鄧良英，孫園園，高磊，王煒，石開虎※

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028）

房顫（Atrial fibrillation, AF）是臨床上常見的心律失常，與死亡、中風和外周栓塞疾病風險增加有關(guān)[1]。過去20 年其發(fā)病率和患病率顯著增加，引起了嚴重的經(jīng)濟負擔，也成為流行病學和公共衛(wèi)生最大的挑戰(zhàn)之一[2]。據(jù)估計，在中國40 歲以上成年人的房顫患病率為2.31%[3]。然而，關(guān)于房顫的形成和持續(xù)存在機制仍沒有確切的定論，可能與心房組織的電生理和結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)[4]。目前，臨床上治療房顫有心率控制、節(jié)律控制以及預防血栓栓塞事件[5]等方法，然而，對于老年人而言往往面臨抗凝藥物不耐受、抗心律失常藥物產(chǎn)生不良副作用、射頻消融等手術(shù)費用高以及術(shù)后復發(fā)等問題[6]。中醫(yī)藥具有多種治療方法，越來越多的研究顯示，中醫(yī)藥可能成為房顫的有效預防手段和補充療法[7]。一些中藥、中成藥或者活性成分在房顫治療的四項原則中發(fā)揮積極作用，可減輕患者胸悶、心悸和呼吸困難癥狀，提高患者的耐受性[8]。據(jù)研究顯示，一些中藥或者其活性成分作用于心房肌細胞，從而避免心律失常，其可能是通過調(diào)節(jié)離子通道[9]，抑制炎癥因子[10]，氧化應(yīng)激等起作用[11]。因中藥具有成分復雜、多靶點的作用特點，治療房顫的作用機制目前尚不清晰。本研究通過回顧數(shù)據(jù)，挖掘房顫現(xiàn)代中醫(yī)藥用藥規(guī)律，并針對核心藥對展開網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接和分子動力學研究，為其治療房顫的活性成分及作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 資料來源

以中國知網(wǎng)、萬方、維普和中國生物醫(yī)學網(wǎng)為數(shù)據(jù)來源，以“主題詞=（房顫OR 心房顫動OR 心房纖顫）AND 主題詞=（中醫(yī)OR 中藥OR 中西醫(yī)OR 方藥OR 醫(yī)OR 經(jīng)驗OR 驗案OR 臨床OR 療效OR 觀察）進行高級檢索，檢索時間從建庫至2021 年12 月。

1.2 處方篩選

1.2.1 納入標準 明確診斷為“心房顫動”或“房顫”或“心房纖顫”或“AF”；有明確療效且總有效率超過85%；文獻中有中藥復方治療房顫，并有明確藥味組成；僅采用內(nèi)服為服藥方式。

1.2.2 排除標準 動物或者細胞試驗等非臨床研究；復方組成相同或者重復發(fā)表的文獻只取一篇研究單味中藥的文獻。

1.2.3 篩選結(jié)果 經(jīng)過納入和排除標準，最終納入文獻為161 篇文獻，整理后得到156 首方劑。

1.3 處方錄入和藥名規(guī)范

整理獲得的處方通過Microsoft Excel 2010 錄入，建立房顫方劑數(shù)據(jù)庫，由兩人進行錄入資料，數(shù)據(jù)審核，以確保數(shù)據(jù)準確性。參照《中華人民共和國藥典》（2020 年版）、《中藥學》和《中醫(yī)大辭典》等對方劑中的藥材名稱進行規(guī)范化處理，比如“炒白術(shù)”規(guī)范為“麩炒白術(shù)”，“麥門冬”規(guī)范為“麥冬”，“三七粉”規(guī)范為“三七”，“當歸身”、“當歸尾”統(tǒng)一規(guī)范為“當歸”等。

1.4 用藥頻次和關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

運用IBM SPSS Statistics 26 對納入處方的用藥頻次和頻率進行統(tǒng)計分析；運用IBM SPSS Modelar 20.0 軟件進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，通過Apriori 關(guān)聯(lián)規(guī)則算法對處方中藥物的用藥規(guī)律和配伍規(guī)律進行分析。設(shè)置前項為2，后項為3，得到核心藥對或者藥物組合。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對經(jīng)過1.4 分析后得到的核心藥對”苦參—丹參”活性成分進行篩選，以獲得藥物作用靶點。然后，利用TTD（http://db.idrblab.net/ttd/、GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）和DrugBank（https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫以“atrial fibrillation”為關(guān)鍵詞獲得房顫疾病靶點。將房顫靶點與藥物靶點的交集上傳到String 數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/）進行富集分析，借助Cytoscape 3.9.1 軟件進行可視化處理。

1.6 分子對接

利用PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫下載靶點PDB 文件，利用PyMOL 對受體蛋白去除配體、去水等操作；利用Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載藥物活性成分的SDF 文件，然后，通過open babel 軟件把文件轉(zhuǎn)為Mol2 格式；通過AutoDockTool-1.5.7 對配體和蛋白進行加氫、平衡電荷等操作，保存為pdbqt格式；利用AutoDockTool-1.5.7 進行對接，并計算能量，最后通過Discovery Studio2019 繪圖。

1.7 分子動力學模擬

使用GROMACS2020.6 軟件包對1.6 分析的分子對接結(jié)果進行分子動力學模擬，分析潛在活性成分與蛋白的結(jié)合模式。首先，從Biobyte（https://www.bio2byte.be/acpype/submit/）將小分子文件轉(zhuǎn)換為分子結(jié)構(gòu)文件和拓撲文件。使用charmm36 力場以及TIP3P周期性顯性水模型進行模擬，形成蛋白原子距離邊緣為12大小合適的盒子，加入相應(yīng)的NaCl 離子保證模擬系統(tǒng)電荷中性，在系統(tǒng)的三個方向都應(yīng)用周期邊界條件。模擬前對體系采用最速下降法進行50 000 步分子動力學優(yōu)化，然后體系逐漸升溫到310K，在310K下所有體系在NVT 系綜下進行1 ns 的平衡；同樣，在310 K 和1 atm 壓強下所有體系在NPT 系統(tǒng)下進行1 ns 平衡，所有體系在NPT 系統(tǒng)下進行模擬時間為100 ns、模擬間隔為2 fs 的分子動力學模擬。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 用藥頻次和頻率分析 對房顫處方進行規(guī)范錄入，共得到194 味中藥，累計頻次到達1 546 次，對中藥頻次≥20 次進行匯總，共得到22 味中藥，累計頻次到達856 次，占比55.36%，其中在156 個處方中排名前五的中藥分別為：丹參（75 次，48.08%）、炙甘草（72 次，46.15%）、麥冬（64 次，41.03%）、桂枝（52 次，33.33%）和當歸（49 次，31.41%），結(jié)果見表1。

表1 房顫治療用藥頻次分析（使用頻次≥20 次）Table 1 Drug frequency analysis of treatment on atrial fibrillation(drug with frequency ≥20 times)

2.1.2 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 對高頻中藥（頻次≥20次）進行關(guān)聯(lián)分析，設(shè)置最低條件支持度為10%，最小置信度為0.75，得到常用藥材組合14 組，出現(xiàn)前五最高的頻度配伍分別是：丹參—苦參、麥冬—五味子、麥冬—五味子—炙甘草、炙甘草—桂枝—麥冬、麥冬—地黃—炙甘草，結(jié)果見表2?！暗ⅰ鄥ⅰ钡闹С侄茸罡?、置信度也較高，故將“苦參—丹參”定義為核心藥對。

表2 高頻藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Table 2 Analysis of association rules among high-frequency drugs

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果

2.2.1 “丹參—苦參”的活性成分和靶點收集與篩選根據(jù)類藥性（DL）≥0.18 和口服吸收利用度（OB）≥30%，獲得“苦參—丹參”藥對活性成分83 個，其中丹參59 個，苦參24 個，兩者有一個重復活性成分（表3）?；钚猿煞职悬c去除重復值共獲得117 個靶點。

表3 “丹參—苦參”活性成分Table 3 Active ingredients of "Salvia miltiorrhiza-Sophora flavescens"

2.2.2 藥物—疾病靶點交集 通過TTD、GeneCards、OMIM 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索分別獲得房顫疾病靶點23 個、1 124 個、351 個和120 個，去除重復共獲得1 288 個疾病靶點。利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制藥物活性成分靶點與疾病靶點交集（圖1），獲得藥物作用房顫核心靶點109 個。構(gòu)建房顫核心靶點—活性成分—藥物網(wǎng)絡(luò)（圖2）。根據(jù)拓撲分析度值排名前三的活性成分有槲皮素（度值=80）、木犀草素（度值=64）、丹參酮ⅡA（度值=21），這3 個成分為關(guān)鍵活性成分。

圖1 “丹參—苦參”藥對與房顫的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of"Radix salvia-Sophorae flavescentis radix"and atrial fibrillation

圖2 房顫核心靶點—活性成分—藥物網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Core target of atrial fibrillation-active ingredient-drug network

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點篩選 將109 個房顫核心靶點導入String 數(shù)據(jù)庫分析，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，通過Cytoscape 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果共獲得108 個節(jié)點，1 778條邊。由于靶點太多，所以根據(jù)度值（Degree）、平均中心度（Betweenness Centrality, BC），緊密度（Closeness Centrality, CC）得到15 個節(jié)點，104 邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。根據(jù)度值把前6 作為關(guān)鍵靶點，見表4。

圖3 “丹參—苦參”作用房顫核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network diagram of core targets of Salvia miltiorrhiza and Sophora flavescens on the treatment of atrial fibilliation

表4 核心靶點PPI 度值前6 位Table 4 Top 6 degree values of core targets in PPI network

2.2.4 房顫核心靶點的GO 功能和KEGG 通路富集結(jié)果 通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對“丹參—苦參”治療房顫的核心靶點進行GO 分析。一共獲得417 條GO 功能，其中，190 條生物過程（Biological Process,BP），136條分子功能（Molecular Function,MF），91 條細胞組分（Cellular Component,CC）。BP 主要富集在激素應(yīng)答、細胞遷移、蛋白質(zhì)磷酸化和機體活動調(diào)節(jié)等；MF主要富集在激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合和信號受體活性調(diào)節(jié)等；CC 主要富集在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、細胞外基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，見圖4。

圖4 “丹參—苦參”治療房顫作用靶點GO 功能分析Fig.4 GO function analysis of the targets of"Salvia miltiorrhiza-Sophorae flavescentis"in the treatment of atrial fibrillation

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對丹參—苦參治療房顫的核心靶點進行KEGG 通路富集分析。以P ≤0.05 為標準進行篩選，按P 值從大到小對進行排序，可視化展示排名前20 的通路（圖5）。發(fā)現(xiàn)NF- B信號通路、cGMP-PKG信號通路、AMPK等通路為“丹參—苦參”治療房顫的關(guān)鍵通路。

圖5 “丹參—苦參”作用房顫核心靶點的KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of the core targets of"Salvia miltiorrhiza-Sophorae flavescentis"in the treatment of atrial fibrillation

2.3 分子對接結(jié)果

將“2.2.2”項獲取的關(guān)鍵活性成分槲皮素、木犀草素和丹參酮ⅡA與“2.2.3”獲得的關(guān)鍵靶點TNF、IL-6、AKT1、VEFA、IL-1 和CA3P3 進行分子對接。當受體與配體的結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定時，能量會越低，結(jié)合能越小，對接結(jié)果見圖6。當對接結(jié)合能≤ 29.288 kJ/mol 利用PyMOL 進行可視化分析（圖7）。

圖6 分子對接結(jié)合能熱圖Fig.6 Heat map of binding energy by molecular docking

圖7 結(jié)合能分子對接結(jié)果Fig.7 The results of molecular docking with binding energy

2.4 分子動力學模擬結(jié)果

為了闡明AKT1 和丹參酮ⅡA 對接復合物之間的蛋白質(zhì)配體穩(wěn)定性。本研究對結(jié)合能最高的分子對接結(jié)果AKT1 —丹參酮ⅡA 進行分子動力學模擬。如圖8A 示，經(jīng)過100 ns 的模擬，復合物RMSD 在40 ns后逐漸趨向于穩(wěn)定，65 ns 后幾乎恒定，處于0.45 nm穩(wěn)定范圍內(nèi)。蛋白與配體復合物的活性位點殘基（Trp80 A、Leu264 A、Lys268 A、Ser205 A、Val270 A、Tyr210 A 和Leu272A）的RMSF 值為（0.13±0.06）nm，表現(xiàn)出穩(wěn)定性（圖8B）。在整個模擬過程中，丹參酮ⅡA 與Ser205 A 形成了穩(wěn)定的氫鍵，在60 ns 之后幾乎沒有變化（圖8C）。經(jīng)過100 ns模擬的復合物（圖8D），穩(wěn)定狀態(tài)下AKT1 —丹參酮ⅡA 相互作用力包括：SER 205 與配體形成氫鍵；TRP 80 與配體間的Pi-Pi疏水堆積作用；VAL 270、TYR 與配體的Pi-Alkyl 疏水作用。

圖8 AKT1 和丹參酮ⅡA 分子動力學（MD）模擬分析Fig.8 Molecular dynamics (MD)simulation analysis of tanshinone ⅡA and AKT1

3 討論

房顫在中醫(yī)名為“心動悸”，歸屬于“心悸”、“怔忡”等范疇，其臨床表現(xiàn)為心悸、眩暈和胸痹等病癥[12]，多因心之陰血虧虛或者心氣不足，心主血脈功能受影響，導致心脈不暢，脈絡(luò)淤滯，心失所養(yǎng)導致[13]。在數(shù)據(jù)挖掘中，中醫(yī)用藥頻次統(tǒng)計顯示，前五的中藥有丹參、炙甘草、麥冬、桂枝和當歸，其中丹參的方劑占比達到48%；對高頻藥物進行Apriori 建模，根據(jù)頻數(shù)、支持度、置信度將“丹參—苦參”作為核心藥對。丹參性寒、味苦，具有益氣、活血化瘀功效，苦參具有清熱燥濕、利尿等功效?，F(xiàn)代藥理學顯示，丹參可以減少鈣離子內(nèi)流，延長心肌動作電位時間，從而達到抗心律失常[14]。苦參中主要含有生物堿、黃酮類等成分，能很好調(diào)節(jié)鈣通道、鉀通道等抑制房室折返性心動過速的發(fā)生，或抑制房室傳導，延長心肌細胞的有效不應(yīng)期[15]。從微觀層面來講，利用“苦參 丹參”對房顫進行網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，得到的前三核心成分為槲皮素、木犀草素和丹參酮ⅡA。槲皮素可能通過促進miR-135b 表達，抑制TGF- /Smads通路，抑制心房組織纖維化，從而減輕房顫[16]。丹參酮ⅡA 可以通過降低血清TNF- ，抑制炎癥因子的表達[17]。核心藥對“丹參 苦參”治療房顫的前6 核心靶點為TNF、IL-6、AKT1、VEGFA、IL-1 和CASP3。研究發(fā)現(xiàn)，TNF 家族是細胞因子家族，其炎癥細胞因子TNF- 信號轉(zhuǎn)導增加可能通過多種機制引起心律失常，可以促進心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)和收縮重塑，而且TNF- 通過激活p38-MAPK 途徑與耐力運動誘導的心房顫動有關(guān)[18]。研究表明，可以通過抑制IL-1誘導的IL-6 的釋放，伴有AKT 降低，來預防大鼠的房顫[19]。TNF- 、IL-6 和IL-1 等炎癥標志物與陣發(fā)性房顫轉(zhuǎn)為持續(xù)性房顫相關(guān)，可能成為預測房顫的生物標志物[18]。富集分析表明，靶點主要參與激素應(yīng)答、蛋白質(zhì)磷酸化，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和信號活性受體調(diào)節(jié)等；在膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域和細胞外基質(zhì)等發(fā)揮作用。核心信號通路可能作用NF- B 信號通路和cGMPPKG 等通路等發(fā)揮作用。NF- B信號通路可以通過下調(diào)心臟鈉通道的轉(zhuǎn)錄，從而影響氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)AF 離子通道、轉(zhuǎn)錄因子等，并可能成為AF 的作用靶點[20]。腺苷單磷酸激活蛋白激酶（AMPK）已被證明在脂肪酸和葡萄糖代謝的能量途徑發(fā)揮作用，陣發(fā)性房顫激活AMPK 以增加GLUT1/4 的表達，抗纖顫作用成為心房顫動治療的潛在靶點[21]。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA 與各個靶點對接結(jié)合均≤-20.92 kJ/mol，表現(xiàn)較強的親和力。結(jié)合性最好的是受體AKT1 和丹參酮ⅡA 的對接結(jié)合能為-38.62 kJ/mol，分子動力學模擬結(jié)果更加驗證這一結(jié)果，作為房顫的潛在靶點。綜上所述，本文對數(shù)據(jù)挖掘中醫(yī)藥治療房顫的處方進行整理，基于關(guān)聯(lián)規(guī)則得到用藥規(guī)律及核心藥對，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接和分子動力學研究初步揭示“丹參—苦參”有效活性成分及治療房顫的機制，為進一步“丹參—苦參”藥對治療房顫提供了理論依據(jù)。