周 晶，衛(wèi)真真，浦勻舟，李 玲，朱惠蓉，季 青，李紅山

1.浙江省寧波市第二醫(yī)院中西醫(yī)結合肝病科（浙江 寧波 315010）；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腫瘤科（上海 201203）；3.上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院實驗醫(yī)學中心（上海 201803）；4.浙江省消化系統(tǒng)腫瘤診治及研究重點實驗室（浙江 寧波 315010）

大腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，40%～50%的大腸癌患者確診時已屬晚期［1-2］。西妥昔單抗（CET）是針對表皮生長因子受體（EGFR）研制的靶向藥物，可顯著延長KRAS野生型晚期大腸癌患者的總生存期［3］。近年來，靶向治療已經成為改善晚期大腸癌患者生存預后的重要手段，但由于耐藥問題，CET的臨床反應率僅為15%～20%［4］。原發(fā)和繼發(fā)耐藥是CET臨床應用的瓶頸，亟待解決。課題組前期研究［5］發(fā)現，左金丸（ZJW）具有抑制腸癌細胞增殖、促進腸癌細胞凋亡和逆轉化療藥物多藥耐藥的作用，其機制與調控核因子-κB（NF-κB）信號通路相關。本研究以KRAS突變人結腸癌HCT116細胞為原發(fā)耐藥模型，從體內、體外兩個方面研究ZJW 對CET 耐藥的逆轉作用，以期為抗靶向治療耐藥中藥的進一步開發(fā)應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞KRAS突變人結腸癌細胞HCT116，購自中國科學院細胞庫，由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腫瘤實驗室保存。使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基［含10%胎牛血清（FBS），100 U/mL 青霉素-鏈霉素混合液］培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，單層生長，實驗時取對數生長期的細胞。

1.1.2 動物 SPF 級雌性裸鼠16 只，4～6 周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（動物生產許可證號：SCXK2017-0005），保持在特定的無病原體條件下進行研究?？刂剖覝?0 ℃，相對濕度60%，12 h/12 h 明暗循環(huán)，自由飲水，實驗前12 h 禁食。動物實驗方案獲得上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查批準（倫理編號：PZSHUTCM200724027），所有實驗小鼠均根據動物倫理學標準進行實驗，并符合《中國實驗動物管理條例》的規(guī)定和一般建議。

1.1.3 藥物及試劑 制吳茱萸（批號：111209）、黃連（批號：111028），購于上?？禈蛩帢I(yè)有限公司，由上海中醫(yī)藥大學中藥研究所制備水提物并進行質量控制。按ZJW 原方比例（黃連∶吳茱萸為6∶1）稱取中藥飲片，用乙醇（1∶8，V/V）回流提取混合物（70 g）2 次，每次1 h。濾液濃縮后真空干燥，溫度為-80 ℃，干粉得率為21.2%。實驗前稱取適量醇提物干粉，用電子天平準確稱量，溶于1 mL 二甲亞砜（DMSO）中，經超聲渦旋使其充分溶解，0.22 μm 濾器過濾并配制成濃度為1 g·mL-1的ZJW 溶液，4 ℃保存，用于后續(xù)實驗。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測ZJW 溶液中表小檗堿、小檗堿、黃連堿、吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量，從而進行質控。

CET 注射液（100 mg/20 mL），德國默克公司（批號：G009QB）；CCK-8 檢測試劑盒，日本同仁株式會社（批號：CK04）；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司（批號：C1052）；細胞凋亡檢測試劑盒（FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I），美國BD pharmingen公司（批號：556547）；BCA蛋白分析試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司（批號：P0012S）；參照樣品，賽默飛世爾科技（中國）有限公司（批號：26617）；ECL 化學發(fā)光液，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司（批號：SQ201）；NF-κB p65兔抗、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）p65 兔抗、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）鼠抗、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）兔抗、β-肌動蛋白（β-actin）兔抗，美國Cell Signaling Technology 公司（批號分別為8242、3033、15071、9664、4970）；HRP 標記山羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔二抗、Cy3標記山羊抗兔二抗，上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為A0208、A0423、A0516）；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）預混液（HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR）、定量PCR 檢測試劑盒（ChamQ SYBR qPCR Master MixPCR），南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司（批號分別為R222-01、Q311-02）。

1.1.4 主要儀器 電子天平，德國Sartorius公司（型號：ES120）；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國ThermoFisher 公司（型號：FORMA 3111）；超凈工作臺，新加坡ESCO 公司（型號：SVE-6A1）；倒置相差顯微鏡，日本Olympus 株式會社（型號：CKX41/U-RFLT50）；酶聯免疫檢測儀，美國Biotek 公司（型號：Synergy2）；流式細胞儀，美國BD 公司（型號：FACSCantoⅡ）；實時熒光定量PCR 儀，美國ABI公司（型號：ABI7300）。

1.2 細胞實驗

1.2.1 CCK-8 法檢測細胞增殖 將HCT116 細胞以1×104/100 μL 接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后分別加入不同濃度的ZJW（6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1），以觀察ZJW 單藥對細胞增殖的影響，并確定無毒劑量（即10 mg·L-1）用于后續(xù)實驗。ZJW 10 mg·L-1聯合不同濃度的CET（62.5、125、250、500、1 000 mg·L-1）干預細胞，以觀察ZJW、CET 的聯合作用效果。選擇ZJW 聯合CET 低于IC30的藥物濃度（即ZJW 0、5、10 mg·L-1聯合CET 0、100、200 mg·L-1）干預細胞，以觀察ZJW 與CET 是否存在協同效應。每組設6個復孔。孵育細胞48 h，將CCK-8 試劑與完全培養(yǎng)基按1∶9 的比例配制成工作液，每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h。使用全自動酶標儀檢測450 nm 處各孔的光密度（OD），計算生存率，并繪制效應曲線。重復3次。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期 將處于對數生長期的HCT116 細胞以3×105/孔接種于6 孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入完全培養(yǎng)基（CON 組）、CET 100 mg·L-1（此濃度系依據“1.2.1”項下兩藥協同效應實驗設置；CET 組）、ZJW 10 mg·L-1（ZJW 組）、CET 100 mg·L-1+ ZJW 10 mg·L-1（ZJW+CET 組）。每組設3 個復孔。作用48 h 后收集細胞，胰酶消化（連同培養(yǎng)基中漂浮的細胞一起收集），消化后的細胞懸液1 000 r/min離心2 min；棄去上清，緩沖鹽溶液（PBS）洗滌，離心（條件同前），70%冰乙醇固定，4 ℃過夜。取出固定的標本，800 r/min 離心5 min，棄去上清；加PBS 洗滌細胞，再次離心（條件同前），共洗滌2次；隨后加入碘化丙啶（PI）染液室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀和Mcycle軟件檢測分析細胞周期。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞分組與培養(yǎng)同“1.2.2”。每組設3個復孔。孵育48 h后，將胰酶消化細胞用PBS 洗滌2 次并計數。按照說明書，使用凋亡試劑盒中的1×Binding Buffer 將洗滌后的細胞稀釋為1×106/mL單細胞懸液。將300 μL細胞懸液吸收到新的流動管中，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混合后，室溫下15 min 進行避光反應，加入200 μL 1×Binding Buffer，在1 h 內完成上機檢測。流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC 陽性細胞和PI 陰性細胞的相對數量，計算細胞凋亡率。未染色的細胞、Annexin V-FITC單獨染色的細胞和PI單獨染色的細胞作為對照。單色細胞用于調節(jié)FL1和FL2通道上的電子補償。

1.2.4 Western blot 檢測細胞中NF-κB p56、Bcl-2 表達

細胞分組與培養(yǎng)同“1.2.2”。每組設3 個復孔。藥物作用48 h 后，使用2 mL 預冷PBS 清洗3 次，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min 后，離心收集上清，提取細胞蛋白，BCA 法測定細胞總蛋白濃度。各孔取15 μg的蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離（濃縮膠100 V 電壓，60 min；分離膠120 V 電壓，120 min）。將分離后的蛋白電轉移（200 mA 電流，120 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加入5% BSA 封閉液于搖床上室溫封2 h。用洗滌緩沖鹽溶液（TBST）洗膜3 次，每次10 min，分別加入NF-κB p65、Bcl-2 抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃反應過夜。次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min。后加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗（體積稀釋比例為1∶2 000），室溫反應2 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按ECL 試劑盒說明進行顯影。采用ImageJ 圖像分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.2.5 免疫熒光法檢測細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3 表達 細胞分組與培養(yǎng)同“1.2.2”。每組設3個復孔。藥物作用24 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定15 min；0.1% Triton-X-100（PBS 配制）透化10 min，免疫熒光封閉液室溫封閉30 min，分別加入一抗NF-κB p56（1∶2 000）和Caspase-3（1∶2 000），4 ℃過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）清洗后加入Alexa Fluor 488 山羊抗兔二抗（1∶1 500），室溫孵育2 h；PBST 清洗后加入一抗p-NF-κB p65（1∶2 000），4 ℃過夜；PBST 清洗后加入Cy3山羊抗兔二抗（1∶1 500），室溫孵育2 h；二脒基苯基吲哚（DAPI）染色5 min（10 mg·L-1），PBS 清洗后抗淬滅封片劑封片，共聚焦拍照。ImageJ分析熒光強度。

1.2.6 RT-qPCR 法檢測細胞中相關基因的表達 細胞分組與培養(yǎng)同“1.2.2”。每組設3個復孔。藥物作用48 h后提取細胞，用TRIzol試劑從細胞中提取RNA。根據逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。取適量的cDNA作為反應模板，并根據RT-qPCR 規(guī)范進行擴增。以β-actin為內參進行熒光定量PCR 擴增，以檢測各組HCT116 細胞NF-κBp65、Bcl-2、Caspase-3mRNA 的表達水平。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，50個循環(huán)。擴增引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。各組均設3個復孔，并使用2-??CT方法計算相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 動物實驗

1.3.1 皮下移植瘤生長情況 取16只裸鼠，將2×106個HCT116 細胞皮下注射于裸鼠腋下，當腫瘤的平均大小達到100 mm3左右時將小鼠隨機分成4 組，每組4 只。第1 組小鼠每天使用PBS 灌胃，100 μL/次，1 次/d；第2組、第3 組小鼠尾靜脈注射CET，注射劑量為15 mg·kg-1，每周2 次，共注射4 周；第3 組、第4 組小鼠灌胃給予ZJW，灌胃劑量為2 055 mg·kg-1，1次/d，共28 d［5］。第1 組、第2 組、第3 組、第4 組小鼠分別設為CON 組、CET組、ZJW+CET組、ZJW 組，每2天記錄1次較大的腫瘤直徑（A和B），并根據公式（V=π/6×A×B2）估算腫瘤體積。根據腫瘤體積和時間繪制腫瘤生長圖。

1.3.2 RT-qPCR 法檢測皮下移植瘤組織中相關基因的表達情況 給藥28 d后剝離腫瘤組織，取20 mg皮下移植瘤組織置于研缽中，加入1 mL TRIzol 提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒將總RNA 逆轉錄成cDNA。后續(xù)檢測方法見“1.2.6”項下。以β-actin作為內參分析NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3基因表達情況，并使用2-??CT方法計算相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數據采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ZJW、CET 對HCT116 細胞增殖的影響 為避免ZJW 本身的細胞毒性對細胞增殖的影響，本研究檢測了ZJW 對HCT116 細胞的細胞毒作用。結果顯示，ZJW在HCT116細胞中的IC10劑量為10.71 mg·L-1（圖1A），低于此劑量時，細胞的存活率與未經處理的細胞相比沒有顯著差異。因此，在后續(xù)的細胞實驗中，本研究使用ZJW 10 mg·L-1聯合不同濃度CET 干預HCT116 細胞。CCK-8法檢測結果顯示，與CET單藥相比，ZJW聯合CET干預后，HCT116細胞增殖率明顯降低［IC50=578.6 mg·L-1（CET），IC50=231.3 mg·L-1（ZJW+CET）］，見圖1B。

圖1 ZJW、CET對HCT116細胞增殖的影響

為了進一步驗證ZJW與CET是否存在協同作用，我們采用不同濃度ZJW聯合0、100、200 mg·L-1CET干預HCT116細胞，測得ZJW IC30值分別為17.36、8.47、6.82 mg·L-1，藥物聯合指數（CI）分別為1.000、0.759、0.934。使用不同濃度CET 聯合0、5、10 mg·L-1ZJW 處理HCT116 細胞，測得CET IC30值分別為369.30、237.12、105.16 mg·L-1，CI分別為1.000、0.930、0.861，見圖2、表2。以上結果提示，ZJW與CET存在較好的協同作用。

圖2 CET與ZJW協同效應檢測

表2 ZJW、CET抑制HCT116細胞增殖CI值（IC30）

2.2 ZJW、CET對HCT116細胞周期的影響 與CON組相比，ZJW 組、ZJW+CET組G0/G1期細胞比例降低，S期細胞比例升高（P<0.05）；與CET 組相比，ZJW 組、ZJW+CET 組G1 期細胞比例降低，S 期細胞比例升高（P<0.05）；與ZJW 組相比，ZJW+CET 組S 期細胞比例升高（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞周期比較

與CON 組相比，CET 組、ZJW+CET 組G2/M 期細胞比例降低（P<0.05）；與CET 組相比，ZJW 組G2/M 期細胞比例升高（P<0.05）；與ZJW組相比，ZJW+CET組G2/M期細胞比例降低（P<0.05）。見圖3。

2.3 ZJW、CET對HCT116細胞凋亡的影響 與CON組相比，CET 組細胞晚期凋亡率升高（P<0.05），ZJW 組、ZJW+CET 組細胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）；與CET 組相比，ZJW 組細胞早期凋亡率升高（P<0.05），ZJW+CET 組細胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）；與ZJW 組相比，ZJW+CET 組細胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組細胞凋亡情況比較

2.4 ZJW、CET 對HCT116 細胞中NF-κB p56、Bcl-2 表達的影響 與CON組比較，CET組、ZJW組細胞中Bcl-2表達降低（P<0.05），ZJW+CET 組細胞Bcl-2、NF-κB p65表達降低（P<0.05）；與CET組相比，ZJW+CET 組細胞中Bcl-2、NF-κB p65 表達降低（P<0.05）；與ZJW 組相比，ZJW+CET 組細胞Bcl-2、NF-κB p65 表達降低（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞中NF-κB p65、Bcl-2蛋白表達水平比較（Western blot）

2.5 ZJW、CET 對HCT116 細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3表達的影響 與CON組相比，ZJW組細胞中Caspase-3表達升高（P<0.05），ZJW+CET組細胞中NFκB p65、p-NF-κB p65 表達降低，Caspase-3 表達升高（P<0.05）；與CET組相比，ZJW+CET組細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65 表達降低，Caspase-3 表達升高（P<0.05）；與ZJW 組相比，ZJW+CET 組細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65表達降低，Caspase-3表達升高（P<0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3表達水平比較（免疫熒光）

2.6 ZJW、CET 對HCT116 細胞Bcl-2、NF-κBp65基因表達的影響 與CON 組相比，ZJW 組、ZJW+CET 組細胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表達降低（P<0.05）；與CET組相比，ZJW 組、ZJW+CET 組細胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表達降低（P<0.05）；與ZJW 組相比，ZJW+CET 組細胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表達降低（P<0.05）。見圖7。

圖7 各組細胞Bcl?2、NF?κB p65基因表達水平比較

2.7 ZJW、CET 對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 整體來看，隨著時間的推移，CON 組、CET 組裸鼠瘤體體積逐漸增大，而ZJW 組、ZJW+CET 組裸鼠瘤體生長較為緩慢。給藥28 d 后剝離瘤體，與CON 組相比，ZJW 組、ZJW+CET 組裸鼠皮下移植瘤體積縮?。≒<0.05）；與CET 組相比，ZJW、ZJW+CET 組裸鼠皮下移植瘤體積縮?。≒<0.05）；與ZJW 組比較，ZJW+CET組裸鼠皮下移植瘤體積縮小（P<0.05）。見圖8。

圖8 各組裸鼠皮下移植瘤生長情況比較

2.8 ZJW、CET 對裸鼠皮下移植瘤組織中NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3基因表達的影響 與CON 組相比，ZJW組、ZJW+CET 組瘤體組織中NF-κBp65、Bcl-2mRNA 表達降低，Caspase-3mRNA 表達升高（P<0.05）；與CET 組相比，ZJW組瘤體組織中Caspase-3mRNA表達升高（P<0.05）；與ZJW組相比，ZJW+CET組瘤體組織中Caspase-3mRNA表達升高（P<0.05）。見圖9。

圖9 各組裸鼠皮下移植瘤組織中NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達水平比較

3 討論

ZJW 作為一種經典中藥復方，由黃連、吳茱萸按6∶1 配比組成，黃連苦寒，清心瀉肝，吳茱萸辛熱，引熱下行，二藥一主一輔，一寒一熱，相反相成［6］。全方辛開苦降、寒熱并用，主治肝火犯胃、肝胃不和，癥見口苦脅脹、胃脘痛、嘔吐吞酸，與臨床上腫瘤化療后引起的消化道反應相似［7］。因此，ZJW 可用于緩解腫瘤化療后引起的相關癥狀及耐藥反應［8-10］。

本研究結果顯示，ZJW 聯合CET 可有效抑制HCT116 細胞的增殖；與CET 單藥比較，ZJW 聯合CET可以使HCT116 細胞的S 期表現出明顯阻滯，從而抑制細胞增殖，升高HCT116細胞凋亡的比例。以上結果提示，ZJW 能夠在一定程度上增強HCT116 細胞對CET 的敏感性。動物實驗結果顯示，與CON 組相比，CET+ZJW 組的抑瘤效果明顯增強（P<0.05），給藥28 d 后，CET+ZJW 組裸鼠皮下移植瘤瘤體體積最?。≒<0.05），提示ZJW 可以增強CET 在體內的抗腫瘤作用?？梢姡琙JW 在體內、體外均能增強腫瘤細胞對CET 的敏感性，但其具體機制尚不清楚。

NF-κB 是細胞內重要的核轉錄因子，參與機體的免疫反應、免疫應答，可以調節(jié)細胞凋亡、應激反應［11］。研究［12-14］表明，NF-κB 與多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌發(fā)生的耐藥具有相關性，其機制可能與調節(jié)靶蛋白Bcl-2、Bcl-2相關蛋白A1、凋亡抑制蛋白（IAPs）、白介素-13、腫瘤壞死因子等抑凋亡因子的表達有關，其中Bcl-2 蛋白家族是導致許多半胱氨酸酶活化的關鍵調控因子，參與細胞凋亡過程［15-18］。Ricca 等［19］研究發(fā)現，在乳腺癌耐藥MCF7ADR細胞中過表達Bcl-2可以增強NF-κB的轉錄活性，提示Bcl-2介導的NF-κB因子活性調控可能是MCF7ADR細胞促進耐藥的重要機制。Aslan等［20］的研究表明，NF-κB對Bcl-2的調控在口腔鱗狀細胞癌的進展中起重要作用。同樣，Chen 等［21］的研究發(fā)現，激活NF-κB 后導致Bcl-2 的升高是發(fā)生非小細胞肺癌化療耐藥的重要原因。

課題組前期研究［5］發(fā)現，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/NF-κB通路參與調控人結腸癌細胞多藥耐藥，因此我們推測NF-κB信號通路同樣可以通過調控細胞凋亡途徑參與KRAS突變型大腸癌CET 耐藥過程。本研究中，Western blot 與RT-qPCR 檢測結果均證實了NF-κB、Bcl-2 與大腸癌HCT116 細胞凋亡的相關性，具體表現為CET 干預HCT116 細胞后，細胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2mRNA 表達水平均有所下降，但NF-κB 的變化不明顯；ZJW聯合CET干預HCT116細胞后，細胞中NF-κB、Bcl-2 的蛋白和NF-κB、Bcl-2mRNA 表達水平均降低。上述提示ZJW 對大腸癌HCT116 細胞CET 耐藥的逆轉作用可能與NF-κB、Bcl-2調控的細胞凋亡相關。

綜上，我們通過體外、體內研究初步證實，ZJW 可通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、促進細胞凋亡等途徑逆轉KRAS突變大腸癌細胞對CET 的耐藥，繼而抑制大腸癌生長，其機制可能與調控NF-κB/Bcl-2/Caspase-3通路相關。