴露于Cd和納米SiO2的細(xì)胞中觀察到更顯著的SOD活性降低。同樣,在暴露于Cd或納米SiO2與Cd組合的細(xì)胞中,GSH-Px活性顯著降低,在暴露于納米SiO2與Cd組合的細(xì)胞中觀察到最高的降低。結(jié)果表明,納米SiO2與Cd的聯(lián)合作用使得HUVECs的酶促抗氧化能力明顯下降。析因分析表明,納米SiO2與Cd相加作用導(dǎo)致SOD活性下降(F=1.956,P>0.05),納米SiO2與Cd協(xié)同作用導(dǎo)致GSH-Px活性下降(F=6.35,P<0.05)。

表2 納米SiO2和Cd對(duì)HUVECs SOD和GSH-Px活性的影響

2.3 納米SiO2和Cd對(duì)細(xì)胞MDA含量的影響 暴露于納米SiO2的細(xì)胞MDA含量并未觀察到顯著變化(見表3),但與對(duì)照組相比,暴露于Cd或納米SiO2與Cd聯(lián)合暴露的細(xì)胞MDA含量有明顯增加,最高的增加是在納米SiO2與Cd聯(lián)合暴露的細(xì)胞中觀察到的。析因分析表明,納米SiO2與Cd對(duì)MDA含量的增加具有相加作用(F=0.08,P>0.05)。

表3 納米SiO2和Cd對(duì)HUVECs MDA含量的影響

2.4 納米SiO2和Cd對(duì)細(xì)胞DNA損傷的影響 與對(duì)照細(xì)胞相比,暴露于納米SiO2對(duì)細(xì)胞DNA損傷無明顯影響(見表4),但Cd或納米SiO2與Cd聯(lián)合暴露均對(duì)細(xì)胞DNA損傷有明顯誘導(dǎo)作用,表現(xiàn)為明顯升高的OLIVE尾炬。納米SiO2和Cd聯(lián)合作用對(duì)HUVECs DNA損傷更嚴(yán)重。析因分析表明,DNA損傷是由納米SiO2和Cd之間的協(xié)同作用引起的(F=12.962,P<0.01)。

表4 納米SiO2和Cd對(duì)HUVECs DNA損傷的影響

3 討論

因?yàn)镻M組成復(fù)雜,吸入PM的生物反應(yīng)不僅取決于單個(gè)組分,還取決于其與附著組分之間的相互作用,PM及其吸附污染物的聯(lián)合暴露可能會(huì)影響污染物的單獨(dú)作用[5],因此需要對(duì)PM及其吸附的有毒污染物的聯(lián)合毒性進(jìn)行判定。本研究表明,納米SiO2和Cd可通過相加或協(xié)同作用增強(qiáng)HUVECs氧化應(yīng)激和DNA損傷。

PM可誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化損傷[6]。Cd具有誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、DNA損傷的作用[7]。本研究顯示,適度細(xì)胞毒性濃度的Cd誘導(dǎo)HUVECs氧化應(yīng)激和DNA損傷,如ROS生成增加、SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量增加以及DNA尾炬值增加;僅暴露于非細(xì)胞毒性濃度的納米SiO2對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡沒有顯著影響,然而,納米SiO2和Cd的聯(lián)合暴露顯著增強(qiáng)了氧化應(yīng)激和DNA損傷,表現(xiàn)為ROS生成和MDA含量升高幅度更大,SOD和GSH-Px活性降低幅度更大,DNA損傷更嚴(yán)重。

聯(lián)合暴露于不同的毒物組合,可產(chǎn)生相加作用、協(xié)同作用或拮抗作用[8]。本研究表明,納米SiO2與Cd聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)胞ROS生成、GSH-Px活性和DNA損傷具有協(xié)同效應(yīng),對(duì)SOD活性和MDA含量具有相加效應(yīng)。相關(guān)類似研究表明[9],將人肝臟細(xì)胞(HepG2)暴露于納米SiO2和砷的組合中,對(duì)ROS生成、SOD活性、DNA損傷產(chǎn)生相加作用,對(duì)MDA含量和GSH-Px活性產(chǎn)生協(xié)同作用。然而,目前尚不清楚非細(xì)胞毒性濃度的納米SiO2如何增強(qiáng)Cd對(duì)HUVECs的毒性,可能是由于納米SiO2促進(jìn)了Cd的積累。Zhang等[10]表明,在納米TiO2存在的情況下,鯉魚體內(nèi)Cd2+濃度增加了146%。Yu等[11]發(fā)現(xiàn),將A549細(xì)胞暴露在納米SiO2和甲基汞混合物中,細(xì)胞內(nèi)甲基汞濃度明顯高于單獨(dú)暴露于甲基汞的細(xì)胞,表明納米SiO2促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)甲基汞的攝取,這可能是暴露于納米SiO2和甲基汞組合后毒性增強(qiáng)的原因。一些研究報(bào)道[12],納米TiO2作為載體促進(jìn)Cd內(nèi)化進(jìn)入人肝癌和乳腺癌細(xì)胞。Limbach等[13]認(rèn)為,納米SiO2在暴露于納米SiO2和錳組合的細(xì)胞中起到“特洛伊木馬”的作用,這可能解釋了吸附在納米SiO2上的有毒分子更容易進(jìn)入細(xì)胞的原因。由于Cd的理化性質(zhì)與吸附在PM上的典型空氣污染物錳、汞相似,因此有理由推測(cè),更多的Cd可能通過納米SiO2的細(xì)胞內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞,納米SiO2可能起到載體或“特洛伊木馬”的作用,這可能促進(jìn)了Cd在HUVECs中的積累,導(dǎo)致氧化應(yīng)激和DNA損傷的增加。納米SiO2在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等的定位,除了增加細(xì)胞對(duì)Cd的攝取,還可能誘發(fā)細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的紊亂[14],誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS和后續(xù)的氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致納米SiO2誘導(dǎo)毒性的分子機(jī)制[15-16],所以,接下來我們要繼續(xù)探究納米SiO2細(xì)胞內(nèi)分布的是怎樣的。本研究顯示,非細(xì)胞毒性濃度的納米SiO2不影響細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡,然而,納米SiO2對(duì)細(xì)胞的潛在干擾可能使細(xì)胞對(duì)Cd的易感性增加。

綜上所述,非細(xì)胞毒性濃度的納米SiO2和細(xì)胞毒性濃度的Cd共同作用于HUVECs,可增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和DNA損傷,其細(xì)胞毒性作用是通過納米SiO2和Cd的相加或協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。納米SiO2作為載體的特殊理化特性,促進(jìn)了Cd在HUVECs中的積聚,從而加劇Cd誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損傷。更好地了解UFPs和空氣污染物的聯(lián)合毒性及其潛在毒性機(jī)制,有助于闡明暴露于PM的健康影響。