劉軍洋，滕紅麗，趙金妹，洪 精

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201）

細葉勾兒茶［Berchemia lineata（L.）DC.］是鐵包金基源藥材之一，又名烏龍根，馬口仔，老鼠耳，是鼠李科勾兒茶屬植物，以其根和帶葉藤莖入藥［1］。鐵包金（壯藥名：Gaeuhouznou 勾吼耨）首載于《嶺南采藥錄》，為壯醫(yī)常用藥材［2，3］。其作為壯醫(yī)臨床常用抗炎藥物，廣泛應(yīng)用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）的復(fù)方中，但報道較少且多為年代久遠的臨床文獻［4］。研究顯示，鐵包金總提取物具有明顯抗炎作用且對小鼠耳廓腫脹有一定療效［5，6］。主要化學(xué)成分有黃酮類、醌類、二聚體、苯丙素類、萜類、苷類以及有機酸類等結(jié)構(gòu)類型［7，8］。雖然臨床及動物實驗均證明鐵包金具有良好抗炎效果，但具體何種鐵包金單體化合物具有抗炎活性未見相關(guān)報道，分子水平上對細葉勾兒茶的認識限制了對該藥材的推廣和使用。課題組從細葉勾兒茶莖葉的正丁醇和乙酸乙酯提取物中共分離及鑒定了23 個化合物，化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型呈現(xiàn)多樣性，包括新型骨架、萘駢α-吡喃酮類、萘駢γ-吡喃酮類、黃酮苷類、聯(lián)芐類、黃酮及二氫黃酮類、蒽醌類、萜類、簡單酚類化合物，涵蓋了新化合物和首次從該植物中分離的化合物。通過對其進行藥物毒性及其抗炎活性篩選，初步篩選出具有抗炎活性的鐵包金單體化合物并對藥量相對充足的21 號酚類化合物的作用機制進行初步探究，以期在分子水平對細葉勾兒茶有進一步認識，為進一步探究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 相關(guān)試劑及儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco）、胎牛血清（FBS；青木）、青霉素鏈霉素（Gibco）、脂多糖（Sigma）、地塞米松（源葉）、CCK-8（ABclonal）、NO 檢測試劑盒（碧云天）、ELISA 試劑盒（四正柏、睿信）、酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司）。

1.2 細胞株

RAW264.7（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.3 鐵包金單體化合物

鐵包金單體化合物來源：由課題組從細葉勾兒茶地上部分提?。?］，共23 個，新化合物（1～8）、已知化合物（9～23）。其中，1 號是新骨架化合物；2、3 號是天然產(chǎn)物中較為罕見的α 型萘駢吡喃酮類化合物，此前只從海洋生物中發(fā)現(xiàn)過，這是首次在植物中發(fā)現(xiàn)該類成分；4 號和5 號為角型的萘駢γ-吡喃酮，8 號為聯(lián)芐類化合物，均為首次從該植物中分得的結(jié)構(gòu)類型；除14、15、19 號外的已知化合物也均是首次從該植物中分離得到的?；衔锩Q、分子式及結(jié)構(gòu)式詳見表1、圖1。

圖1 分類和化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Classification and chemical structure formula

表1 化合物名稱和分子式Tab 1 Compound name and molecular formula

1.4 細胞培養(yǎng)

RAW264.7 使用完全培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS+1%P/S），在溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RAW264.7 細胞每隔24 h 進行傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5 造模

LPS 誘 導(dǎo)RAW264.7 細 胞12 h，建 立 細 胞 炎 癥模型。

1.6 CCK-8 法測定其對RAW264.7 細胞增值活性的影響

將RAW264.7 細胞均勻接種于96T 板，每孔100 μL，待細胞貼壁，棄上清。設(shè)空白對照組和藥物組，空白對照組和藥物組分別加入細胞培養(yǎng)液、50 μmol/L 或75 μmol/L 的 單 體 化 合 物100 μL，孵 育24 h，棄上清液。嚴格按照CCK-8 說明書進行操作，于450 nm 波長測吸光度，計算細胞存活率。

1.7 Griess 法測定RAW264.7 細胞NO 釋放量

RAW264.7 細胞接種于96T 板，每孔100 μL，待細胞貼壁，棄上清。設(shè)定空白對照組（Con）、模型組（LPS）、陽性對照組（DXM）、細葉勾兒茶單體化合物組。給藥：空白對照組：DMEM 培養(yǎng)液；模型組：終濃度為0.5 μg/mL 的LPS；陽性對照組：終濃度為0.5 μg/mL 的LPS 和終濃度為10 μmol/L 的DXM，共孵育；細葉勾兒茶單體化合物組：終濃度為0.5 μg/mL 的LPS 和50 μmol/L 的 細 葉 勾 兒 茶 單 體 化合物，共孵育。96T 板置于37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育12 h，取50 μL 細胞上清液，嚴格按照NO 檢測試劑盒說明書操作，于540 nm 波長測吸光度，計算NO 釋放量和NO 抑制率。

1.8 抗炎活性梯度檢測（化合物2、15、16、18、21）

選取抗炎活性較好且提取量相對多的單體化合物進行抗炎活性梯度檢測。給藥：模型組：0.5 μg/mL 的 LPS；陽性對照組：終濃度為0.5 μg/mL的LPS 和終濃度為10 μmol/L 的DXM 共孵育；細葉勾兒茶單體化合物組為0.5 μg/mL 的LPS 和不同濃度細葉勾兒茶單體化合物共孵育。2、21 號設(shè)置濃度梯度：6.25、12.5、25、50、75 μmol/L；15、16、18設(shè)置濃度梯度：6.25、12.5、25、50 μmol/L。嚴格按照NO 檢測試劑盒說明書操作，于540 nm 波長測吸光度，計算NO 釋放量和NO 抑制率。

1.9 ELISA 法檢測TNF-α、IL-6、NF-κB、COX-2、iNOS 的含量

RAW264.7 細胞接種于6T 板中，待細胞貼壁。設(shè)定空白對照組、模型組、陽性藥物組和細葉勾兒茶單體化合物組。待細胞貼壁，棄上清。給藥：空白 對 照 組：DMEM 培 養(yǎng) 液；模 型 組：0.5 μg/mL 的LPS；陽性對照組：0.5 μg/mL 的LPS 和10 μmol/L的DXM，共孵育；細葉勾兒茶單體化合物組為0.5 μg/mL 的LPS 和25、50、75 μmol/L 的 細 葉 勾 兒 茶單體化合物，共孵育。于37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育12 h。收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒的說明檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad prism 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采 用（±s）表 示，P＜0.05 表 示 差 異 具 有 統(tǒng) 計 學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細葉勾兒茶單體化合物對RAW264.7 細胞的毒性作用

結(jié) 果 顯 示，給 藥24 h（50 μmol/L），19 號 對RAW264.7 細胞產(chǎn)生藥物毒性作用，細胞存活率為59.25%，其他化合物對RAW264.7 細胞均無明顯毒性，細胞存活率大于80%。75 μmol/L 的2、21 號化合物細胞存活率為117%和108%?；衔餄舛葹?0 μmol/L 時，RAW264.7 細胞存活率，見表2。

表2 細胞存活率（n=3，±s）Tab 2 Cell survival rate（n=3，±s）

表2 細胞存活率（n=3，±s）Tab 2 Cell survival rate（n=3，±s）

注：NT: not test。

Cell viability(%)106.32±3.63 83.13±0.95 59.25±4.04 100.79±0.85 107.64±1.49 NT 99.51±2.41--No 12345678 Cell viability(%)99.07±1.08 92.73±5.35 98.67±2.96 103.49±2.31 99.08±2.27 112.40±4.19 113.08±3.63 105.49±2.60 No 9 10 11 12 13 14 15 16 Cell viability(%)90.48±5.97 92.29±1.42 90.24±2.76 100.10±5.50 105.04±1.33 98.71±0.99 88.07±3.72 102.13±0.27 No 17 18 19 20 21 22 23 24

2.2 細葉勾兒茶單體化合物對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細 胞 釋 放NO 的 影 響

結(jié)果顯示，給藥12 h，分離提取到的細葉勾兒茶單體化合物可不同程度的抑制NO 釋放。9 號聯(lián)芐類化合物以及15 號黃酮類化合物、19 號蒽醌類化合物NO 抑制率均達到90%以上，具有較強的抗炎活性。該濃度下的19 號化合物可以降低細胞存活率，影響NO 的檢測結(jié)果。1 號新型骨架化合物，6、7 號黃酮苷類，8 號聯(lián)芐類，16、17 號二氫黃酮類，18 號蒽醌類、21 號簡單的酚類化合物的NO 抑制率范圍在54.65%～80.57% 之間。其中1 號新骨架化合物，NO 抑制率為70.81%，不但有較好抗炎效果且無明顯藥物毒性，具有進一步探究的價值。NO 抑制率結(jié)果，見表3。

表3 一氧化氮抑制率（n=3，±s）Tab 3 Nitric oxide inhibition ratio （n=3，±s）

表3 一氧化氮抑制率（n=3，±s）Tab 3 Nitric oxide inhibition ratio （n=3，±s）

注：NT: not test。

NO inhibition ratio (%)No NO inhibition ratio (%)No NO inhibition ratio（%）No 80.57±3.87 57.61±3.23 101.73±2.25 20.48±1.21 58.81±7.64 NT 18.09±3.50-1 2 3 4 5 6 7 8 70.81±0.79 41.82±2.98 15.15±1.49 27.81±3.10 38.32±6.04 54.65±6.42 56.87±2.49 63.12±0.19 9 10 11 12 13 14 15 16 90.02±0.48 5.41±1.38 0.90±1.11 NT NT NT 99.07±1.82 71.22±1.78 17 18 19 20 21 22 23 24

2.3 抗炎活性梯度檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，細葉勾兒茶單體化合物可以不同程度抑制NO 釋放且呈劑量依賴性。02 號萘駢-α 吡喃酮類、15、16 號黃酮及二氫黃酮類、18 號蒽醌類、21號簡單的酚類化合物皆劑量依賴性抑制NO 釋放。其 中，21 號 化 合 物，濃 度 為6.25、12.5、25、50、75 μmol/L 時，NO 抑 制 率 分 別 為22.15%、28.61%、30.57%、52.45%、61.22%，可劑量依賴性抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 釋放NO，見表4。

表4 化合物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響 （n=3，±s）Tab 4 Effects of compound on production of NO in RAW264.7 cells induced by LPS（n=3，±s）

表4 化合物對LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞NO 釋放量的影響 （n=3，±s）Tab 4 Effects of compound on production of NO in RAW264.7 cells induced by LPS（n=3，±s）

注：NT: not test; ##P＜0.01 表示與空白對照組相比; **P＜0.01 表示和模型組相比。

組別Con LPS DXM 6.25 12.5 25 50 75 FP 21 2.51±0.12 19.01±0.48##3.99±0.58**15.36±0.83**14.29±0.71**13.97±0.81**10.36±0.09**8.91±0.26**310.7＜0.000 1 02 2.19±0.06 17.45±1.12##3.52±0.23**16.79±0.11 16.10±0.50 14.74±0.21**12.56±0.60**10.66±0.56**372.0＜0.000 1 15 2.48±0.36 16.52±1.14##5.10±0.51**14.55±0.93 12.76±1.06**12.20±0.80**5.71±0.36**NT 137.8＜0.000 1 16 0.84±0.03 22.19±0.60##5.32±0.23**20.95±0.92 17.61±1.00**14.05±0.71**7.94±0.51**NT 465.1＜0.000 1 18 1.86±0.27 27.69±0.32##15.75±0.22**26.46±0.18**22.53±0.28**17.36±0.15**9.93±0.27**NT 4230.0＜0.000 1

2.4 ELISA 法檢測化合物21 對RAW264.7 分泌IL-6、TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2 的影響

ELISA 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞上清液中IL-6、TNF-α、NF-κB、COX-2、iNOS水平顯著增高；與模型組相比21 號化合物劑量依賴性抑制IL-6、TNF-α、NF-κB、COX-2、iNOS 分泌，見表5。

表5 化合物21 對RAW264.7 細胞IL-6、TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2 分泌的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of compound 21 of IL-6，TNF-α，NF-κB，iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells（n=3，±s）

表5 化合物21 對RAW264.7 細胞IL-6、TNF-α、NF-κB、iNOS、COX-2 分泌的影響（n=3，±s）Tab 5 Effects of compound 21 of IL-6，TNF-α，NF-κB，iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells（n=3，±s）

注：##P＜0.01 表示與空白對照組相比，**P＜0.01 表示和模型組相比。

組別COX-2（ng/mL）TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)NF-κB(pg/mL)iNOS(ng/mL)Con LPS DXM 25 50 75 FP 4.10±0.04 18.90±0.11##8.89±0.14**11.55±0.92**9.28±0.20**8.25±0.45**390.4＜0.000 1 79.80±3.20 40 388±1 443##5 283±133.60**37 744±488.00**17 502±229.80**5 323±54.47**2 308.0＜0.000 1 6.84±0.07 109.14±1.04##18.28±0.20**102.43±0.55**35.86±0.38**9.53±0.16**24 451.0＜0.000 1 36.96±3.65 170.80±4.04##41.24±2.63**121.40±5.84**91.58±7.86**85.33±4.60**298.3＜0.000 1 0.15±0.01 6.28±0.36##2.51±0.06**3.70±0.13**3.58±0.16**1.70±0.10**431.5＜0.000 1

3 討論

基于鐵包金臨床上主要用于抗RA 的治療，NF-κB 信號通路與RA 的發(fā)生緊密相關(guān)以及課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鐵包金（細葉勾兒茶和光枝勾兒茶）總提取物可在RAW264.7 細胞內(nèi)劑量依賴性地下調(diào)細胞內(nèi)基本水平的NF-κB 活性，并能夠阻斷炎癥因子TNF-α 或LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 活性的增加的事實，該實驗對細葉勾兒茶單體化合物進行抗炎活性篩選并基于NF-κB 信號通路探究其作用機制。又因動物實驗需要的化合物的量大，從傳統(tǒng)藥物中分離提取的單體化合物往往不夠的事實，因此，選擇LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細胞建立經(jīng)典體外炎癥模型，在細胞水平篩選鐵包金中可能具有抗炎活性的單體化合物，這樣，使用少量的化合物就能為后續(xù)研究指明正確的方向。

NO 作為重要的繼發(fā)性炎癥介質(zhì)，NO 的形成與iNOS 密切相關(guān)［10，11］，是炎癥反應(yīng)重要指標［12］。NFκB 信號通路為調(diào)控多種炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路［13］。NF-κB 二聚體活化后，加劇IL-6、TNF-α 等炎癥因子分泌的同時可促進NF-κB 表達，構(gòu)成正反饋機制，形成惡性循環(huán)［14］。TNF-α 引起炎癥反應(yīng)的同時可促進巨噬細胞生成大量NO 加劇IL-6 的分泌進而促進炎癥反應(yīng)［15-18］。另外，NF-κB 信號通路受到炎癥因子被激活并磷酸化后，進一步誘導(dǎo)核內(nèi)iNOS與COX-2 分泌。iNOS 和COX-2 在炎癥反應(yīng)的過程中，對炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用，過度表達可加劇炎癥反應(yīng)［19-22］。COX-2 通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)NO和iNOS 的合成與釋放，加重炎癥反應(yīng)［23-25］。

實驗結(jié)果顯示，給藥24 h（50 μmol/L），細葉勾兒茶單體化合物（除19 號）對RAW264.7 細胞均無明顯藥物毒性，對細胞存活率無明顯影響。Griess法抗炎活性篩選結(jié)果顯示，50 μmol/L 的細葉勾兒茶單體化合物作用12 h 可以不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞釋放NO，說明其具有一定的抗炎活性。其中，9 號聯(lián)芐類、15 號黃酮類及19號蒽醌類化合物都有較強的抗炎活性，說明這些化合物可能是細葉勾兒茶臨床抗炎治療的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，50 μmol/L 的19 號單體化合物對細胞存活率有一定影響，干擾抗炎活性檢測結(jié)果。9、15號不但有良好抗炎效果且藥物毒性小，為進一步抗炎研究提供新思路?？寡谆钚蕴荻葯z測結(jié)果顯示，細葉勾兒茶單體化合物（2、15、16、18、21 號）抗炎活性具有劑量依賴性。另外，21 號簡單酚類單體化合物可降低RAW264.7 細胞NF-κB、COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6 的分泌。

綜上，實驗結(jié)果提示細葉勾兒茶中聯(lián)芐類（09）、黃酮類成分（15）單體化合物抗炎活性尤佳，可能是其發(fā)揮抗炎活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。1 號作為新骨架化合物有必要進行進一步探究。21 號簡單酚類化合物可降低LPS 誘導(dǎo)的炎癥模型的炎癥因子水平，其作用機制可能與抑制NF-κB 通路異常激活有關(guān)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。