王艾琳，謝 瑜，王 青，聶孝平，譚文波，劉益智

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2.湖南新匯醫(yī)藥有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410203）

防風(fēng)為傘形科防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，最早由《神農(nóng)本草經(jīng)》收載。防風(fēng)被稱為“療風(fēng)之要藥”[1]，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[2]。《本草綱目》記載“防風(fēng)炙赤研末”[3]，治療崩中漏下。《長(zhǎng)沙藥解》中描述防風(fēng)炭具有“斷漏下，崩中”之效，多用于治療崩漏、腸風(fēng)便血[4]，與防風(fēng)炭善于止血[5]功效一致。我院臨床常用制劑品種復(fù)方芩柏顆粒（湘藥制備字Z20210444000）中防風(fēng)炭為臣藥，年使用量較大，其炮制工藝對(duì)該特色制劑的質(zhì)量具有重要影響。目前防風(fēng)炭被廣東等4省市的中藥飲片炮制規(guī)范所收載[6]，除性狀鑒別外，無(wú)其他檢測(cè)指標(biāo)，難以保證“炒炭存性”[7]的質(zhì)量要求。防風(fēng)中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗凝血作用[8-9]，其炒炭后的藥效物質(zhì)變化有待研究。本研究采用正交設(shè)計(jì)結(jié)合層次分析，以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量，以及浸出物含量、外觀性狀進(jìn)行加權(quán)評(píng)分，優(yōu)選防風(fēng)炭的炒制溫度、炒制時(shí)間及砂用量，為企業(yè)大生產(chǎn)提供技術(shù)參考，為制定防風(fēng)炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及保證我院制劑品種臨床療效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與試劑 防風(fēng)飲片購(gòu)自安徽省亳州市，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院王青主任藥師鑒定為傘形科防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根。升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-22022704，純度：98.42%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-22072610，純度：99.66%）、升麻素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-22062117，純度：99.33%）、亥茅酚苷對(duì)照品（批號(hào)：MUST-220071618，純度：98.69%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 Agilent-1260型高效液相色譜儀（安捷倫儀器設(shè)備有限公司）；AG-285型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler公司）；B23ZH水分測(cè)定儀[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇中大儀器科技有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HA640非接觸式紅外測(cè)溫儀（武漢優(yōu)信科技有限公司）；FW177中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；JYDC/50電磁炒藥機(jī)（石家莊佳月機(jī)械制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水，梯度洗脫（見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷對(duì)照品適量，依次置于25 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，制成亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷質(zhì)量濃度分別為0.776、0.825、0.850、0.811 mg/mL的單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取各成分對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成每毫升含亥茅酚苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素和升麻素苷分別為11.634、24.756、29.764、64.864 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 防風(fēng)炭供試品溶液的制備 取防風(fēng)炭細(xì)粉約0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，50 kHz）45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，收集續(xù)濾液，即得。

2.3.2 防風(fēng)供試品溶液的制備 取防風(fēng)約0.5 g，參照“2.3.1”防風(fēng)炭供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、防風(fēng)供試品溶液、防風(fēng)炭供試品溶液各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件，注入高效液相色譜儀，測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果顯示，防風(fēng)及防風(fēng)炭供試品與對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間處有一相同的色譜峰，且其他雜質(zhì)無(wú)干擾，與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論板數(shù)不少于4 000。（見(jiàn)圖1）

圖1 HPLC 圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，加適量甲醇逐級(jí)稀釋到不同濃度。升麻素苷質(zhì)量濃度依次為16.216、48.648、64.864、81.080、121.620、162.160μg/mL；5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度依次為8.252、16.504、24.756、41.260、66.016、82.520 μg/mL；亥茅酚苷質(zhì)量濃度依次為3.878、7.756、11.634、23.268、31.024、38.780 μg/mL；升麻素質(zhì)量濃度依次為8.504、17.008、29.764、42.520、68.032、85.040 μg/mL。分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得升麻素苷的線性回歸方程為Y=17.708X+3.475 1（r=0.999 9）；5-O-甲基維斯阿米醇苷的線性回歸方程為X=19.829X+2.272 6（r=0.999 9）；亥茅酚苷的線性回歸方程為X=24.725X+0.401 1（r=0.999 9）；升麻素的線性回歸方程為Y=27.961X-3.976 7（r=0.999 9）。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取防風(fēng)炭供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的峰面積RSD分別為0.43%、0.49%、0.50%、0.46%。表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取防風(fēng)炭供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，常溫條件下分別在0、2、4、8、12、24 h后依次進(jìn)樣，測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的峰面積RSD分別為0.85%、0.18%、1.07%、0.29%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取防風(fēng)炭細(xì)粉6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定。結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均含量分別為0.276%、0.129%、0.054%、0.054%；RSD分別為0.94%、0.99%、0.53%、1.03%。表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取防風(fēng)炭細(xì)粉約0.25 g，精密稱定，共6份，分別加入各成分對(duì)照品儲(chǔ)備液，即升麻素苷0.9 mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.4 mL、亥茅酚苷0.15 mL和升麻素0.15 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均加樣回收率分別為98.17%、98.00%、98.14%、98.21%，RSD分別為0.73%、1.10%、1.03%、1.04%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好。（見(jiàn)表2）

表2 防風(fēng)炭中4 種化學(xué)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 炮制工藝優(yōu)化

2.6.1 不同炮制工藝對(duì)比 取4份防風(fēng)飲片，各200 g，分別將200 g防風(fēng)以230 ℃清炒6.0 min，260 ℃清炒4.0 min，230 ℃砂炒4.0 min，260 ℃砂炒3.5 min 4種方法進(jìn)行炒制，性狀符合《廣東省中藥炮制規(guī)范》（2011年版）“外表面焦黑色，切面焦褐色，氣焦香”[5]的標(biāo)準(zhǔn)。按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別測(cè)定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量。結(jié)果顯示，與清炒法比較，砂炒法各有效成分含量均較高，且所需時(shí)間少，故進(jìn)一步優(yōu)選砂炒法工藝參數(shù)。（見(jiàn)表3）

表3 清炒法與砂炒法指標(biāo)成分含量比較

2.6.2 多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法 根據(jù)層次分析法的原理[10-11]，利用Spss Statistics 27應(yīng)用軟件，將綜合OD值設(shè)為決策目標(biāo)，將外觀性狀和浸出物、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的含量賦值權(quán)重系數(shù)，設(shè)定方案層。通過(guò)“判斷矩陣”，在6個(gè)備選方案中，評(píng)價(jià)兩兩方案的重要程度，分析結(jié)果符合一致性，數(shù)據(jù)無(wú)邏輯矛盾，最終確定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素、浸出物的含量和外觀性狀的權(quán)重系數(shù)分別為11.396%、11.947%、5.032%、29.933%、4.445%、37.247%，加權(quán)綜合評(píng)分，計(jì)算綜合OD值。

2.6.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)單因素試驗(yàn)，篩選出砂炒溫度（A）、時(shí)間（B）、砂用量（C）為主要考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表4。

表4 因素與水平表

2.6.3.1 防風(fēng)炭的制備 取9份防風(fēng)飲片，各200 g，按照L9（34）正交試驗(yàn)表安排砂炒防風(fēng)炭。取凈砂于炒制容器內(nèi)，用武火炒制滑利狀態(tài)，測(cè)定中心砂表面溫度達(dá)到規(guī)定溫度后，加入防風(fēng)，翻炒至規(guī)定時(shí)間，出鍋，去砂，冷卻。

2.6.3.2 防風(fēng)炭的性狀與收率 對(duì)“2.6.3.1”項(xiàng)下炮制的9批防風(fēng)炭，依據(jù)《廣東省中藥炮制規(guī)范》（2011年版）性狀描述：“外表面焦黑色……切面焦褐色，有放射狀紋理，氣焦香”[5]進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。（見(jiàn)表5）防風(fēng)炭得率=防風(fēng)炭質(zhì)量/防風(fēng)質(zhì)量×100%。（見(jiàn)表6）

表5 防風(fēng)炭外觀性狀評(píng)分表

表6 防風(fēng)炭炮制結(jié)果

2.6.3.3 防風(fēng)炭水分和浸出物含量測(cè)定 取“2.6.3.1”項(xiàng)下制備的防風(fēng)炭樣品，分別依據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》第四部通則中醇溶性浸出物測(cè)定法和水分測(cè)定（烘干法）[12]，測(cè)定防風(fēng)炭浸出物含量和水分。炮制結(jié)果見(jiàn)表6。

2.6.3.4 防風(fēng)炭含量測(cè)定 取“2.6.3.1”項(xiàng)下制備的防風(fēng)炭樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制成防風(fēng)炭供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷和升麻素的含量。（見(jiàn)表7）

表7 防風(fēng)炭含量測(cè)定結(jié)果 （n=3）

2.6.4 數(shù)據(jù)處理與分析 外觀性狀評(píng)價(jià)是判斷中藥飲片質(zhì)量的直觀標(biāo)準(zhǔn)，但難以保證飲片質(zhì)量的均一性及穩(wěn)定性。根據(jù)“2.6.2”項(xiàng)確定的各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)，計(jì)算綜合OD值。綜合OD值=（11.396%×mAi/mAmax＋29.933%×mBi/mBmax+11.947%×mCi/mCmax＋5.032%×mDi×mDmax+4.445%i×mE/mEmax+37.247%×mFi/mFmax）×100，其中A~F分別為升麻素苷含量、升麻素含量、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量、亥茅酚苷含量、浸出物含量及外觀評(píng)分。結(jié)果表明，各因素對(duì)炒炭結(jié)果的影響程度為A＞C＞B；方差結(jié)果分析得到，溫度對(duì)炒炭工藝有顯著影響。（見(jiàn)表8~9）通過(guò)最大綜合OD值與正交試驗(yàn)結(jié)果雙重評(píng)價(jià)，得到最佳工藝參數(shù)為A1B2C3，即待2.4 kg凈砂炒至中心砂表面溫度為230 ℃，投入防風(fēng)飲片200 g，翻炒3.5 min，篩去砂，放涼。

表8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表9 方差分析表

2.7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照最佳工藝進(jìn)行3批防風(fēng)炭砂炒工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)，將12倍量（即60 kg）凈砂加入炒藥機(jī)，用武火炒制滑利狀態(tài)，待砂中心表面溫度達(dá)230 ℃，投入防風(fēng)5 kg，翻炒3.5 min，篩去砂、放涼。測(cè)得升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素的平均含量分別為0.327%、0.124%、0.053%、0.065%，RSD值分別為1.03%、1.22%、0.98%、1.56%。所得3批防風(fēng)炭外觀性狀均符合要求，表明該防風(fēng)炭的炮制工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)比在230、260 ℃的炮制溫度下，砂炒法所需時(shí)間較清炒法少0.5～2 min，且升麻素苷、升麻素成分的含量分別高出清炒法15.07%、7.41%以上。本研究確定了防風(fēng)炭砂炒工藝，突破傳統(tǒng)清炒[13-14]制炭的壁壘，以河砂作為傳熱介質(zhì)，具有增加受熱面積、縮短炒制時(shí)間、保證受熱均勻的優(yōu)勢(shì)[15]，解決了清炒時(shí)間長(zhǎng)造成含量減少的問(wèn)題。選用直徑2 mm左右的河砂，可減少河砂進(jìn)入防風(fēng)炭斷面皮部裂隙。防風(fēng)于230 ℃砂炒，其升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷逐步分解或轉(zhuǎn)化；其中升麻素苷及升麻素隨溫度升高分解速率加快，在290 ℃時(shí)含量降低幅度超過(guò)40%，難以控制炒制時(shí)間，容易灰化，故不宜在較高溫度下進(jìn)行防風(fēng)炭炮制。

防風(fēng)炭具備“炭藥”與“存性”的雙重要求：在外形上保留防風(fēng)“外表面縱皺紋及點(diǎn)狀細(xì)根痕，斷面裂隙”，并具備炭類藥的“外表面焦黑色，斷面焦褐色，具焦香味”[5]。防風(fēng)中5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素苷，發(fā)揮解熱作用，并具有抗血小板聚集和抗凝作用[8,16]。炒炭，使升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷成分減少，故走氣分（解表和抗凝作用）減弱，而偏于入血分（止血）。升麻素為體內(nèi)的主要代謝形式[17-18]，可能與產(chǎn)生止血作用有一定聯(lián)系，故在層次分析法中將升麻素評(píng)分權(quán)重加大。研究表明，亥茅酚苷的鎮(zhèn)痛等作用，與藥效呈正相關(guān)[19-20]。因此，建議將升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷作為防風(fēng)炭質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本研究考察回流提取和超聲提取2種方式，發(fā)現(xiàn)超聲45 min的條件下操作便捷，有效成分溶出率較大；對(duì)不同濃度甲醇（50%、80%、100%）進(jìn)行考察，結(jié)果表明80%甲醇提取的樣品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等成分含量較高；以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，各色譜峰的分離度較好。

本研究利用層次分析法合理設(shè)定各指標(biāo)評(píng)價(jià)系數(shù)，在性狀特征符合標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合含量檢測(cè)，優(yōu)選炒制方法，優(yōu)化砂炒工藝，最終確定防風(fēng)飲片砂炒制炭的可行性及優(yōu)勢(shì)，并為企業(yè)生產(chǎn)提供工藝參考。建立HPLC法同時(shí)測(cè)定防風(fēng)炭中4種色原酮類成分含量，該方法易操作，各成分分離度、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性良好，體現(xiàn)了中藥多成分、多層次、多通路的作用特點(diǎn)，可為防風(fēng)炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。