鐘 佳，孔祥建，丁 軒，楊 潔，何運(yùn)恒，李 前

（1.常德市第一中醫(yī)醫(yī)院，湖南 常德 415000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

[關(guān)鍵字] 治傷巴布劑；軟組織損傷；前列腺素E2；交互作用；正交試驗(yàn)

急性軟組織損傷是一種臨床常見(jiàn)的損傷，損傷后疼痛腫脹等癥狀對(duì)人的健康和工作能力有重大影響，受到人們的廣泛關(guān)注[1]。休息制動(dòng)、外固定保護(hù)、冰敷、壓縮和抬高仍然是急性軟組織損傷目前認(rèn)可度較高的治療方法之一[2]。但隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們迫切的需要一種更加有效促進(jìn)急性軟組織損傷修復(fù)的治療手段。治傷巴布劑是由我院老中醫(yī)方云祥祖?zhèn)髅胤健爸蝹ⅰ蓖ㄟ^(guò)劑型改良而來(lái)，主要由血?dú)?、虎杖、?jiàn)風(fēng)消等藥物組成。在臨床治療過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)治傷巴布劑對(duì)急性軟組織損傷[3]、頸肩腰腿痛等疾病有著顯著的療效。前期研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，治傷巴布劑通過(guò)調(diào)節(jié)軟組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的表達(dá)水平影響軟組織損傷的恢復(fù)進(jìn)程。為了明確治傷巴布劑各組分在促進(jìn)軟組織腫脹消退作用的主次地位及各組分間是否有交互作用，課題組開(kāi)展本次研究，擬從軟組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及骨骼肌中PGE2含量的角度，探討治傷巴布劑中主要作用成分，以及3個(gè)組分間是否存在交互作用，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6月齡健康雄性SD大鼠108只，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司出售，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0005，飼養(yǎng)溫度（22±3）℃，濕度（60±10）%，體質(zhì)量（320±30）g，動(dòng)物一般狀態(tài)良好，皮毛光澤，進(jìn)食與活動(dòng)正常，并有飼養(yǎng)員按要求定時(shí)提供標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。動(dòng)物通過(guò)造模、給藥、取標(biāo)本等處理后，過(guò)量硫噴妥鈉腹腔內(nèi)注射處死大鼠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案已通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 治傷巴布劑組方藥味來(lái)源:血?dú)槲以鹤鎮(zhèn)髅厮帲恢币詠?lái)由本單位在民間采購(gòu)（桃源、石門(mén)等地，批號(hào)：120608），后經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)主任藥師童巧珍鑒定，為小血藤、香巴戟、鐵箍散類藥物，其主要藥理成分目前正在研究；虎杖（安徽嘉佑，批號(hào)：20140301）；見(jiàn)風(fēng)消（湖南善德堂，批號(hào)：140815）。以上中藥均由常德市第一中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，血?dú)?、虎杖主要取用根莖入藥，見(jiàn)風(fēng)消取用枝葉入藥，經(jīng)藥學(xué)部認(rèn)定為正品。

治傷巴布劑的制備：3種藥物各研末過(guò)1號(hào)篩，用4倍劑量的85%乙醇浸泡48 h，用乙醇滲漉法收集滲液，通過(guò)濃縮、滅菌后，密封備用，最終得到藥物質(zhì)量濃度為每1 mL藥物浸膏相當(dāng)于5.0 g生藥。取適量明膠，用少量蒸餾水溶脹后90 ℃水浴溶解，加入適量甘油、阿拉伯膠和水，調(diào)成糊狀混合物，溶解后加入CaCl2，攪拌得基質(zhì)，另取上述藥物浸膏，加熱攪拌，緩慢加入基質(zhì)中，持續(xù)攪拌，置入90 ℃水浴中以去除部分水分，至膏體軟硬適中，再加入5%氮酮，繼續(xù)攪拌均勻，再均勻涂抹至無(wú)紡布上，置于40 ℃干燥箱中干燥30 min，再裁剪成5 cm×5 cm規(guī)格的巴布劑。所有巴布劑必須通過(guò)高效液相色譜儀及紫外分光光度儀進(jìn)行有效成分及質(zhì)量檢測(cè)，合格后方能使用。由常德市第一中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備。

RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR試劑盒、組織裂解液和ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Therm公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司；AQP3抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；PEG2酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)：20150106）。

1.3 主要儀器 BS97MyCycler型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；實(shí)時(shí)熒光定量9700型PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Waters-960型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Mini-Sub Cell GT Cell型電泳儀及電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；DNM-9606酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；960CRT型熒光分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；GIS-1000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（日本Kodak公司）；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）；TCL16M型高速冷凍離心機(jī)（南京非同科學(xué)儀器有限公司）；UV754型紫外線可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)儀器有限公司）；GRX-9053A型干烤滅菌器（上海柏欣儀器設(shè)備廠）。

1.4 造模與分組 將108只大鼠進(jìn)行編號(hào)，按兩水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3種藥物組分A（血?dú)ぃ（虎杖）、C（見(jiàn)風(fēng)消）均取敷藥與不敷藥（外敷賦形劑）兩個(gè)水平，各藥物組分劑量水平見(jiàn)表1。

表1 各藥物組分的因子和劑量水平

采用L8（27）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，組成9個(gè)處方組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定各藥物組分的主次地位及交互作用[18]，分別命名為Ⅰ～Ⅸ組：Ⅰ組（血?dú)?虎杖+見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅱ組（血?dú)?虎杖組）、Ⅲ組（血?dú)?見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅳ組（血?dú)そM）、Ⅴ組（虎杖+見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅵ組（虎杖組）、Ⅶ組（見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅷ組（賦形劑對(duì)照組）、Ⅸ組（正常對(duì)照組），每組12只大鼠。

造模前一天使用10%的硫化鈉對(duì)大鼠左后肢大腿外側(cè)進(jìn)行脫毛，用1%硫噴妥納（0.5 mL/100 g）腹腔注射進(jìn)行全身麻醉，再使用軟組織打擊器（重錘墜落法）在脫毛區(qū)標(biāo)記處（直徑約2 cm）進(jìn)行打擊造模，建立創(chuàng)傷性軟組織腫脹模型，對(duì)Ⅰ～Ⅷ組大鼠進(jìn)行造模，Ⅸ組不進(jìn)行處理。打擊錘底面平滑，直徑為2.5 cm，重200 g，自由落體的高度為20 cm，連續(xù)打擊3次，以肉眼可見(jiàn)打擊部位腫脹和皮下淤血但無(wú)骨折為造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 將各組藥物浸膏各取50 mL，按治傷巴布劑組分配比，按以上制作工藝，制作成同等大小及數(shù)量的巴布劑，并裁成3 cm×3 cm小塊，造模后立即使用膠布包裹將藥物或賦形劑分別敷于Ⅰ～Ⅷ組大鼠左后肢腫脹區(qū)，并記錄造模及敷藥時(shí)間，膠布包裹時(shí)松緊適宜，避免過(guò)緊導(dǎo)致局部循環(huán)不暢，加重腫痛，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。定期觀察各藥物組大鼠左側(cè)后肢敷藥情況，如有藥物脫落，及時(shí)添補(bǔ)。

1.6 觀察指標(biāo) 于造模后7 d處死大鼠，在造模部位中心區(qū)域切取骨骼肌約2 g，并將其等分為5份，用生理鹽水清洗血跡后立即置于2 mL凍存管，并用液氮冷凍，-80 ℃低溫冰箱保存。

每個(gè)樣本取骨骼肌組織1份，依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片等處理,將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤1～2 h，石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇沖洗至水；蘇木素染10 min，流水沖洗，去余色；0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘，流水沖洗，切片變藍(lán)約15 min；95%乙醇30 s，酒精性伊紅染色30 s；95%乙醇30 s，100%乙醇30s，石碳酸二甲苯30s，二甲苯脫水30s，中性樹(shù)膠封片。

1.6.1 組織病理學(xué)檢查 在顯微鏡下觀察各標(biāo)本淤血、腫脹程度,分別對(duì)各組行四級(jí)評(píng)分，鏡下觀察及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2-3]如下：0分：肌纖維無(wú)淤血、腫脹，與正常軟組織相同；1分：肌纖維有腫脹，肌組織內(nèi)輕度淤血、水腫、出血，血管及膠原纖維輕度增生；2分：肌纖維有腫脹，并伴有變性，肌纖維內(nèi)輕度淤血、水腫、出血，纖維母細(xì)胞侵入，血管增生或膠原纖維增生明顯；3分：肌纖維腫脹明顯，并伴有透明變性，肌纖維組織中伴有嚴(yán)重淤血、水腫、出血、炎癥，肌纖維明顯壞死。

1.6.2 PGE2含量 取骨骼肌樣本約100 mg，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)規(guī)定區(qū)域骨骼肌中PGE2含量。生理鹽水5mL浸泡1h，離心浸泡液，吸取上清液0.1 mL，加0.5 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2 mL，在50 ℃水浴中異構(gòu)化20 min，用甲醇稀釋至20 mL，于波長(zhǎng)270 nm處測(cè)定光密度值（OD），以每克組織相當(dāng)?shù)奈展饷芏戎当硎綪GE2的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行錄入及處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，如組間方差齊，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)改變情況 大鼠造模后骨骼肌組織均腫脹淤血，敷藥7 d后，Ⅰ組（血?dú)?虎杖+見(jiàn)風(fēng)消組）基本無(wú)明顯腫脹淤血；Ⅱ組（血?dú)?虎杖組）、Ⅲ組（血?dú)?見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅳ組（血?dú)そM）輕度淤血腫脹，較Ⅰ組稍明顯，出血灶較Ⅰ組明顯減輕或大部分消失，血管增生，膠原纖維增生；Ⅴ組（虎杖+見(jiàn)風(fēng)消組）、Ⅵ組（虎杖組）、Ⅶ組（見(jiàn)風(fēng)消組）均淤血腫脹，肌纖維腫脹且伴有輕度變性，肌組織內(nèi)淤血、水腫、出血稍減輕，纖維母細(xì)胞侵入，血管及膠原纖維輕度增生；Ⅷ組（賦形劑對(duì)照組）腫脹淤血明顯，肌纖維腫脹且有透明變性，肌纖維明顯壞死，肌纖維組織中伴有嚴(yán)重淤血、水腫、出血、炎癥；Ⅸ組（正常對(duì)照組）為正常骨骼肌組織，無(wú)腫脹瘀血。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠骨骼肌病理切片圖 （HE，×200）

2.2 PGE2含量 根據(jù)表2可以看出，藥物A的極差最大，對(duì)結(jié)果影響最大，其次是B、C，說(shuō)明主要藥物為血?dú)?，次要藥物為虎杖及?jiàn)風(fēng)消。

表2 治傷巴布劑對(duì)大鼠軟組織腫脹的療效 （±s）

表2 治傷巴布劑對(duì)大鼠軟組織腫脹的療效 （±s）

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結(jié)合表2、表3可以看出，藥物A、B、C都有作用，A+B存在交互作用（P＜0.05），但極差R＜0，說(shuō)明血?dú)づc虎杖有交互作用，且交互性質(zhì)為拮抗作用，其他藥物組合無(wú)交互作用（P＞0.05）。

表3 治傷巴布劑對(duì)大鼠軟組織腫脹療效的方差分析

3 討論

急性軟組織損傷是臨床非常常見(jiàn)的疾病，一般由外力導(dǎo)致，其主要病理改變是無(wú)菌性炎癥，主要表現(xiàn)為局部肌肉組織壞死、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫和出血[7]。急性軟組織損傷的發(fā)病機(jī)制中，中性粒細(xì)胞起著重要作用，它從創(chuàng)傷性病變中早期釋放出來(lái)，誘導(dǎo)自由基，進(jìn)而損傷局部組織細(xì)胞[1]。中性粒細(xì)胞能釋放大量炎癥介質(zhì)，包括PGE2、IL-1β、TNF-α、花生四烯酸代謝物、血管活性胺等，這些炎性介質(zhì)能進(jìn)一步加劇炎癥細(xì)胞的黏附聚集作用，促進(jìn)炎癥因子的進(jìn)一步釋放，同時(shí)激活新的炎癥反應(yīng)[8]。研究[9-10]表明，PGE2是花生四烯酸在磷酸酯酶A2作用下的最終代謝產(chǎn)物，PGE2不僅能通過(guò)下調(diào)神經(jīng)根的疼痛閾值和增加神經(jīng)的敏感性直接導(dǎo)致疼痛，而且能促進(jìn)血管攣縮導(dǎo)致軟組織水腫加劇，是導(dǎo)致急性軟組織損傷疼痛和腫脹的重要原因。因此PGE2是急性軟組織腫脹的重要病理因素，也是藥物干預(yù)的主要作用靶點(diǎn)[12-13]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性軟組織損傷屬于“筋傷病”范疇，跌仆損傷導(dǎo)致機(jī)體筋脈受損，血逸脈外而成瘀，瘀血阻脈導(dǎo)致氣機(jī)運(yùn)行不暢，故發(fā)為腫痛，所以說(shuō)“氣滯血瘀”為其基本病機(jī)[11]?！镀諠?jì)方》云：“但凡傷折，損及筋肉經(jīng)絡(luò)，脈絡(luò)暢通受阻，瘀停不去，故引發(fā)腫痛，治宜祛除惡瘀，宣通脈道，暢通氣血，則病可愈?！蔽以好蠈＜疑巯若辰淌诙嗄陙?lái)從“脾”論治創(chuàng)傷后軟組織損傷，取得良好療效[14-15]，因此，治療急性軟組織損傷的基本準(zhǔn)則是“活血化瘀、消腫止痛”基礎(chǔ)上兼以健脾利水，能取得良好療效。治傷巴布劑是由我院老中醫(yī)方云祥的祖?zhèn)髅胤健爸蝹ⅰ蓖ㄟ^(guò)劑型改良而成，主要由血?dú)ぁ⒒⒄?、?jiàn)風(fēng)消等藥物組成。血?dú)の犊?，性寒，善于祛腐生肌，消腫止痛?；⒄刃晕⒖?，味微寒，善于散瘀消痛。見(jiàn)風(fēng)消，味辛，性溫，善于祛風(fēng)除濕，行氣散寒止痛。三藥合用，藥性相互制約防止寒涼太過(guò)，又具有活血通絡(luò)、散瘀消腫止痛之功效，且中草藥外敷較藥物內(nèi)服更具安全性[16-17]。

本研究采用大鼠腫脹模型，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，建立大鼠腫脹模型，通過(guò)檢測(cè)腫脹模型大鼠骨骼肌中PGE2含量，分析治傷巴布劑3種藥物組分治療創(chuàng)傷后組織腫脹的主次地位及交互作用，證實(shí)3種藥物組分均能降低PGE2含量，其中血?dú)て鹬饕饔?，而且血?dú)づc虎杖之間存在拮抗作用，其他組分之間不存在交互作用。這提示雖然治傷巴布劑中各組分都能通過(guò)降低PGE2的表達(dá)治療急性軟組織損傷，但每一組分應(yīng)該均存在不同的治療靶點(diǎn)，3種藥物通過(guò)不同的治療機(jī)制構(gòu)建出治傷巴布劑治療急性軟組織損傷的干預(yù)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。但是本研究只是初步分析了3種藥物對(duì)PGE2的干預(yù)作用，對(duì)于其他可能存在的治療靶點(diǎn)及作用機(jī)制的分析還有待進(jìn)一步的探索與研究。