王 杰，周家武，李 靜，楊 鶯，浦秋紅，呂永剛，鄧先能，黃望啟，王 敏，張 玉**，陶大云**

(1.云南大學 資源植物研究院，云南 昆明 650500；2.云南省稻作遺傳改良重點實驗室，云南省農業(yè)科學院糧食作物研究所，云南 昆明 650200)

亞洲栽培稻(Oryza sativa)是世界上最重要的糧食作物之一，提供了全球近50%人口的主食來源，水稻增產對保障中國乃至世界的糧食安全和人民生活水平具有極其重要的作用[1].傳統(tǒng)上，亞洲栽培稻被劃分為秈稻和粳稻2 個亞種[2].這2 個亞種在形態(tài)特征、生理特性和遺傳基礎上表現(xiàn)出明顯的差異[3].隨著生物技術的發(fā)展和新的分子標記在亞洲栽培稻遺傳多樣性檢測上的應用，傳統(tǒng)的亞洲栽培稻的秈稻和粳稻分類得到了證實[4-11].亞洲栽培稻因適應不同地理、生態(tài)、耕作栽培方式而具有豐富的變異，普遍被劃分成5 個生態(tài)型：Aus稻(Aus)、芳香稻（aromatic）、秈稻（indica）、熱帶粳稻（tropicaljaponica）和溫帶粳稻（temperatejaponica）[12-15].亞種間遺傳距離較大，具有較強的雜種優(yōu)勢，是最有希望且能在較短時期內實現(xiàn)產量突破的途徑[16].由于亞種間雜種F1的花粉育性或（和）小穗育性較低，表現(xiàn)為不育或半不育，嚴重阻礙了亞種間雜種優(yōu)勢的利用.Kato 等[2,17]研究表明亞洲栽培稻亞種間雜種F1代育性變化范圍很大，從完全不育到完全可育，且亞種間雜種育性顯著低于亞種內雜種的育性，這一結論也得到了后續(xù)研究的支持[3,18-19].以雜種不育為主的生殖隔離是造成亞種間雜種育性低的主要原因.近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展和廣泛應用，已有超過50 個水稻雜種不育基因被定位，其中有10 個已經被克隆[20].一系列研究表明，不同雜交組合含有不同的雜種不育位點.例如Sa[21]、S5[22]、Sc[23]、HSA1[24]是在溫帶粳和秈稻雜交組合中檢測到的雜種不育基因座；DPL1和DPL2[25]等是在溫帶粳和Aus稻雜交組合中檢測到的雜種不育基因座；S7位點則為Aus稻和秈稻/粳稻雜交組合中發(fā)現(xiàn)的控制雜種雌配子育性的基因座[26].

生殖隔離尤其是雜種不育是生物種/群形成的重要指標，一直以來是生命科學領域的核心問題之一.目前雜種不育研究主要基于亞洲栽培稻秈、粳2 個亞種的少數(shù)組合之間，證實了秈、粳稻雜種不育的普遍性.基于分子標記、基因/基因組序列把亞洲栽培稻劃分為5 種生態(tài)類群/型，但缺乏生殖隔離的研究結果來驗證、支撐.本研究基于基因組研究成就，從生產實踐出發(fā)，既考慮到亞洲栽培稻以秈、粳為主，又考慮到亞洲栽培稻種內豐富的變異，選用國際水稻研究所篩選的19 份代表5 種不同生態(tài)類型的亞洲栽培稻作為父本，云南溫帶粳品種滇粳優(yōu)1 號及秈稻品種IR64 為母本，對雜種F1育性進行了系統(tǒng)全面的研究，為認識亞洲栽培稻分化分類和利用雜種優(yōu)勢提供參考.

表5 秈稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 花粉育性和小穗育性Tab.5 Pollen and spikelet fertility of F1 hybrids of japonica rice and Dianjingyu 1 and IR64,respectively

1 材料與方法

1.1 材料以云南溫帶粳稻滇粳優(yōu)1 號、國際水稻所選育的秈稻品種IR64 為母本，以國際水稻研究所（IRRI）篩選的19 份代表5 種不同生態(tài)類型的亞洲栽培稻為父本[13]，分別進行雜交（表1），配制F1組合.

表1 供試材料Tab.1 Test materials

1.2 方法試驗于2020 年在云南省農業(yè)科學院糧食作物研究所景洪試驗基地進行.21 份供試材料于早稻（1-6 月）種植，用于配制F1雜交組合；晚稻（6-11 月）種植親本及38 個F1雜交組合各10 株，常規(guī)栽培管理，調查花粉育性和小穗育性.

花粉育性調查：從單株主穗中上部的枝梗中，采集 5～10 朵發(fā)育成熟、于當天或次日即將開花的小花（枝梗末端的穎花），在70%的乙醇中固定.用1% I2-KI 溶液染色，在160×普通光學顯微鏡下觀察.根據(jù)花粉染色及形態(tài)判斷其育性，即大小正常、圓形黑褐色的花粉為可育，形狀不規(guī)則、黃色及不染色、或者染色但較小的花粉粒為不育.每份材料觀察3 個視野，且每個視野不少于300 ?；ǚ?花粉育性為可育花粉占總花粉粒數(shù)的比率.

小穗育性調查：植株成熟后，于每株3 個穗子中上部考察小穗受精粒數(shù).小穗育性為受精粒數(shù)占總粒數(shù)的百分比.

2 結果與分析

2.1 溫帶粳分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 育性分析由表2 可知，以滇粳優(yōu)1 號為母本，分別與4 個溫帶粳品種配組的雜交組合育性均表現(xiàn)正常.與父本比較，4 個雜交F1組合花粉育性均顯著性提高，小穗育性也有一定程度的升高.值得注意的是，與Nipponbare 相比，DJY1×Nipponbare 組合小穗育性由原來的74.82%升高到90.56%，差異極顯著.這種情況可能由于Nipponbare 是典型的長日照品種，適合在中國北方種植，而在云南景洪短日照自然條件下，表現(xiàn)為株高變矮，抽穗期提前且小穗育性下降.當與云南品種滇粳優(yōu)1 號雜交后，對光周期的敏感性降低，育性正常.以IR64 為母本，4 個溫帶粳品種為父本配制的組合育性差異較大.小穗育性變幅為19.27%～55.67%，花粉育性變幅為27.68%～70.59%.各F1雜交組合花粉育性和小穗育性情況也不相同.IR64×M202 組合表現(xiàn)為花粉育性可育，小穗育性半不育；IR64×Tainung 67 組合表現(xiàn)為花粉育性高不育，小穗育性半不育；IR64×Nipponbare、IR64×LTH 組合則均表現(xiàn)為花粉育性低不育，小穗育性高不育，但兩個組合育性均存在顯著性差異.

在父本相同的情況下，即同一溫帶粳品種在秈、粳不同背景下進行配組，育性存在明顯的差異，滇粳優(yōu)1 號×溫帶粳組合育性顯著高于與IR64×溫帶粳組合.

表2 溫帶粳分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 花粉育性和小穗育性Tab.2 Fertility of F1 pollen and spikelet of temperate japonica hybridized with Dianjingyou 1 and IR64,respectively

由此看出，溫帶粳與同屬于溫帶粳的滇粳優(yōu)1號之間遺傳距離較小，雜種育性正常.溫帶粳與秈稻IR64 之間普遍存在雜種不育，F(xiàn)1代育性變化范圍很大，從高不育到正?？捎?在母本同為IR64 的情況下，對花粉育性影響依次為：Tainung 67＞Nipponbare＞ LTH＞ M202,暗示IR64×Tainung 67 組合含有更多控制雜種花粉不育的基因.在4 個不同組合中，對小穗育性的影響依次為：LTH＞ Nipponbare＞ Tainung 67＞M202，表明IR64×LTH 組合中可能含有更多的控制小穗不育的基因.綜上所述，溫帶粳之間不存在雜種不育現(xiàn)象，而溫帶粳與秈稻普遍存在雜種不育現(xiàn)象，且雜種不育程度與雙親背景相關.

2.2 熱帶粳分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 育性分析由表3 可知，滇粳優(yōu)1 號與不同熱帶粳品種雜交的3 個F1組合育性普遍降低，且不育類型和不育程度各不相同.DJY1×Azucena 組合花粉和小穗均為高不育；DJY1×Moroberekan 組合花粉半不育，小穗正常可育；DJY1×Cypress 組合花粉為高不育，小穗為半不育.此外，3 個熱帶粳品種與IR64 雜交組合育性表現(xiàn)，和與滇粳優(yōu)1 號雜交組合表現(xiàn)不同.IR64×Azucena 組合育性均在80%以上，表現(xiàn)為花粉育性高于小穗育性.IR64×Cypress組合育性則均在85%以上，表現(xiàn)為花粉育性低于小穗育性.IR64×Moroberekan 組合花粉育性表現(xiàn)為半不育，小穗育性相比于父本Moroberekan（85.16%）升高顯著，為90.23%.

從表3 中可以發(fā)現(xiàn)，熱帶粳Azucena、Cypress與秈稻雜交F1育性顯著高于與粳稻雜交F1育性，表明這2 個品種與溫帶粳的育性障礙比與秈稻的育性障礙更為嚴重.熱帶粳Moroberekan 無論是與滇粳優(yōu)1 號還是與IR64 雜交，花粉育性均為半不育，而小穗育性均在90%以上，說明熱帶粳Moroberekan 與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交只影響雄配子育性.

綜上所述，溫帶粳滇粳優(yōu)1 號與3 個熱帶粳品種間普遍存在育性障礙，IR64 與所用的熱帶粳雜交，育性普遍正常.這為克服雜種不育利用強雜種優(yōu)勢提供思路和材料，但原因需要進一步的研究.

2.3 芳香稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 育性分析由表4 可知，芳香稻Dom sufid 分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1育性均不正常，且IR64×Dom Sufid 組合育性顯著高于DJY1×Dom Sufid.DJY1×DOM Sufid 組合花粉育性表現(xiàn)為高不育，為10.61%，小穗育性為34.93%.IR64×Dom Sufid 組合花粉育性為43.08%，小穗育性表現(xiàn)為半不育，為53.09%，說明與IR64 相比，Dom Sufid 與DJY1 的育性障礙更為嚴重，2 個雜交F1組合均為小穗育性高于花粉育性.以上結果表明，芳香稻與滇粳優(yōu)1號和IR64 均存在育性障礙.

表3 熱帶粳分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 花粉育性和小穗育性Tab.3 Pollen fertility and spikelet fertility of hybrid F1 of tropical japonica hybridized with Dianjingou 1 and IR64,respectively

表4 芳香稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 花粉育性和小穗育性Tab.4 Pollen fertility and spikelet fertility of hybrid F1 of aromatic rice and Dianjingyu 1 and IR64,respectively

2.4 秈稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 育性分析由表5 可知，不同秈稻品種與滇粳優(yōu)1 號普遍存在育性障礙.不同F(xiàn)1組合育性變化范圍很大，從完全不育到完全可育，花粉育性變幅在24.10%～68.39%，小穗育性則變幅于18.86%～96.18%.每個組合的小穗育性和花粉育性表現(xiàn)不一致，可以大致分為2 類.①花粉不育，小穗完全可育：DJY1×Pokkali、DJY1×Swarna；②花粉和小穗均不育：DJY1×Zhenshan 97B、DJY1×Sanhuangzhan NO2、DJY1×Sadu-cho、DJY1×Aswina.不同組合花粉和小穗育性不育的程度也各不相同，其中DJY1×Zhenshan 97B 組合育性均為高不育，DJY1×Sanhuangzhan NO2 組合育性均為半不育，DJY1×Sadu-cho 組合花粉育性表現(xiàn)為半不育，小穗育性為低不育，DJY1×Aswina 組合花粉育性為低不育，小穗育性表現(xiàn)為半不育.不同秈稻品種與IR64 雜交F1組合中，大致可以分為3 類.①花粉半不育，小穗完全可育：IR64×Zhenshan 97B；②花粉育性介于60%～80%，小穗完全可育：IR64×Pokkali、IR64×Swarna；③花粉和小穗均完全可育：IR64×Sanhuangzhan NO2、IR64×Sadu-cho、IR64×Aswina.

此外，我們發(fā)現(xiàn)，Zhenshan 97B、Sanhuangzhan NO2、Sadu-cho、Aswina 四個品種與秈稻IR64 雜交育性均顯著高于與溫帶粳滇粳優(yōu)1 號雜交組合育性，說明這4 個秈稻品種與秈稻IR64 的親和性更強.Pokkali 無論是與IR64 還是滇粳優(yōu)1 號雜交，育性無顯著差異.對于秈稻品種Swarna，IR64×Swarna 組合小穗育性顯著低于DJY1×Swarna 組合，IR64×Swarna 組合花粉育性顯著高于DJY1×Swarna組合，說明Swarna 與秈稻IR64 的雄配子親和力較高，而與粳稻滇粳優(yōu)1 號的雌配子親和力較高.

由此看出，滇粳優(yōu)1 號屬于溫帶粳，和秈稻之間遺傳距離較大，普遍存在育性障礙.結合表2，表明亞洲栽培稻不同類型中秈粳亞種間普遍存在雜種不育，且亞種間雜種育性顯著低于亞種內雜種的育性.此外，不同的秈稻品種之間也存在一定程度上的雜種不育現(xiàn)象.

2.5 Aus 稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 育性分析由表6 可知，在母本同為滇粳優(yōu)1 號的情況下，與不同Aus品種配組雜交F1的組合中，花粉育性變幅19.12%～82.84%，小穗育性變幅32.12%～90.00%，每個組合小穗育性均高于花粉育性.其中，DJY1×Dular 組合花粉育性和小穗均為完全可育，DJY1×Rayada、DJY1×N22、DJY1×FR13A 三個組合的育性存在顯著性差異并依次升高，DJY1×Kasalath 組合小穗育性為90.00%，完全可育，而花粉育性只有45.00%，說明DJY1×Kasalath 雜交組合只影響花粉育性，不影響小穗育性.Aus稻與IR64雜交F1組合中，IR64×Rayada 和IR64×Dular 組合育性均為完全可育；IR64×N22 組合花粉育性為低不育，小穗育性正?？捎?，為69.99%；IR64×FR13A組合花粉育性為60.48%，小穗育性為46.51%；IR64×Kasalath 組合花粉育性表現(xiàn)為半不育，小穗育性則為高不育，只有20.00%.

表6 Aus 稻分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交F1 花粉育性和小穗育性Tab.6 Pollen and spikelet fertility of F1 hybrids of Aus rice and Dianjingyu 1 and IR64,respectively

在研究同一品種分別與粳稻滇粳優(yōu)1 號和秈稻IR64 雜交F1的表現(xiàn)時發(fā)現(xiàn)，Rayada 與IR64 雜交F1花粉育性和小穗育性均完全可育，而與滇粳優(yōu)1 號雜交則存在明顯的育性障礙，說明Rayada與IR64 的親和性更高.N22 與IR64、滇粳優(yōu)1 號都存在育性障礙，且DJY1×N22 組合育性顯著低于IR64×N22.DJY1×FR13A 組合小穗育性顯著低于IR64×FR13A 組合，花粉育性則顯著高于IR64×FR13A 組合.Dular 具有廣親和性，其雜種F1均表現(xiàn)為完全可育.Kasalath 為父本分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 配組的F1組合花粉育性無顯著差異，均在45%左右，表現(xiàn)為花粉半不育.DJY1×Kasalath 組合小穗育性為90.00%，IR64×Kasalath 組合小穗育性僅有20.00%，存在極顯著性差異，說明Kasalath 與IR64 的雜交組合影響雜種雌配子育性.

綜上所述，不同Aus稻品種分別與滇粳優(yōu)1 號和IR64 雜交，不同組合間育性存在顯著差異.除Dular 與秈、粳亞種材料雜交育性正常外，其它Aus品種與秈、粳亞種材料雜交均存在不同程度的育性障礙.

3 討論

傳統(tǒng)上亞洲栽培稻被分為秈稻和粳稻兩個亞種[27-29]，而新的分類系統(tǒng)普遍把亞洲栽培稻分為秈稻、Aus、芳香稻、溫帶粳稻和熱帶粳稻5 種生態(tài)類型，大量基于基因組層面的研究也支持這一觀點[12-15].生殖隔離尤其是雜種不育是生物種/群形成的重要指標，而對這5 種生態(tài)群間雜種不育的研究證據(jù)相對缺乏.溫帶粳品種與同屬于溫帶粳的滇粳優(yōu)1 號配組F1組合時，育性均表現(xiàn)正常.溫帶粳品種與秈稻IR64 之間遺傳距離較遠，存在育性障礙，F(xiàn)1育性普遍不正常.以上現(xiàn)象說明亞種間雜種育性顯著低于亞種內雜種的育性.本研究中，IR64×Zhenshan 97B、IR64×Pokkali、IR64×Swarna 組合花粉育性分別為64.24%、54.38%、75.6%，與親本相比，育性顯著降低，表明秈稻品種間也存在一定的育性障礙，這與前人的結果一致[3].有趣的是，熱帶粳品種與溫帶粳滇粳優(yōu)1 號存在育性障礙，支持溫帶粳與熱帶粳屬于不同亞群的分類.然而本實驗所用的熱帶粳品種與IR64 配組的F1育性普遍正常，這又與5 種生態(tài)類型的分類系統(tǒng)不一致.造成這種結果的原因可能是熱帶粳和秈稻主要分布于東南亞的熱帶地區(qū)[30].一方面，基于基因組研究，相比于溫帶粳，秈稻與熱帶粳的遺傳距離更近[13].另一方面，秈稻和熱帶粳主要分布在亞洲熱帶地區(qū)，兩者在地理條件、生態(tài)環(huán)境等方面非常相似，相同的生態(tài)適應性和種植區(qū)域的重疊可能增加了2 種類群之間的基因交流，導致類群間生殖隔離降低.按照秈粳亞種的分類方法，芳香稻DOM Sufid 屬于粳稻，而在亞洲栽培稻5 種類群分類中，芳香稻屬于單獨一類，且與秈粳平行.本研究中DOM Sufid與秈、粳雜交均存在育性障礙，表明芳香稻可以作為一個獨立的群體類型來進行研究，支持亞洲栽培稻5 種類群分類的方法.然而，因為只有1 個品種，代表性有限，后續(xù)可選用多個芳香稻品種來進行驗證和進一步的研究.此外，Aus稻被認為是一類與秈、粳亞種雜交都表現(xiàn)出一定親和力的品種，是亞洲栽培稻中除秈粳2 個亞種外還存在的中間類型[31].在本實驗中，Aus稻無論是與滇粳優(yōu)1 號還是IR64雜交，普遍存在育性障礙，進一步表明Aus稻應該作為獨立于秈粳亞種外的生態(tài)類型來進行研究.由此看來，亞洲栽培稻較難僅從育性上簡單地分為秈稻和粳稻亞種，本實驗基于不同類群之間的雜種育性程度，更支持把亞洲栽培稻劃分為5 種不同生態(tài)類型.

亞洲栽培稻亞種間雜種優(yōu)勢的利用是超高產育種的重要途徑之一，但雜種不育現(xiàn)象嚴重阻礙了亞種間雜種優(yōu)勢的利用，因此認識雜種不育的遺傳基礎是利用雜種優(yōu)勢、培育超高產品種的前提.目前已經定位和克隆了多個控制亞洲栽培稻亞種間的育性基因，但這些研究沒有針對亞洲栽培稻豐富的變異來進行，僅僅局限于秈粳亞種間，且使用的材料多為溫帶粳稻和秈稻，例如S5、S16、S25(t)、S33(t)、HSA1等[20].本研究中，溫帶粳品種與秈稻IR64、秈稻品種與滇粳優(yōu)1 號配組的F1代育性變化范圍很大，從高不育到正?？捎?不同組合間育性存在明顯的差異，同一組合內對花粉和小穗育性的影響程度也不同，表明控制育性的基因存在差異，這與前人的研究結果一致.此外，在分析母本相同、父本不同及父本相同、母本不同2 種情況下，發(fā)現(xiàn)由于父本品種不同或母本背景不同而導致雜交種的育性差異，進一步表明不同雜交組合含有不同的雜種不育位點，且控制雜種不育的基因在數(shù)目、功能、作用方式等方面存在差異[32].熱帶粳與溫帶粳滇粳優(yōu)1 號之間存在育性障礙，目前對這方面的研究很少，也沒有相關的育性基因被報道，后續(xù)可選用多個熱帶粳和溫帶粳品種來進行驗證和進一步的研究.芳香稻主要分布于印度和巴基斯坦，與秈稻、粳稻及Aus稻在基因組方面存在差異[33]，本研究從育性方面一定程度上證實這一觀點.Aus稻作為一個特殊的生態(tài)類型，具有較好的親和力[34].本研究中，Aus稻品種與滇粳優(yōu)1 號和IR64 之間普遍存在育性障礙，雜交F1組合育性變化范圍大，小穗育性變動在20.00%～ 93.19%，花粉育性變動在19.12%～ 98.28%.目前已通過圖位克隆法將在第7 染色體調控Aus稻和秈稻/粳稻之間的雜種雌配子育性S7位點克隆[26].推測除S7位點，還有其他主效基因或者微效QTL 控制Aus稻和秈稻/粳稻之間的雜種雌配子育性.除控制小穗育性的基因外，還有影響花粉育性的基因存在，目前對這一方面的研究很少.此外，Aus稻品種含有廣親和基因S5-n[22]，而Dular 同時攜帶有S5-n、S7-n、S8-n、S9-n、S16-n、S17-n、S29-n、S31-n、S32-n等廣親和基因[35]，因此與滇粳優(yōu)1 號以及IR64 之間沒有育性障礙.Rayada、N22、FR13A、Kasalath 與滇粳優(yōu)1 號或（和）IR64 存在一定程度上的育性障礙.上述現(xiàn)象表明這4 個Aus稻品種與秈稻/粳稻的育性除了被S5-n控制外，應該還存在其它位點控制育性.雜種優(yōu)勢難以被充分利用的主要原因之一是由于雜種結實率低[34].本實驗中，有一些材料像秈稻Pokkali、秈稻Swarna、Aus稻Kasalath 分別與滇粳優(yōu)1 號配組，熱帶粳Moroberekan、Aus稻Rayada 分別與IR64 配組等，花粉育性表現(xiàn)不正常，而小穗育性育性正常，這些材料可以解決由于結實率低導致雜種優(yōu)勢難以得到充分利用的問題.其中，秈稻Pokkali和熱帶粳Moroberekan 無論是與滇粳優(yōu)1 號還是IR64 進行配組，均表現(xiàn)為花粉育性半不育，小穗完全可育，推測可能是由一個控制花粉育性的主效基因在起作用，需要進一步去研究.

本實驗為系統(tǒng)研究亞洲栽培稻不同生態(tài)類型與秈、粳間雜種不育提供理論依據(jù)，為打破亞洲栽培稻亞種間育性障礙、充分利用雜種優(yōu)勢培育超高產品種提供材料和技術支撐，為利用亞洲栽培稻種內豐富的遺傳基礎培育雜交品種及指導不同背景（秈稻或粳稻）下雜交稻的選育工作提供理論指導，同時也為認識亞洲栽培稻的分化提供證據(jù).5種生態(tài)類型在秈、粳背景下的育性研究一定程度上對亞洲栽培稻5 種生態(tài)類型的分類系統(tǒng)起到支撐作用，也存在一定的局限性.下一步，擬對5 種不同生態(tài)型材料分別在秈粳背景下雜種不育遺傳和基因定位做系統(tǒng)性研究.研究結果將對全面地闡述亞洲栽培稻的雜種不育，為利用雜種優(yōu)勢提供理論指導和材料.