曹妮達(dá)，李朝燕，2，華逢春，3，馬芳琪，王 強(qiáng)，高 峰，朱瑩杰

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腫瘤一科（上海 200032）；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中醫(yī)科（上海200025）；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（上海 200032）

胰腺癌是高度惡性的腫瘤之一，居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第11位，病死率第7位［1］。由于早期多為非特異性癥狀，約60%的胰腺癌患者在確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，25%的患者為局部晚期，不能行根治性切除，而接受姑息化療者的中位生存時(shí)間僅8.8～11.1 個(gè)月［2-5］，且已知藥物靶點(diǎn)如Ras 和BRCA 突變等在胰腺癌中發(fā)生率低下，靶向和免疫治療均尚未在胰腺癌中有腫瘤控制和生存期增加方面的顯著性突破［6-7］，預(yù)后極差。因此，探究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等方面調(diào)控的信號(hào)通路，進(jìn)而從分子水平尋求治療靶點(diǎn)仍是當(dāng)前基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。

白介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（IL-6/STAT3）信號(hào)通路是參與免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化以及造血等多種生理過程的經(jīng)典信號(hào)通路［8］。IL-6 是由位于腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞本身）產(chǎn)生的細(xì)胞因子，直接作用于腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)STAT3 靶基因的表達(dá)，然后編碼驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞增殖和/或存活的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)STAT3的持續(xù)激活、腫瘤的發(fā)生、血管生成、免疫抑制及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等過程［9］。多項(xiàng)研究［10-14］顯示，在肝癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、白血病等多種人及鼠的惡性腫瘤中有STAT3 的過度激活及表達(dá)，但在胰腺癌中的研究報(bào)道較少。

全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室導(dǎo)師、上海市名中醫(yī)邱佳信教授提出脾虛在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的重要作用，并創(chuàng)立中藥復(fù)方WCAP，臨床用于治療胰腺癌30 余年。WCAP 以健脾益氣為主，輔以清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)。前期相關(guān)研究［15-17］提示，與化療組比較，化療聯(lián)合中藥復(fù)方WCAP 組可降低晚期胰腺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)48%，同時(shí)可改善根治術(shù)后患者的預(yù)后，提高患者生存質(zhì)量，并能抑制BxPC-3裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，提高血清自然殺傷（NK）細(xì)胞水平。為明確該復(fù)方中不同治則成分對(duì)腫瘤的抑制情況，以及單用清熱解毒藥或軟堅(jiān)散結(jié)藥是否有更強(qiáng)的抑瘤作用，本研究通過BxPC-3細(xì)胞株懸液形成胰腺癌裸小鼠皮下接種瘤模型，觀察中藥復(fù)方WCAP 及其拆方對(duì)裸小鼠皮下腫瘤、瘤組織中IL-6/STAT3 通路及其下游靶基因mRNA 及蛋白表達(dá)水平的影響，探索中藥復(fù)方WCAP 中對(duì)胰腺癌的抑瘤機(jī)制，并為深入機(jī)制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 動(dòng)物 6～8 周齡雄性裸小鼠（BALB/C）30 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量17～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)要求飼養(yǎng)并管理，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（滬）2016-0004。

1.1.3 藥物與試劑 WCAP 方由太子參12 g、炒白術(shù)12 g、茯苓15 g、龍葵30 g、紅藤30 g、芙蓉葉30 g、生牡蠣30 g、夏枯草9 g、半夏9 g、壁虎4.5 g、雞內(nèi)金15 g 組成。處方以健脾益氣、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)為治則，故拆方為健脾藥、清熱解毒藥和軟堅(jiān)散結(jié)藥。健脾藥物：太子參12 g，炒白術(shù)12 g，茯苓15 g，雞內(nèi)金15 g；清熱解毒藥物：龍葵30 g，紅藤30 g，芙蓉葉30 g；軟堅(jiān)散結(jié)藥物：生牡蠣30 g，夏枯草9 g，半夏9 g，壁虎4.5 g。復(fù)方組藥物即原方。所有藥物來自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房，單味生藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科主任中藥師奚燕鑒定為正品。

5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業(yè)有限公司（批號(hào)：090906）；原癌基因c-myc（c-myc）蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、IL-6，美國(guó)Sigma公司（批號(hào)分別為ab32072、ab134175、ab46154、ab92536、ab6672）；磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3），美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司（批號(hào)：T5625）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，美國(guó)CST公司（批號(hào)：#5174）；山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：A0208）；山羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗，碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：A0216）；SYBR GREEN qPCR Super Mix（qPCR 試劑盒），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：#K0223）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Fermentas 公司（批號(hào)：#K1622）；氯仿，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（批號(hào)：10023419）；TRIzol試劑，美國(guó)Invitrogen 公司（批號(hào)：1596-026）；蛋白質(zhì)定量試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司（批號(hào)：PICPI23223）。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo 株式會(huì)社（型號(hào)：MCO-18AIC）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，瑞士Roche 公司（型號(hào)：Cedex XS）；超凈工作臺(tái)，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司（型號(hào)：AlphaClean 1300）；PCR分析儀，美國(guó)ABI公司（型號(hào)：StepOne Plus）；蛋白垂直電泳系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司（型號(hào)：Mini-PROTEAN Tetra Cell）；轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司（型號(hào)：Trans-Blot Turbo）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司（型號(hào)：EC3 410）。

1.2 造模 建立人胰腺癌BxPC-3 細(xì)胞裸小鼠皮下移植瘤模型［18］。采用人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3 體外傳代培養(yǎng)，經(jīng)胰酶消化制成細(xì)胞懸液，將1×106個(gè)（0.2 mL）細(xì)胞懸液接種于裸小鼠右前肢腋窩處皮下，每天觀察成瘤情況并記錄。

1.3 分組與干預(yù) 將30 只裸小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、5-FU組、復(fù)方組、健脾組、清熱解毒組和軟堅(jiān)散結(jié)組，共6 組，每組5 只。以70 kg 成人體質(zhì)量計(jì)算用藥劑量，按人與裸小鼠藥物等效劑量進(jìn)行轉(zhuǎn)換［19］，折算每1 kg 裸小鼠需要的用藥劑量，按每10 g 小鼠體質(zhì)量灌胃量體積0.2 mL，計(jì)算得到各組藥物煎煮濃度。不同干預(yù)組藥物于同一天、同一煎藥房分別進(jìn)行煎煮。藥材以清水浸泡30 min，煎煮30 min 后倒出藥汁，將藥汁按所需藥物濃度進(jìn)行濃縮。各組于裸小鼠造模后第2 天開始干預(yù)：復(fù)方組、健脾組、清熱解毒組、軟堅(jiān)散結(jié)組分別給予相應(yīng)的中藥煎劑灌胃（每只裸小鼠0.4 mL/d，以下灌胃藥液體積均同），并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液0.04 mL 腹腔內(nèi)注射，1 次/周；5-FU 組予5-FU 0.04 mL（即1 mg）腹腔內(nèi)注射，1 次/周，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液0.4 mL灌胃，1次/d；空白對(duì)照組予質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃，1 次/d，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液0.04 mL 腹腔內(nèi)注射，1次/周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 裸小鼠皮下移植瘤抑瘤率 造模后第43 天，稱取裸小鼠體質(zhì)量，采用頸椎脫臼法處理后，完整地剝出瘤體，去除表面脂肪組織，稱取瘤質(zhì)量。抑瘤率=（空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量-各治療組平均瘤質(zhì)量）/空白對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4.2 IL-6/STAT3 通路及下游靶基因mRNA 的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）法檢測(cè)小鼠瘤組織中IL-6/STAT3 通路及下游靶基因（c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6、p-STAT3）mRNA的表達(dá)。取得裸小鼠瘤體組織后，以TRIzol 法提取瘤組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μL，根據(jù)試劑說明書操作，按條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃、60 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min。擴(kuò)增引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成（見表1）。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s；40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的表達(dá)為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4.3 IL-6/STAT3 通路及下游靶基因蛋白的表達(dá) 采用Western blot檢測(cè)IL-6/STAT3通路及下游靶基因涉及的c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6、p-STAT3 蛋白的表達(dá)。取得裸鼠瘤體組織后，將瘤體組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg 組織加入150～250 μL 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱，采用蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。部分上清加入4倍濃度上樣緩沖液，100 ℃水浴10 min，置于4%電泳濃縮膠濃縮，10%蛋白電泳分離膠分離，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，加入相應(yīng)的一抗4 ℃暗盒過夜，洗膜液洗膜3 次，10 min/次。加入相應(yīng)的二抗37 ℃孵育1 h，洗膜液洗膜3 次，10 min/次，采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑熒光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯色，用凝膠成像儀拍照，以ImageJ 軟件進(jìn)行灰度分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/同一樣本內(nèi)參表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均數(shù)間多重比較采用最小顯著差法（LSD 檢驗(yàn)）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)裸小鼠皮下移植瘤抑瘤率的影響 與空白對(duì)照組比較，各治療組瘤質(zhì)量均減輕，瘤體積均減小，抑瘤率由低到高分別為健脾組35.87%、清熱解毒組49.05%、軟堅(jiān)散結(jié)組64.60%、復(fù)方組70.48%、5-FU 組78.25%，WCAP 復(fù)方及其拆方和5-FU 組均可抑制裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，5-FU 組和軟堅(jiān)散結(jié)組裸小鼠體質(zhì)量降低（P<0.05），復(fù)方組、健脾組、清熱解毒組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。復(fù)方組抑瘤率高于各拆方組，各拆方組中，軟堅(jiān)散結(jié)組抑瘤率最高（P<0.05）。與5-FU組比較，復(fù)方組、健脾組、清熱解毒組和軟堅(jiān)散結(jié)組瘤體積較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與5-FU 組比較，健脾組、清熱解毒組、軟堅(jiān)散結(jié)組瘤質(zhì)量較重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但復(fù)方組瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與復(fù)方組比較，健脾組和清熱解毒組瘤體積較大，瘤質(zhì)量較重，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但軟堅(jiān)散結(jié)組瘤體積及瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與健脾組比較，清熱解毒組和軟堅(jiān)散結(jié)組瘤體積較小，瘤質(zhì)量較輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與清熱解毒組比較，軟堅(jiān)散結(jié)組瘤體積較小，瘤質(zhì)量較輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組裸小鼠皮下移植瘤抑瘤情況比較

表2 各組裸小鼠瘤質(zhì)量、抑瘤率等比較（n=5，±s）

表2 各組裸小鼠瘤質(zhì)量、抑瘤率等比較（n=5，±s）

注：5?FU 為5?氟尿嘧啶。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與5?FU 組比較，#P<0.05；與復(fù)方組比較，△P<0.05；與健脾組比較，▽P<0.05；與清熱解毒組比較，▲P<0.05。

組別空白對(duì)照組5-FU組復(fù)方組健脾組清熱解毒組軟堅(jiān)散結(jié)組體質(zhì)量/g 24.82±0.26 23.44±0.26*22.98±0.78 23.35±1.07 24.61±0.49 23.11±0.13*瘤體積/mm3 2 095.64±216.00 281.22±31.21*606.73±68.37*#1 301.02±27.36*#△1 023.05±156.35*#△▽775.23±36.95*#▽▲抑瘤率/%-78.25 70.48 35.87 49.05 64.60瘤質(zhì)量/g 2.10±0.18 0.46±0.19*0.62±0.04*1.35±0.07*#△1.07±0.11*#△▽0.73±0.03*#▽▲

2.2 對(duì)裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA 表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，復(fù)方組、軟堅(jiān)散結(jié)組和5-FU 組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)降低（P<0.05）。而健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與5-FU 組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)升高（P<0.05）。與復(fù)方組比較，健脾組cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)升高（P<0.05），清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)升高（P<0.05）。與健脾組比較，軟堅(jiān)散結(jié)組cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA 表達(dá)升高（P<0.05）。與清熱解毒組比較，軟堅(jiān)散結(jié)組c-myc、cyclin D1、VEGF、IL-6和p-STAT3的mRNA表達(dá)升高（P<0.05）。見表3。

表3 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA表達(dá)比較（n=5，±s）

表3 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因mRNA表達(dá)比較（n=5，±s）

注：c?myc為原癌基因c?myc基因，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1基因，VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因，MMP?2為基質(zhì)金屬蛋白酶?2基因，IL?6為白介素?6基因，p?STAT3為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3基因。5?FU 為5?氟尿嘧啶。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與5?FU 組比較，#P<0.05；與復(fù)方組比較，△P<0.05；與健脾組比較，▽P<0.05；與清熱解毒組比較，▲P<0.05。

p?STAT3 0.59±0.11 0.12±0.01*0.19±0.03*0.51±0.04#△0.54±0.08#△0.30±0.01*#▽▲組別空白對(duì)照組5-FU組復(fù)方組健脾組清熱解毒組軟堅(jiān)散結(jié)組c?myc 0.82±0.27 0.12±0.01*0.23±0.02*0.46±0.05#0.68±0.20#△0.32±0.01*▲cyclin D1 0.73±0.24 0.11±0.01*0.20±0.01*0.50±0.05#△0.64±0.15#△0.26±0.01*▽▲VEGF 1.15±0.30 0.20±0.02*0.36±0.02*0.88±0.08#△0.85±0.14#△0.56±0.02*#▽▲MMP?2 0.90±0.21 0.20±0.04*0.35±0.07*0.72±0.04#△0.78±0.15#△0.53±0.01*#IL?6 0.54±0.19 0.09±0.02*0.11±0.01*0.38±0.01#△0.49±0.14#△0.15±0.02*▽▲

2.3 對(duì)裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，復(fù)方組和5-FU 組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6 和p-STAT3的蛋白表達(dá)均降低（P<0.05），軟堅(jiān)散結(jié)組c-myc、MMP-2 和IL-6 的蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）。健脾組和清熱解毒組c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2、IL-6 和p-STAT3 的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與5-FU 組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc、VEGF 和IL-6的蛋白表達(dá)升高（P<0.05），軟堅(jiān)散結(jié)組c-myc 和IL-6 的蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與復(fù)方組比較，健脾組和清熱解毒組c-myc 和IL-6 的蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達(dá)情況

表4 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達(dá)比較（n=5，±s）

表4 各組裸小鼠皮下移植瘤IL-6/STAT3通路及下游靶基因蛋白表達(dá)比較（n=5，±s）

注：c?myc為原癌基因c?myc，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，VEGF 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，MMP?2為基質(zhì)金屬蛋白酶?2，IL?6為白介素?6，p?STAT3為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3。5?FU為5?氟尿嘧啶。與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與5?FU組比較，#P<0.05；與復(fù)方組比較，△P<0.05。

p-STAT3 3.18±0.89 1.16±0.11*1.37±0.25*2.76±0.77 2.73±0.74 2.13±0.76組別空白對(duì)照組5-FU組復(fù)方組健脾組清熱解毒組軟堅(jiān)散結(jié)組c-myc 3.03±0.47 0.68±0.02*1.06±0.08*2.41±0.44#△2.43±0.50#△1.78±0.38*#cyclin D1 3.46±0.72 1.20±0.45*1.73±0.29*2.84±0.94 2.84±1.10 2.19±0.72 VEGF 3.05±0.68 1.11±0.44*1.42±0.30*2.46±0.59#2.63±0.56#2.04±0.37 MMP-2 2.65±0.45 8.20±0.42*1.29±0.39*2.17±0.64 2.16±0.61 1.69±0.31*IL-6 3.90±0.66 1.06±0.11*1.66±0.23*3.16±0.24#△3.05±0.50#△2.41±0.54*#

3 討論

目前，外科手術(shù)是唯一可能治愈胰腺癌的手段，但由于胰腺癌隱匿性高、缺乏早期臨床特異性癥狀，只有小部分患者在診斷時(shí)適合進(jìn)行手術(shù)切除；而即便已行切除，仍因其對(duì)傳統(tǒng)治療手段欠敏感、局部復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高的特征，患者的5年生存率不足10%。中醫(yī)古典文獻(xiàn)中并無“胰腺癌”的具體病名，但有類似胰腺癌的論述，例如“脾病，當(dāng)臍有動(dòng)氣，按之牢若痛。動(dòng)氣筑筑然，堅(jiān)牢如有積而硬，若似痛也，甚則亦大痛，有是則脾虛病也”（《脾胃論》），相關(guān)描述與胰腺癌上腹痛和腹塊癥狀相似。

“邪之所湊，其氣必虛”，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與脾密切相關(guān)，究其根源是脾虛所致。李東垣在《蘭室秘藏》中指出：“推其百病之源，皆因飲食勞倦，而胃氣元?dú)鉂u散，不能滋榮百脈、灌溉臟腑、衛(wèi)護(hù)周身之所致也。”健脾扶正是中醫(yī)治療胰腺腫瘤的基本法則，WCAP 是邱佳信教授及其團(tuán)隊(duì)以健脾法為主，辨證結(jié)合清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)等法形成的治療胰腺癌的中藥復(fù)方。臨床研究［16］提示，遵循該法則的中藥復(fù)方是影響胰腺癌患者生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，可以改善根治術(shù)后以及晚期胰腺癌患者的生存期，西醫(yī)綜合治療聯(lián)合中藥的晚期胰腺癌患者生存期為12.7 個(gè)月，較單純西醫(yī)綜合治療患者的9.9個(gè)月顯著延長(zhǎng)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌的發(fā)生與局部慢性炎癥密切相關(guān)。為探討單用清熱解毒或軟堅(jiān)散結(jié)等“祛邪”藥物力量能否取得與復(fù)方類似的腫瘤抑制作用，課題組開展了本次復(fù)方與拆方的研究。本研究通過BxPC-3細(xì)胞株懸液制備胰腺癌裸小鼠皮下接種瘤模型，研究中藥復(fù)方WCAP 及其拆方對(duì)裸小鼠皮下腫瘤的影響，觀察復(fù)方WCAP中對(duì)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株裸小鼠皮下瘤產(chǎn)生影響的可能成分。本研究結(jié)果顯示，抑瘤率由低到高分別為健脾組、清熱解毒組、軟堅(jiān)散結(jié)組、復(fù)方組、5-FU 組，提示W(wǎng)CAP 及其拆方和5-FU 組均可抑制裸小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)（P<0.05）；各拆方組中，軟堅(jiān)散結(jié)組抑瘤率最高。而裸小鼠體質(zhì)量結(jié)果顯示，5-FU組和軟堅(jiān)散結(jié)組裸小鼠體質(zhì)量降低（P<0.05），復(fù)方組、健脾組、清熱解毒組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與臨床所見化學(xué)療法患者干預(yù)早期多見腫瘤明顯縮小，但后期多合并有體質(zhì)量下降等惡病質(zhì)相似；各拆方組中，健脾組抑瘤率雖遜于軟堅(jiān)散結(jié)組，但后者小鼠體質(zhì)量也明顯降低，而加入健脾藥物的復(fù)方組抑瘤率高于軟堅(jiān)散結(jié)組，小鼠體質(zhì)量也無顯著降低，體現(xiàn)出中醫(yī)治療注重整體觀念，扶正和祛邪并重，不可一味攻邪，不拘泥于一時(shí)瘤體的大小。本研究提示，復(fù)方WCAP 組方合理，健脾益氣藥物扶助人體正氣為治本，清熱解毒聯(lián)合軟堅(jiān)散結(jié)祛邪外出為治標(biāo)，寓攻于補(bǔ)，一方面使機(jī)體不斷適應(yīng)內(nèi)在環(huán)境，達(dá)到新的“穩(wěn)態(tài)平衡”，另一方面可充分調(diào)節(jié)體內(nèi)抗瘤機(jī)制，聯(lián)合化療使腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，甚至使腫瘤縮小。這與臨床上接受中醫(yī)藥干預(yù)的化療患者較單純化療患者消化道反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)減少、生活質(zhì)量改善的現(xiàn)象相符；這也提示臨床，腫瘤前期及中期，如人體正氣尚強(qiáng)，在扶正基礎(chǔ)上，清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)等祛邪藥物劑量可稍大，以達(dá)抗瘤的目的，而至腫瘤晚期，正氣耗損，則需注重扶正健脾對(duì)改善生活質(zhì)量、長(zhǎng)期生存的重要作用。

胰腺癌的發(fā)生是多環(huán)節(jié)、多步驟參與的復(fù)雜過程，尤其炎癥反應(yīng)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，IL-6是STAT3 重要的細(xì)胞活化因子，通過自分泌或旁分泌途徑作用于受體IL-6 Rα 和共同受體gpl30 激活JAK/STAT 信號(hào)通路，從而誘發(fā)腫瘤［20-21］。其信號(hào)通路受細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外信號(hào)刺激，作用于細(xì)胞核內(nèi)特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移。c-myc 基因編碼蛋白質(zhì)是一種短半衰蛋白，能調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶（LDH-A）、細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)［22］，從而介導(dǎo)細(xì)胞外的傳入生物信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡［23］。cyclin D1 是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的正性調(diào)控因子，同時(shí)又是STAT3 的靶作用物之一。cyclin D1 在一定的條件下可被STAT3 激活，異常高表達(dá)cyclin D1可明顯減少G1期，促進(jìn)細(xì)胞通過G-S調(diào)控點(diǎn)，引發(fā)細(xì)胞周期的紊亂和增殖失調(diào)［24-25］。持續(xù)性激活的STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管重建、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用，磷酸化STAT3蛋白可使MMP-2過度表達(dá)，導(dǎo)致基質(zhì)降解，進(jìn)而有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。VEGF 是促進(jìn)血管新生的生長(zhǎng)因子，STAT3 在VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，持續(xù)激活STAT3能誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤形成新生血管［26］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察IL-6/STAT3信號(hào)通路上相關(guān)靶基因的表達(dá)，探討中藥復(fù)方WCAP 及其拆方治療胰腺癌的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，中藥復(fù)方WCAP 可下調(diào)c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的mRNA 和蛋白表達(dá)，說明WCAP 有抑制胰腺癌增殖及轉(zhuǎn)移的作用，與前期WCAP 可抑制胰腺癌生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致［18］。與此同時(shí)，各拆方組中，僅軟堅(jiān)散結(jié)組藥物體現(xiàn)出c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的mRNA 表達(dá)降低和c-myc、MMP-2 蛋白的表達(dá)降低，其他拆方組則未顯示出差異，這也與軟堅(jiān)散結(jié)組小鼠在所有拆方組中體質(zhì)量最輕、瘤體最小的情況相符。從另一角度提示，各拆方可通過協(xié)同作用，將抗腫瘤的整體作用最大化，使得WCAP 復(fù)方在抑瘤率、小鼠帶瘤體質(zhì)量及IL-6/STAT3 通路及其下游靶基因調(diào)控方面作用更好。同時(shí)WCAP 可下調(diào)IL-6及p-STAT3的mRNA 和蛋白的表達(dá)，顯示出WCAP 的抗腫瘤作用機(jī)制可能是通過抑制IL-6/STAT3 信號(hào)通路的活化并下調(diào)相關(guān)基因c-myc、cyclin D1、VEGF、MMP-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究從IL-6/STAT3 信號(hào)通路角度闡述中藥復(fù)方WCAP 及其拆方治療胰腺癌的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)支持。進(jìn)一步完善針對(duì)該信號(hào)通路的靶向治療機(jī)制，可能對(duì)治療胰腺癌起到積極的作用，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定、緩解乃至更加理想的治療效果。但是，由于胰腺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多條通路、多靶點(diǎn)的共同作用，需在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中探尋中藥復(fù)方WCAP 抑制胰腺癌細(xì)胞的具體靶點(diǎn)，為中藥治療胰腺癌尋找更適合的途徑。