呂 盈,徐 瑞,張琴琴,史般若,吳翹楚,魏 昕

微生物感染是牙髓根尖周病的主要病因,當牙體的硬組織受到破壞,例如齲壞、外傷、隱裂等,細菌侵入髓腔和根管并定植,混合菌叢存留于根管內(nèi),引起牙髓根尖區(qū)的感染和炎癥[1]。糞腸球菌是一種革蘭氏陽性厭氧球菌,起源于人類的口腔和胃腸道,可以在90%根管治療后疼痛和繼發(fā)感染的根管內(nèi)檢出[2]。白念珠菌在21%牙髓原發(fā)性感染的根管中被分離出[3],具有良好的環(huán)境適應(yīng)性和強大的毒力特性[4]。在有氧的條件下培養(yǎng),白念珠菌形成的生物膜提供了低氧微環(huán)境,有利于兼性厭氧菌糞腸球菌的生長[5]。鑒于白念珠菌和糞腸球菌在根管內(nèi)難于徹底去除,混合存在更容易引起頑固性、持續(xù)性、反復性感染,增加了根管治療的失敗率并導致根管再治療的預后風險[6]。對糞腸球菌和白念珠菌兩者混合感染的抗微生物研究,有助于克服混合感染所引起的頑固性根尖周病變。目前,對糞腸球菌和白念珠菌兩者混合感染根管的研究國內(nèi)外較少,有待進一步研究。

根管治療通過機械和化學預備有效地清除根管內(nèi)的感染物質(zhì),之后,通過根管充填和冠部封閉,隔絕微生物,保證了根管治療的預后效果[1]。化學沖洗作為根管治療一個重要步驟,采用有效的根管內(nèi)化學沖洗,可以清除根管內(nèi)多種微生物,將根管內(nèi)的感染降至最低。近年來臨床常用的沖洗藥物有不同濃度的NaClO、0.2%～2.0% CHX等[7]。其中NaClO具有優(yōu)異的抗菌性能和有機組織溶解能力[8]。CHX具有非常廣泛的抗菌譜,對革蘭氏陽性菌具有很強的抗菌性,也對酵母菌,某些皮膚蘚菌和親脂類病毒具有活性[9]。NaClO和CHX對標準牙根內(nèi)的混合感染的抗微生物效果國內(nèi)外均未見報道,有待進一步研究。

本部分實驗分別采用2.5% NaClO、2% CHX溶液和生理鹽水作為沖洗液進行根管消毒,評估沖洗液對根管內(nèi)糞腸球菌和白念珠菌混合感染微生物的清除效果,為牙髓根尖周病的治療中化學沖洗的選擇提供一定的實驗依據(jù)及臨床指導。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

白念珠菌標準株(SC5314)由上海第二軍醫(yī)大學藥學院遺傳工程國家重點實驗室饋贈。糞腸球菌(ATCC29212)由江蘇省口腔疾病研究重點實驗室提供。3% NaClO、2% CHX溶液(朗力,中國);3% Tween 80、10%硫代硫酸鈉(Sigma,美國);沙堡瓊脂培養(yǎng)基(SDA,6.3 g/100 mL);YPD培養(yǎng)液(2%葡萄糖,1%胰蛋白胨,1%酵母提取物);腦心浸腦液肉湯培養(yǎng)基(BHI,OXOID,英國);磷酸鹽緩沖液(PBS,諾唯贊,中國);細菌細胞活性測定試劑盒(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit,Life technologies,美國);2.5%戊二醛固定液(Leagene,中國);YCP系列二氧化碳培養(yǎng)箱(易亮醫(yī)療器械有限公司,中國);激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM, LSM 710,Carl Zeiss,德國);低速精密切割機(Isomet,美國);K銼(Dentsply,美國);NaviTip 30-G needle(Ultradent Products,美國);無菌胰島素注射器(BD,上海);ProTaper NEXT(DentsplyMaillefer,瑞士);機用馬達(VDW,Dentsply,美國);粘結(jié)劑(G-aenial Bond,GC,日本);復合樹脂(G-aenial,GC,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 離體牙的收集、處理 經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(PJ2018-026-001),于2018年10月—2019年5月在南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院共收集46顆成年人因正畸治療需要而拔除的單根下頜前磨牙。去除結(jié)石和軟組織,置于生理鹽水中,4 ℃冰箱內(nèi)保存。納入標準:①直單根、根尖發(fā)育完全;②牙科顯微鏡下牙齒未見折裂痕;③無充填物或修復體、未接受牙髓治療;④無牙髓或根尖周病、無牙髓鈣化、無發(fā)育異?；蝾M骨相關(guān)疾病。

1.2.2 標準牙根模型的制備 去除牙根面的軟組織及牙結(jié)石,低速切割機于釉牙骨質(zhì)界下截除冠部,標準化牙根長度為15 mm[10],#15 K銼疏通根管至根尖孔可見,此時的根長減去1 mm即為工作長度。使用ProTaper NEXT預備根管至F3[11],每次換銼,使用1 mL生理鹽水沖洗根管[12]。為了去除玷污層,預備結(jié)束后使用2 mL 17% EDTA沖洗根管,并將牙根放入17% EDTA溶液中超聲蕩洗3 min。將標準化牙根依次分別使用無菌水、2.5% NaClO、10%硫代硫酸鈉超聲蕩洗3 min,最后用生理鹽水蕩洗3 min[13]。干燥根管,流動樹脂封閉根尖孔,粘結(jié)劑封閉牙根表面[13],防止微生物從根尖孔或根管側(cè)支進入根管內(nèi)。將所有牙根浸沒在BHI液體培養(yǎng)基中,10 000 r/min,離心2 min[13],使得培養(yǎng)基浸入根管內(nèi)不規(guī)則區(qū)域,排空多余氣體,121 ℃高溫高壓滅菌20 min備用。消毒完成后牙根取樣,置于盛有BHI培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)48 h,若培養(yǎng)基透明,證明滅菌效果可靠,可進行下一步實驗;若培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,說明滅菌效果不可靠,需重新進行高壓滅菌。

1.2.3 標準感染牙根模型的制備 取糞腸球菌單克隆菌株于BHI液體培養(yǎng)基中,37 ℃,180 r/min搖床生長3～5 h至對數(shù)生長期;收集BHI液體培養(yǎng)基中對數(shù)生長狀態(tài)的細菌,16 000×g離心5 min,無菌PBS洗滌2次,細菌重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中,麥氏比濁儀計數(shù),制備成密度為1 McFarland的標準菌懸液。取白念珠菌單克隆菌株于YPD培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min搖床過夜達到對數(shù)生長期;收集YPD培養(yǎng)液中對數(shù)生長狀態(tài)的真菌,2 100×g離心10 min,無菌PBS洗滌2次,真菌重懸于RPMI 1640培養(yǎng)液中,麥氏比濁儀計數(shù),制備成密度為1×108個/mL的標準菌懸液。將2種菌懸液等比例混合,使用無菌胰島素注射器在標準化牙根內(nèi)注入100 μL混合菌液[14],并標準化牙根置入 3 mL混合菌液內(nèi),放置在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)28 d。每兩天更換1次新鮮培養(yǎng)基。每次更換培養(yǎng)液,取部分菌液,用BHI固體培養(yǎng)基檢測是否有雜菌污染。隨后,挑取不同的單菌落革蘭氏染色觀察微生物是否為糞腸球菌和白念珠菌。感染標準化牙根4周后,使用掃描電鏡(SEM)觀察標準化牙根感染模型是否建立。

1.2.4 不同沖洗液處理標準感染牙根模型 28 d后,超凈臺內(nèi)取出30個牙根,隨機分成2.5% NaClO組、2% CHX溶液組和生理鹽水組。在根管消毒之前,用3%過氧化氫濕潤無菌紗布清潔牙根外表面,再用2.5% NaClO濕潤無菌紗布消毒牙根外表面,然后用10%硫代硫酸鈉中和2.5% NaClO,并用生理鹽水沖洗牙根表面[13],以去除根管外部的微生物,避免影響根管內(nèi)微生物的取樣。隨后,使用30號雙側(cè)開口沖洗針頭和5 mL注射器進行根管沖洗。將橡膠止點放在距離針尖約14 mm處,所有的沖洗液均使用5 mL,緩慢沖洗2 min[15]。沖洗結(jié)束后,用1 mL 10%硫代硫酸鈉沖洗中和殘余的NaClO[13],1 mL 3% Tween 80用于中和CHX[16]。

1.2.5 標準感染牙根模型內(nèi)微生物的取樣 根管內(nèi)微生物取樣分為根管沖洗前(S1)和根管沖洗后(S2)。在根管沖洗前(S1),根管用1 mL生理鹽水輕輕沖洗,以去除未附著的微生物,采用3～5個無菌紙捻取菌,每次紙捻停留在根管內(nèi)1 min[17],1 min后取出紙捻,立即置入裝有1 mL生理鹽水的EP管中,震蕩1 min,之后10倍列梯度稀釋[15]。根管沖洗后(S2)的取樣方法同S1。取50 mL稀釋后的S1、S2菌液,分別接種到糞腸球菌培養(yǎng)基和SDA含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放置在37 ℃中培養(yǎng)至48 h,菌落計數(shù)。

1.2.6 CLSM樣本制備及觀察 取培養(yǎng)28 d混合感染的牙根12個,用2.5% NaClO、2% CHX溶液和生理鹽水分別處理后,使用玻璃離子封閉根管口。在唇頰側(cè)分別預備一個約0.5 mm深的淺凹槽,不破壞根管內(nèi)壁牙本質(zhì)。用錘子和鑿子沿凹槽將牙根一分為二:用CLSM觀察沖洗液對牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的殺菌作用。在避光的條件下,將劈好的牙根用現(xiàn)配的LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit進行染色,暗室下室溫孵育15 min。用1 mL PBS輕輕洗去未與牙根表面結(jié)合的熒光染色劑,吸干牙根表面的水分,保持牙根干燥,立刻置于CLSM下觀察。每個樣本隨機選取根管內(nèi)的3個不同區(qū)域,鏡頭放大20倍,步長為5 μm,SYTO 9的激發(fā)/發(fā)射波長為488/525 nm,propidium iodide(PI)的激發(fā)/發(fā)射波長為561/642 nm。使用ZEN軟件(Carl Zeiss,德國)進行拍攝,綠色熒光表示活菌,紅色熒光表示死菌,并測量距離根管內(nèi)壁牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物主要的抑制深度。

1.3 統(tǒng)計學方法

對于CFU計數(shù)分析,數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換并使用ANOVA和Tukey檢驗進行分析。CLSM數(shù)據(jù)使用Kruskal-Wallis檢驗進行分析,成對比較使用Mann-Whitney檢驗進行分析。使用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行分析,P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 標準化牙根感染模型的建立

使用掃描電鏡觀察標準化牙根感染模型是否建立:未接種微生物之前,牙本質(zhì)小管內(nèi)未見微生物。接種混合感染并培養(yǎng)4周后,牙本質(zhì)小管內(nèi)可見大量微生物,以糞腸球菌為主,其中可見少量白念珠菌(圖1)。

A:接種前;B:接種后

2.2 根管消毒后的糞腸球菌和白念珠菌的清除率

根管內(nèi)糞腸球菌和白念珠菌的微生物量在沖洗前的(S1)各組之間均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。根管沖洗后,2.5% NaClO和 2% CHX溶液對混合感染根管內(nèi)糞腸球菌和白念珠菌各自的清除率((S1-S2)/S1)均高于生理鹽水(P<0.05),而2.5% NaClO和 2% CHX之間的對混合感染根管內(nèi)糞腸球菌和白念珠菌各自的清除率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。不同沖洗液對混合感染根管內(nèi)微生物的清除率見表1。

表1 不同沖洗液對混合感染根管內(nèi)微生物的結(jié)果

2.3 CLSM觀察

生理鹽水組的CLSM圖像顯示牙本質(zhì)小管內(nèi)可見綠色熒光(代表活細菌),而沒有任何紅色熒光(代表死細菌),即生理鹽水對牙本質(zhì)小管內(nèi)混合微生物無抑制作用;此外,在生理鹽水組中,牙本質(zhì)小管中的綠色熒光長度在根上、根中和根尖部均超過400 μm。2% CHX組的CLSM圖像顯示牙本質(zhì)小管內(nèi)可見少量的紅色和黃色,并伴有大量的綠色熒光。2.5% NaClO組的CLSM圖像顯示牙本質(zhì)小管內(nèi)可見大量紅色熒光,并伴有少量黃色熒光。2.5% NaClO在根上、根中、根尖部牙本質(zhì)小管內(nèi)的微生物抑制深度顯著高于2% CHX(P<0.05);2.5% NaClO對根上、根中和根尖區(qū)根管牙本質(zhì)小管內(nèi)混合微生物的抑制作用依次遞減。2.5% NaClO、2% CHX對于根上部、根中部、根尖區(qū)牙本質(zhì)小管內(nèi)混合微生物的抑制作用見表2和圖2。

表2 不同沖洗液對于牙本質(zhì)小管內(nèi)混合微生物的抑制深度

3 討 論

根管沖洗是根管治療成功不可或缺的一部分,其主要目的是控制感染,因此根管沖洗液應(yīng)具備一定的抗微生物性能[1]。NaClO由于其廣譜抗微生物的性能,同時可以促進感染牙髓及其他有機物溶解,在臨床上廣泛研究。NaClO在臨床中可用的濃度范圍為0.50%～5.25%,其抗微生物性能和細胞毒性均隨濃度升高而升高,為保留其抗微生物性能而盡可能減少其細胞毒性,最廣泛研究的濃度為2.5%[7]。CHX雖不能溶解有機組織,但具有顯著的抗菌作用和相對較低的毒性作用。本研究對2.5% NaClO、2% CHX溶液在對標準牙根模型中根管混合感染的抗微生物作用進行探討。

糞腸球菌和白念珠菌混合生物膜的毒性可加劇根尖周病變和骨吸收[18]。本實驗在標準牙根模型中建立了糞腸球菌和白念珠菌混合感染的根管模型,這種模型較單一感染的模型更貼近臨床實際。混合培養(yǎng)28 d之后,在根管沖洗前對根管內(nèi)的微生物培養(yǎng)并菌落計數(shù)發(fā)現(xiàn),糞腸球菌的生物數(shù)量明顯多于白念珠菌;同時對建模的混合感染根管CLSM結(jié)果表明微生物在牙本質(zhì)小管中的滲透深度在根上、根中和根尖部均超過400 μm,且牙本質(zhì)小管內(nèi)主要以糞腸球菌侵入為主。研究表明,體外建模的酵母菌可以侵入牙本質(zhì)小管內(nèi)的深度為10～150 μm[19],而糞腸球菌可以侵入牙本質(zhì)小管深度400 μm[20],甚至達到700 μm[17]。這可能由于糞腸球菌的直徑小于白念珠菌,且根管內(nèi)空間較小,不適合需氧的白念珠菌的生長,更適合兼性厭氧菌糞腸球菌,因此糞腸球菌可以大量繁殖,這也是糞腸球菌更易造成嚴重感染的原因。

菌落CFU計數(shù)是目前檢測根管內(nèi)微生物清除作用的常用檢測方法,但無菌紙捻只能收集主根管內(nèi)的微生物,對于復雜根管內(nèi)較隱蔽區(qū)域的微生物無法采集。對于牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的抑制作用,如果僅是利用菌落CFU計數(shù)法檢測,在操作過程中可能對微生物細胞壁造成破壞。此外,菌落CFU計數(shù)中微生物培養(yǎng)法靈敏度低,若提取的細菌數(shù)量不足,則在固體培養(yǎng)基上無細菌生長,并不一定意味著根管內(nèi)無微生物存活[21]。這是菌落CFU計數(shù)的局限性,在分析結(jié)果時應(yīng)予以考慮。從本研究的菌落CFU計數(shù)結(jié)果顯示,2.5% NaClO和2% CHX對根管內(nèi)混合微生物均有較好的清除作用,且兩者對根管內(nèi)糞腸球菌和白念珠菌的清除效果未見明顯統(tǒng)計學差異。Meta分析的結(jié)果也表明:同一種鎳鈦器械預備時,CHX和NaClO用于根管沖洗時,兩者對于根管內(nèi)微生物的清除作用差異無統(tǒng)計學意義[7]。這與本實驗的研究結(jié)果一致。

本研究中采用CLSM來獲得混合感染在根管內(nèi)的位置(樣本中的空間分布)和滲透深度等的完整信息,以彌補菌落計數(shù)的不足。CLSM是將生物膜可視化處理的首選,可以在不破壞細胞或組織的狀態(tài)下,觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu),并對其進行實時的檢測,實現(xiàn)細胞及微生物三維重建和成熟生物膜重建[22]。CLSM的結(jié)果表明,2.5% NaClO對根管內(nèi)微生物的抑制深度在根上部>400 μm,根中部為 300～400 μm,根尖區(qū)為150～200 μm;2.5% NaClO對根尖區(qū)混合微生物的抑制作用明顯低于根上部和根中部,這符合沖洗液滲入根尖區(qū)牙本質(zhì)小管的能力低于其在根上及根中部的研究結(jié)論[23]。根尖區(qū)牙本質(zhì)小管的結(jié)構(gòu)似乎和其他部位存在一定的差異[24],這在一定程度上或許可以解釋,沖洗液對于根尖區(qū)牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的抑制作用較差。2.5% NaClO對于根上、根中、根尖區(qū)牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的抑制深度明顯優(yōu)于2% CHX。2% CHX雖然對于根管內(nèi)微生物的清除具有一定作用,但對于根管上、中、下三部分的牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的抑制作用僅限于牙本質(zhì)小管的淺層,這或許與根管沖洗液本身的滲透性有關(guān)。CLSM的結(jié)果也進一步證明,兩種沖洗液對牙本質(zhì)小管內(nèi)混合微生物均無法完全抑制,對根管內(nèi)混合感染更有效的沖洗液有待進一步研究。

菌落計數(shù)顯示2.5% NaClO和2% CHX對于標準牙根感染根管內(nèi)的微生物的清除作用明顯高于生理鹽水,CLSM結(jié)果進一步顯示2.5%NaClO對于牙本質(zhì)小管內(nèi)微生物的抑制作用明顯優(yōu)于 2% CHX。2.5% NaClO對于混合感染根管的抗微生物作用最好,可以在臨床中用于糞腸球菌和白念珠菌混合感染的沖洗。