李奇辰，李民贊，楊 瑋，孫 紅，張 瑤

?專論與綜述?

拉曼光譜在精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

李奇辰1,2，李民贊1,2※，楊 瑋1,3，孫 紅1,3，張 瑤1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)智慧農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，煙臺(tái) 264003； 3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)信息獲取技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

拉曼光譜分析技術(shù)利用分子運(yùn)動(dòng)對(duì)入射光產(chǎn)生非彈性散射的原理對(duì)分子成分進(jìn)行檢測(cè)，具有受水分干擾小、樣本預(yù)處理小、與紅外光譜信息互補(bǔ)等特點(diǎn)，在土壤成分快速分析方面展現(xiàn)了很大的優(yōu)勢(shì)。但是拉曼光譜信號(hào)弱，受熒光干擾強(qiáng)，為土壤拉曼信號(hào)的有效獲取帶來(lái)困難。為了分析拉曼光譜在土壤成分檢測(cè)中的應(yīng)用潛力，該研究綜述了移頻激發(fā)差分拉曼光譜技術(shù)、共焦顯微拉曼技術(shù)以及表面增強(qiáng)技術(shù)等基于拉曼光譜的土壤成分檢測(cè)技術(shù)，分析了土壤成分拉曼光譜檢測(cè)的研究進(jìn)展，并提出進(jìn)一步研究建議。結(jié)果表明：1）脂肪族化合物以及芳香族化合物都具有拉曼活性，為基于拉曼光譜的土壤有機(jī)質(zhì)含量的定性、定量分析提供了理論依據(jù)。為了彌補(bǔ)拉曼光譜對(duì)有機(jī)質(zhì)整體定量預(yù)測(cè)精度的不足，采用紅外-拉曼光譜融合方式補(bǔ)償單獨(dú)拉曼光譜數(shù)據(jù)中缺失的土壤有機(jī)質(zhì)信息，可顯著改善預(yù)測(cè)精度。2）利用表面增強(qiáng)技術(shù)可以增強(qiáng)土壤溶液中可溶性氮與土壤有效氮拉曼特征波峰的強(qiáng)度，獲得了良好的定量預(yù)測(cè)效果，回歸模型決定系數(shù)2達(dá)到0.91～0.99。 3）土壤中很多含磷的化合物都具有拉曼活性，拉曼光譜是識(shí)別土壤中不同磷酸鹽形態(tài)的極其有效的工具，在土壤磷素含量的分析中，應(yīng)用小波包分解的拉曼光譜對(duì)濾除有機(jī)質(zhì)的磷酸鹽參雜土壤中磷素濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)，回歸模型精度2達(dá)到0.94。拉曼光譜檢測(cè)的樣本范圍取決于激發(fā)光照射在樣本上的光點(diǎn)尺寸，而土壤樣本的空間變異性為聚焦目標(biāo)物質(zhì)帶來(lái)困難。因此，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高分辨率檢測(cè)的關(guān)鍵是獲取有效拉曼信號(hào)、同時(shí)降低背景信號(hào)的干擾。移頻激發(fā)技術(shù)與顯微拉曼技術(shù)為農(nóng)田土壤養(yǎng)分的原位測(cè)量提供了技術(shù)保障。建議：1）采用光譜融合方法提升回歸模型的預(yù)測(cè)精度。2）降低冗余變量，提升模型的可解讀性與重現(xiàn)性。3）充分考慮土壤對(duì)拉曼光譜的影響，為開發(fā)農(nóng)田現(xiàn)場(chǎng)土壤成分快速檢測(cè)技術(shù)提供參考。

土壤；拉曼光譜；紅外光譜；移頻激發(fā)；共焦顯微拉曼；表面增強(qiáng)拉曼光譜；精細(xì)農(nóng)業(yè)

0 引 言

精細(xì)農(nóng)業(yè)是利用現(xiàn)代信息技術(shù)實(shí)現(xiàn)農(nóng)田變量管理（施肥、噴藥、灌溉等）在提高產(chǎn)量的同時(shí)減少農(nóng)業(yè)資源投入并降低環(huán)境污染的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系[1]。繪制田間土壤成分空間分布圖是實(shí)現(xiàn)精細(xì)農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)之一，根據(jù)土壤成分的空間變異可實(shí)施變量施肥[2]。在2016年10月發(fā)布、2017年4月實(shí)施的中國(guó)《測(cè)土配方施肥技術(shù)規(guī)程》中，制定了包含土壤水分、質(zhì)地、容重、有機(jī)質(zhì)、氮素、有效磷、鉀素、以及微量元素等土壤成分的分析方法及操作規(guī)程[3]。根據(jù)操作規(guī)程，土壤分析需要在農(nóng)田采集土壤樣本，將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行化學(xué)分析。分析方法耗時(shí)費(fèi)力，通常無(wú)法滿足田間精細(xì)管理的需求[2]。

基于光譜學(xué)原理的傳感技術(shù)為農(nóng)田土壤信息快速獲取提供了可靠的手段和方法[2,4-5]。采用的光譜技術(shù)包括可見(jiàn)光-近紅外光譜技術(shù)、熒光光譜技術(shù)[6-7]、拉曼光譜技術(shù)、激光誘導(dǎo)擊穿光譜技術(shù)（laser-induced breakdown spectroscopy，LIBS）[8-10]、太赫茲技術(shù)（terahertz，THz）[11]等，這些技術(shù)具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、成本效益高等優(yōu)點(diǎn)，在土壤營(yíng)養(yǎng)成分的無(wú)損檢測(cè)中具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。可見(jiàn)光-近紅外光譜分析技術(shù)利用有機(jī)分子中的含氫基團(tuán)（如：C-H，O-H，N-H，S-H）振動(dòng)的合頻及倍頻吸收的信息，可以同時(shí)獲得多種土壤化合物含量的信息，在精細(xì)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究開發(fā)與實(shí)踐中得到了廣泛推廣[12-16]。然而土壤磷素、有效氮素等作物有效養(yǎng)分在近紅外波段沒(méi)有敏感波峰，因此需要通過(guò)與敏感成分的相關(guān)性進(jìn)行間接預(yù)測(cè)，結(jié)果往往缺乏可重復(fù)性。有必要尋求其他光譜檢測(cè)技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)在作物有效養(yǎng)分檢測(cè)上的不足。

拉曼光譜技術(shù)對(duì)分子產(chǎn)生的散射信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，是一種快速、簡(jiǎn)單、無(wú)損的分子分析技術(shù)。只要涉及分子組成和分子微環(huán)境變化的現(xiàn)象都可以用拉曼光譜來(lái)研究。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，拉曼光譜技術(shù)廣泛應(yīng)用在植物檢測(cè)、土壤檢測(cè)、水質(zhì)檢測(cè)、以及食品檢測(cè)中[17]。在土壤檢測(cè)方面，拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)用于分析土壤微塑料[18]、病原微生物[19]、農(nóng)藥殘留[17]、重金屬[20]、腐殖酸[21]、土壤養(yǎng)分等[22]。PARIKH等[23]發(fā)表了分子振動(dòng)光譜技術(shù)在土壤有機(jī)、無(wú)機(jī)成分特性檢測(cè)方面的綜述論文。ARMENTA等[24]綜述了分子振動(dòng)光譜技術(shù)在土壤和沉積物分析中的應(yīng)用。GREDILIA等[25]綜述了多種光譜技術(shù)在環(huán)境樣本檢測(cè)中的應(yīng)用。SHARMA等[26]從農(nóng)業(yè)、法醫(yī)學(xué)方面綜述了多種光譜技術(shù)在土壤有機(jī)質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用。然而，在精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分特性快速檢測(cè)中還沒(méi)有關(guān)于拉曼光譜的綜述論文，缺少拉曼光譜技術(shù)在該領(lǐng)域應(yīng)用的整理與分析。

近些年，隨著光電、嵌入式軟硬件、拉曼光譜分析技術(shù)的成熟，拉曼光譜技術(shù)發(fā)展出了不同檢測(cè)形式[17]。體積小、質(zhì)量輕、移動(dòng)方便的手持式、便攜式拉曼光譜儀迅速得到了發(fā)展，在精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分特性快速分析中嶄露頭角[27-30]。為了分析拉曼光譜在土壤成分檢測(cè)中的應(yīng)用潛力，圍繞精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分特性快速檢測(cè)方面的應(yīng)用，綜述拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的最新進(jìn)展，總結(jié)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)在農(nóng)田土壤養(yǎng)分檢測(cè)中的研究現(xiàn)狀與存在問(wèn)題，分析發(fā)展趨勢(shì)，以期為精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分快速檢測(cè)提供參考。

1 拉曼光譜技術(shù)概述

拉曼光譜和紅外光譜都是由于分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的光譜，不同的是拉曼光譜對(duì)分子的散射信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。散射信號(hào)中與入射光頻率相同部分的為瑞利散射，頻率不同的為拉曼散射。散射光與入射光的頻率之差為拉曼頻移。拉曼頻移與入射光頻率無(wú)關(guān)，只與散射分子本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，利用這一特性可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析。同時(shí)，在特定條件下，拉曼光譜強(qiáng)度與樣本濃度成正比，這是拉曼光譜進(jìn)行定量分析的依據(jù)。

拉曼散射光的產(chǎn)生機(jī)理通常用能級(jí)概念來(lái)描述，如圖1所示。

注：v表示分子振動(dòng)頻率，v=0與v=1代表原子間振動(dòng)（或轉(zhuǎn)動(dòng)）的基態(tài)與激發(fā)態(tài)，E0與E1代表對(duì)應(yīng)能級(jí)的能量（J），v0是入射光頻率，v1是振動(dòng)能級(jí)間的頻率差，h為普朗克常數(shù)，hv0是入射光對(duì)應(yīng)的能量。

當(dāng)一束光照射到分子時(shí)，分子吸收了光能從初始振動(dòng)能級(jí)躍遷到較高的能級(jí)。這時(shí)吸收的能量等于分子振動(dòng)能級(jí)間的能量差，從而產(chǎn)生了衰減的紅外吸收光譜。根據(jù)吸收光譜的頻率、強(qiáng)度對(duì)分子進(jìn)行定性、定量分析的方法是紅外光譜分析法。當(dāng)分子吸收入射光能量從低能級(jí)躍遷到中間層（虛能級(jí)），之后又衰減到低能級(jí)，衰減過(guò)程中釋放的光稱為散射光，通過(guò)檢測(cè)散射光獲得的光譜稱為散射光譜。瑞利散射是指散射光與入射光的頻率保持一致，即入射光與分子沒(méi)有發(fā)生能量交換。拉曼散射指分子從虛能級(jí)衰減到了與初始能級(jí)不同的能級(jí)上，釋放的散射光頻率與入射光頻率不一致。拉曼散射中比入射光頻率小的散射光(0?1)稱為斯托克斯線，比入射光頻率大的散射光(0+1)稱為反斯托克斯線。只要是拉曼散射就會(huì)有斯托克斯線和反斯托克斯線同時(shí)對(duì)稱出現(xiàn)。反斯托克斯線強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小與斯托克斯線強(qiáng)度，因此在拉曼的譜學(xué)分析中通常只考慮斯托克斯線。

為了突出拉曼光譜的檢測(cè)特點(diǎn)，表1比較了拉曼光譜與紅外光譜的基本特性。拉曼光譜與紅外光譜同為分子振動(dòng)光譜，表征了分子不同的振動(dòng)/轉(zhuǎn)動(dòng)模式。通常極性分子具有紅外活性、非極性分子具有拉曼活性。紅外光譜無(wú)法檢測(cè)的對(duì)象可能屬于拉曼光譜檢測(cè)范圍，反之亦然。拉曼光譜不受水分子干擾，適用于含水樣本的測(cè)量。但是拉曼信號(hào)微弱，受到熒光干擾強(qiáng)，抑制了拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

相比紅外光譜，拉曼光譜的譜峰更尖銳，對(duì)目標(biāo)分子選擇性更好。紅外光譜的譜學(xué)解析方法通常采用濾波、基線校正等方法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后使用數(shù)據(jù)降維、化學(xué)計(jì)量學(xué)、多變量解析等方法建立預(yù)測(cè)模型；拉曼光譜通常采用波峰擬合方法對(duì)原始光譜進(jìn)行變換，然后對(duì)重建后的波峰進(jìn)行分析解讀[32]。相比于紅外光譜技術(shù)，拉曼光譜研究更側(cè)重于信號(hào)增強(qiáng)、熒光抑制等檢測(cè)技術(shù)與檢測(cè)設(shè)備的研究，因此拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)發(fā)展極大程度取決于檢測(cè)技術(shù)與檢測(cè)設(shè)備的進(jìn)步。

2 基于拉曼光譜的土壤成分檢測(cè)技術(shù)

由于拉曼信號(hào)微弱，容易被熒光掩蓋，拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展主要著眼于熒光抑制技術(shù)的研制。在土壤檢測(cè)領(lǐng)域，主要采用的熒光抑制技術(shù)包括紫外光激發(fā)拉曼光譜技術(shù)、移頻激發(fā)差分拉曼光譜技術(shù)、共焦顯微拉曼光譜技術(shù)與表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)。紫外光激發(fā)拉曼光譜技術(shù)采用紫外光作為激發(fā)光源，可以抑制熒光影響，但是容易對(duì)土壤樣本造成損傷[33]。所以，本研究結(jié)合具體案例，重點(diǎn)針對(duì)移頻激發(fā)差分拉曼光譜技術(shù)、共焦顯微拉曼光譜技術(shù)以及表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)進(jìn)行精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分特性快速檢測(cè)綜述。

2.1 移頻激發(fā)差分拉曼光譜技術(shù)

移頻激發(fā)差分拉曼光譜技術(shù)（shifted excitation Raman difference spectroscopy，SERDS）是有效消除熒光等背景噪聲的方法之一[34]。SERDS法采用波長(zhǎng)相近的2組激光器來(lái)激發(fā)目標(biāo)，得到2組光譜，再將2組光譜進(jìn)行差分處理。因?yàn)闊晒夤庾V不隨激發(fā)波長(zhǎng)的微小改變而改變，而拉曼峰的位置會(huì)緊隨激發(fā)波長(zhǎng)的變化而變化，所以差分處理后可以消除光譜中熒光部分，但保留了拉曼信號(hào)，再應(yīng)用數(shù)學(xué)方法就可以重建拉曼光譜。這種方法可以有效地抑制熒光等背景噪聲，在室外檢測(cè)中尤其受到關(guān)注[35-36]。

德國(guó)費(fèi)迪南德布勞恩研究所的SOWOIDNICH等[37]嘗試應(yīng)用SERDS法對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)。為了獲取高分辨率拉曼光譜數(shù)據(jù)，提高拉曼光譜的信噪比，對(duì)采自德國(guó)東北部農(nóng)田表層土壤（0～30 cm）的33個(gè)土壤樣本進(jìn)行風(fēng)干、過(guò)篩處理后，置于機(jī)動(dòng)化樣品臺(tái)上。采用柵格掃描方式，在土壤樣本表面1 cm2范圍內(nèi)掃描100個(gè)位點(diǎn)，然后取均值作為樣本代表。這種檢測(cè)方法目的是盡可能覆蓋多的檢測(cè)點(diǎn)，避免土壤成分的空間變異性帶來(lái)的無(wú)效檢測(cè)。

圖2為雙波長(zhǎng)激發(fā)光下檢測(cè)到的拉曼光譜與SERDS處理后重建的拉曼光譜。圖上方的曲線為由雙波長(zhǎng)激光器激發(fā)出的2條拉曼散射光譜。圖底的曲線為SERDS處理重建后的拉曼光譜。熒光可以造成基線漂移、覆蓋拉曼波峰，重建后的拉曼光譜可以消除熒光影響，展現(xiàn)土壤中無(wú)機(jī)/有機(jī)碳的拉曼特征峰。采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression, PLSR）算法建立了SERDS數(shù)據(jù)與土壤有機(jī)質(zhì)含量的關(guān)系，模型精度2=0.82、相對(duì)分析誤差（residual prediction deviation, RPD）為1.81。

圖2 雙波長(zhǎng)激發(fā)拉曼光譜與移頻激發(fā)法重建后的拉曼光譜[37]

2.2 共焦顯微拉曼光譜技術(shù)

拉曼檢測(cè)儀的聚焦尺寸通常為0.2～2 mm，微小的樣本表面變異會(huì)引起拉曼信號(hào)的變動(dòng)，這樣的變動(dòng)往往會(huì)影響對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。比如在農(nóng)田土壤樣本的檢測(cè)中，較大的照射光斑會(huì)使更多土壤成分的信號(hào)同時(shí)存在于一個(gè)光譜數(shù)據(jù)里。因此，目標(biāo)物質(zhì)以外的養(yǎng)分以及誘導(dǎo)熒光的成分的光譜可能會(huì)掩蓋目標(biāo)的拉曼信號(hào)。共焦顯微拉曼技術(shù)將拉曼光譜儀與顯微物鏡結(jié)合，可將激光束聚焦至20 μm以下，濾除共焦區(qū)域以外的干擾成分，提高對(duì)待測(cè)目標(biāo)的選擇性[28]。

德國(guó)費(fèi)迪南德布勞恩研究所的NKEBIWE等[38]應(yīng)用共焦顯微拉曼光譜技術(shù)識(shí)別了混合于土壤中的磷酸二氫鈣（Ca(H2PO4)2?H2O），磷酸氫鈣（CaHPO4）以及-磷酸三鈣（-Ca3(PO4)2）。使用了人工土、自然土、以及農(nóng)田土3種土壤作為基底。結(jié)果表明，拉曼光譜技術(shù)可以明確檢測(cè)并鑒別土壤中的3種磷酸鈣。即使在富含有機(jī)質(zhì)的農(nóng)田土壤中，也沒(méi)有影響拉曼光譜的檢測(cè)結(jié)果。除了添加的3種磷酸鈣以外，還檢測(cè)到了土壤中的天然成分-羥基磷酸鈣（Ca5(PO4)3(OH)），并通過(guò)拉曼峰、半峰全寬等光譜信息，成功區(qū)分波數(shù)差僅為3 cm-1的羥基磷酸鈣（Ca5(PO4)3(OH)）與-磷酸三鈣。該研究結(jié)果歸因于共焦顯微拉曼光譜技術(shù)可以對(duì)樣本進(jìn)行三維高分辨率微米級(jí)分析，因此可以聚焦每個(gè)顯微圖像中的磷酸鈣微粒，而大部分屏蔽掉來(lái)自土壤基質(zhì)的其他成分信息的信號(hào)。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜

由于拉曼散射強(qiáng)度取決于檢測(cè)系統(tǒng)及物質(zhì)的固有特性，現(xiàn)實(shí)中增強(qiáng)拉曼信號(hào)的措施往往難有好的效果。表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）的發(fā)現(xiàn)是拉曼光譜學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破[39]。它解決了拉曼散射信號(hào)弱、檢測(cè)靈敏度低的問(wèn)題,在物質(zhì)定量分析中具有很大的潛力[40]。SERS法的增強(qiáng)原理一般認(rèn)為是激發(fā)光照射在粗糙金屬表面時(shí)產(chǎn)生的等離子體與電磁波的耦合作用。通常將應(yīng)用金、銀等金屬納米級(jí)顆粒制成的粗糙金屬表面作為基底，然后將待測(cè)物吸附于基底表面進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)光照射在待測(cè)物表面時(shí)產(chǎn)生了離子體內(nèi)電子的極化作用，進(jìn)而產(chǎn)生接觸界面局部的增強(qiáng)電場(chǎng)以及極化率，從而增強(qiáng)了拉曼散射信號(hào)的強(qiáng)度。SERS的靈敏度比普通拉曼散射高103～106倍。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)接近電子躍遷能級(jí)的吸收帶時(shí)，共振效應(yīng)使散射光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)103倍[41]。

浙江大學(xué)的DONG等[42]應(yīng)用SERS技術(shù)對(duì)土壤水溶性氮的定量分析能力進(jìn)行了測(cè)試。將120個(gè)土壤樣本與尿素混合，配置了15種不同濃度的可溶性氮的樣本。經(jīng)烘干處理后加入蒸餾水?dāng)嚢韬筮^(guò)濾，提取土壤上清液作為待測(cè)物，然后應(yīng)用SERS法收集表面增強(qiáng)拉曼光譜。經(jīng)過(guò)表面增強(qiáng)處理的SERS光譜在994、1 028、1 370、1 436、1 554和1 636 cm-1出現(xiàn)了特征波峰，其強(qiáng)度與可溶性氮濃度呈線性關(guān)系。采用PLSR建立可溶性氮與表面增強(qiáng)拉曼光譜強(qiáng)度的關(guān)系，預(yù)測(cè)模型2為0.91。同時(shí)，應(yīng)用主成分分析法（principle component analysis, PCA）及最小二乘支持向量機(jī)（least square support vector machine, LSSVM）算法對(duì)低濃度（22.7～63.7 mg/L）與高濃度(70.5～118.3 mg/L)的可溶性氮進(jìn)行分類，分類精度為86.67%。

隨后，該團(tuán)隊(duì)使用表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試了土壤有效氮（銨態(tài)氮與硝態(tài)氮）的定量分析精度。使用3種土壤的溶液樣本作為研究對(duì)象，測(cè)試了金、銀2種金屬納米顆粒對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效果。使用多元線性回歸（multiple linear regression, MLR）、PLSR與機(jī)器學(xué)習(xí)算法測(cè)試了對(duì)土壤有效氮的檢測(cè)精度，取得較高的預(yù)測(cè)精度（2=0.94～0.99）[30]。以上研究表明了表面增強(qiáng)信號(hào)可以用作土壤可溶性氮、土壤有效氮的定量分析。

另一方面，研究表明普通拉曼光譜未能檢測(cè)到明顯的拉曼特征峰，通過(guò)SERS方法增強(qiáng)了拉曼信號(hào)，使被覆蓋的拉曼波峰顯示出來(lái)，并且波峰強(qiáng)度與可溶性氮含量呈線性關(guān)系，以此作為定量分析的依據(jù)。然而，SERS穩(wěn)定性較差，如何確保增強(qiáng)信號(hào)的穩(wěn)定性與定量分析結(jié)果的可重復(fù)性是SERS技術(shù)的一個(gè)難題。

2.4 拉曼光譜與紅外光譜融合技術(shù)

光譜融合技術(shù)通過(guò)對(duì)2個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)光譜進(jìn)行一系列分析、合成和特征疊加，可以獲得更完整和準(zhǔn)確的分析物特征信息。光譜融合技術(shù)在食品工業(yè)、代謝組學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[43-45]。拉曼光譜與紅外光譜具有信息互補(bǔ)的特點(diǎn)，采用光譜融合技術(shù)可以提高對(duì)物質(zhì)分析的精度，在土壤檢測(cè)方面也得到廣泛關(guān)注[46]。

中國(guó)科學(xué)院南京土壤所的XING等[47]應(yīng)用拉曼光譜對(duì)中國(guó)典型的4種土壤（黑土、紅土、水稻土、潮土）進(jìn)行了定性、定量分析。使用便攜式的拉曼光譜儀（i-Raman? Plus）采集土壤拉曼光譜數(shù)據(jù)，激發(fā)光波長(zhǎng)選用785 nm。將200個(gè)土壤樣本（含以上4種土壤）風(fēng)干、過(guò)篩處理，放入透明自封袋，然后采集了拉曼光譜數(shù)據(jù)。應(yīng)用快速傅里葉變換（fast Fourier transform, FFT）、線性基線排除、微分等方式對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑去噪、降維、以及基線校正。

該研究顯示光譜的強(qiáng)度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)線性關(guān)系，主要是由于光譜受到較強(qiáng)的熒光干擾，導(dǎo)致了光譜基線漂移。該結(jié)果與未經(jīng)處理的拉曼散射光譜相似，很難辨識(shí)拉曼光譜的特征波峰。盡管如此，土壤中的熒光沒(méi)有完全覆蓋拉曼波峰，并且不同土壤的熒光影響程度不同，其中潮土受到的熒光干擾程度最小。根據(jù)檢測(cè)到拉曼波峰的特性，對(duì)不同土壤進(jìn)行分類的精度為96%。同時(shí)，采用PLSR方法建立土壤有機(jī)質(zhì)含量的預(yù)測(cè)模型精度2=0.74，RPD=1.92。

為了彌補(bǔ)拉曼光譜對(duì)有機(jī)質(zhì)整體定量預(yù)測(cè)精度的不足，該團(tuán)隊(duì)嘗試了紅外-拉曼光譜融合的方式，補(bǔ)償單獨(dú)拉曼光譜數(shù)據(jù)中缺失的土壤有機(jī)質(zhì)信息。應(yīng)用傅里葉變換紅外光聲光譜（Fourier transform infrared and photo-acoustic spectroscopy, FTIR-PAS）與拉曼光譜對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在應(yīng)用PLSR法建立土壤有機(jī)質(zhì)的定量分析模型中，比起單獨(dú)使用FTIR-PAS與拉曼光譜建立的模型（2>0.7，RPD>1.8），融合2種光譜后土壤有機(jī)質(zhì)預(yù)測(cè)模型的精度得到了顯著的提高（2=0.81，RPD=2.18）[48]。

隨后，該團(tuán)隊(duì)還使用融合算法融合中紅外衰減全反射光譜（mid-infrared attenuated total reflection, FTIR-ATR）與拉曼光譜對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用了競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)加權(quán)采樣法（competitive adaptive reweighted sampling, CARS）對(duì)PLSR模型中的自變量（光譜數(shù)據(jù)）進(jìn)行篩選，去除冗余變量，應(yīng)用篩選后的子變量集進(jìn)行重新建模。結(jié)果表明，應(yīng)用這種變量選擇算法可以顯著提升融合模型的精度，相比基于單獨(dú)光譜數(shù)據(jù)建立的模型預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of prediction, RMSEP）誤差降低了43%。這些研究結(jié)果揭示了紅外光譜與拉曼光譜的互補(bǔ)特性，表明了融合這2種光譜數(shù)據(jù)可提高預(yù)測(cè)模型的精度[49]。

3 土壤成分拉曼光譜檢測(cè)研究進(jìn)展

拉曼光譜技術(shù)多數(shù)用于地質(zhì)學(xué)、環(huán)境學(xué)、國(guó)家安全等領(lǐng)域的土壤檢測(cè)，在精細(xì)農(nóng)業(yè)測(cè)土施肥中還處于研究探索階段[23,50-54]。主要是由于拉曼光譜在定性分析中具有優(yōu)勢(shì)，在定量分析中缺乏有效的技術(shù)手段維持拉曼光譜的信噪比。表2總結(jié)了近十年國(guó)內(nèi)外的基于拉曼光譜的土壤養(yǎng)分快速檢測(cè)的典型研究論文。在以往基于拉曼光譜的土壤養(yǎng)分快速檢測(cè)中，涵蓋的土壤養(yǎng)分包括土壤有機(jī)質(zhì)、土壤磷素以及土壤氮素。

由于芳香族和脂肪族都具有拉曼活性，為土壤有機(jī)質(zhì)的分析提供了依據(jù)。SOWOIDNICH等[37]應(yīng)用SERDS技術(shù)抑制了土壤熒光，通過(guò)解讀PLSR預(yù)測(cè)模型的回歸系數(shù)，點(diǎn)明基于SERDS技術(shù)的土壤有機(jī)質(zhì)預(yù)測(cè)模型的貢獻(xiàn)因子主要為土壤中的無(wú)機(jī)碳和有機(jī)碳。在不消除熒光背景時(shí)，由于拉曼光譜強(qiáng)度與有機(jī)質(zhì)含量呈線性關(guān)系，熒光引起的基線漂移也可以成為PLSR預(yù)測(cè)模型的貢獻(xiàn)因子。因此PLSR預(yù)測(cè)結(jié)果的貢獻(xiàn)因子可能并非純粹的拉曼散射，為模型的解讀與重現(xiàn)性驗(yàn)證帶來(lái)困難。另一方面，融合拉曼光譜與紅外吸收光譜可以提高土壤有機(jī)質(zhì)的預(yù)測(cè)精度，說(shuō)明融合2種光譜可以彌補(bǔ)單獨(dú)光譜中缺失的分子信息，提升土壤有機(jī)質(zhì)含量的預(yù)測(cè)精度[48]。下一步，降低冗余變量的同時(shí)，分析拉曼特征波峰和模型的貢獻(xiàn)因子，提升貢獻(xiàn)因子的可解讀性及模型的重現(xiàn)性將會(huì)促進(jìn)拉曼光譜技術(shù)在土壤成分快速檢測(cè)中的發(fā)展。

在基于拉曼光譜的土壤可溶性氮的快速檢測(cè)中，當(dāng)前研究主要根據(jù)溶液中的氮含量進(jìn)行檢測(cè)。邵艷秋等[55]應(yīng)用與硝酸鹽溶液混合的糊狀土壤樣本來(lái)采集拉曼光譜，對(duì)土壤中可溶性氮的檢測(cè)未取得良好的結(jié)果。在對(duì)土壤全氮含量的檢測(cè)中，SOWOIDNICH等[37]應(yīng)用SERDS方法給出了2=0.81的檢測(cè)結(jié)果。由于PLSR的回歸系數(shù)分析未顯示與氮素相關(guān)的波峰，因此把該檢測(cè)結(jié)果歸因于土壤氮素與有機(jī)質(zhì)的相關(guān)性。值得注意的是，該團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了顯微拉曼技術(shù)獲取了單位面積內(nèi)多位點(diǎn)的光譜平均值，避免了單點(diǎn)檢測(cè)中由于土壤空間變異性帶來(lái)的無(wú)效檢測(cè)。同時(shí)，結(jié)合SERDS方法抑制了熒光，恢復(fù)了拉曼信號(hào)。這種拉曼光譜的檢測(cè)方法是獲取高分辨率拉曼信號(hào)的關(guān)鍵，是拉曼光譜檢測(cè)設(shè)備開發(fā)的一個(gè)趨勢(shì)。

在基于拉曼光譜的土壤磷素檢測(cè)中，以往研究嘗試了土壤磷素的定性與定量分析。KWEON[27]測(cè)試了拉曼光譜對(duì)農(nóng)田土壤磷素的定量分析精度，并未取得良好的預(yù)測(cè)精度（2=0.11～0.27）。另一方面，研究表明拉曼光譜對(duì)土壤中的磷酸鹽化合物的分子振動(dòng)表現(xiàn)敏感，在定性分析中有較高的精度。但是，傳統(tǒng)單點(diǎn)檢測(cè)方法需要數(shù)次嘗試才能獲得土壤樣本中磷酸根的拉曼峰，使得檢測(cè)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力[56]。NKEBIWE等[38]應(yīng)用共焦顯微拉曼光譜的測(cè)試顯示，土壤樣本中磷酸根離子分布存在微米級(jí)的空間變異性，激光照射的點(diǎn)源數(shù)據(jù)可能避開目標(biāo)土壤成分，造成無(wú)效檢測(cè)。高空間分辨率的數(shù)據(jù)獲取方法可以避免樣本空間變異帶來(lái)的無(wú)效數(shù)據(jù)采集。ZHENG等[57]將不同濃度的磷酸鹽化合物與經(jīng)過(guò)有機(jī)質(zhì)濾除的土壤充分混合，將混合物烘干后測(cè)量了拉曼光譜。相比于田間原始土壤樣本，這種混合方法可以降低熒光以及土壤成分分布的空間變異性帶來(lái)的影響。同時(shí)，應(yīng)用小波變換濾除背景干擾，提取了特征信號(hào)，取得了較高的預(yù)測(cè)精度（2=0.94）。結(jié)果表明了拉曼光譜對(duì)磷酸根離子含量的預(yù)測(cè)能力。

以往研究表明拉曼光譜在經(jīng)過(guò)風(fēng)干和過(guò)篩處理后的土壤樣品的定性與定量分析中具有很大潛力。這種情況下，仍需要依據(jù)土壤分析標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行土壤樣本的采集和制備。水分對(duì)拉曼光譜干擾很小，因此不需要干燥土壤樣本。同時(shí)說(shuō)明開發(fā)便攜式拉曼光譜儀實(shí)現(xiàn)農(nóng)田土壤的原位測(cè)量是可行的。考慮土壤空間的變異性及農(nóng)田環(huán)境具有更強(qiáng)的背景光干擾，今后研究需要開發(fā)適用于田間拉曼光譜的檢測(cè)方法。從當(dāng)前的技術(shù)來(lái)看，SERDS與高空間分辨率拉曼光譜檢測(cè)方法的結(jié)合將是農(nóng)田土壤成分原位測(cè)量的技術(shù)保障[57]。另一方面，采用拉曼光譜與紅外吸收光譜相結(jié)合方法可以實(shí)現(xiàn)信息互補(bǔ)，提升土壤成分的預(yù)測(cè)精度，今后可嘗試更多的土壤成分的檢測(cè)。在獲取有效拉曼光譜數(shù)據(jù)的同時(shí)，去除冗余變量，提升模型的重現(xiàn)性與可解讀性是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)。

表2 近十年基于拉曼光譜的農(nóng)田土壤快速檢測(cè)代表性研究

注：列表中研究均采用實(shí)驗(yàn)室制備方法將土壤樣本風(fēng)干、過(guò)篩等處理后采集拉曼光譜數(shù)據(jù)。PLSR為偏最小二乘回歸；SLR為簡(jiǎn)單線性回歸；MLR為多元線性回歸；PLS-DA為偏最小二乘判別分析；SVM為支持向量機(jī)；GA為遺傳算法；PCA為主成分分析；LSSVM為最小二乘支持向量機(jī)；BPNN為反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。2為預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)集的決定系數(shù)。

Note: The list paper all used lab-based sample treatment such as air drying and sieving before the Raman spectral collection. PLSR, partial least squares Regression. SLR, simple linear regression; PLS-DA, partial least squares-discriminant analysis; SVM, support vector machine; GA, genetic algorithm; PCA, principal component analysis; LSSVM, least square-support vector machine; BPNN, back-propagation neural network.2is coefficient of determination in the prediction data set.

4 問(wèn)題及建議

應(yīng)用拉曼光譜對(duì)土壤養(yǎng)分的定性、定量分析研究還不能滿足精細(xì)農(nóng)業(yè)測(cè)土施肥的要求，這主要是由于土壤中的熒光會(huì)淹沒(méi)強(qiáng)度較弱的拉曼信號(hào)。目前土壤分析仍然需要實(shí)驗(yàn)室的簡(jiǎn)單制樣，對(duì)土壤樣本進(jìn)行干燥、過(guò)篩處理后采集拉曼光譜。并且，需要去噪、降維以及特征波段提取等方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。不同的預(yù)處理方法會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果不一致，降低敏感波段選取的可重復(fù)性，導(dǎo)致拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不能得到充分發(fā)揮。為此，建議選擇數(shù)據(jù)集建模時(shí)應(yīng)充分考慮土壤水分、粒度等影響因素，包括分析多種土壤類型、土壤水分和養(yǎng)分水平對(duì)特征波段選取的影響，進(jìn)而確定適合拉曼光譜檢測(cè)的制樣方法。另一方面，研究顯示SERDS技術(shù)與顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)檢測(cè)目標(biāo)選擇性好，可以恢復(fù)土壤成分的拉曼波峰（圖2），在敏感波峰選擇上具有可重復(fù)性，為農(nóng)田土壤成分快速分析提供了有力的技術(shù)支持。然而，農(nóng)田土壤具有較高的空間變異性，如何設(shè)計(jì)激發(fā)光源，平衡對(duì)目標(biāo)的選擇性和樣本的代表性，開發(fā)適合于SERDS的農(nóng)田現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)與數(shù)據(jù)處理技術(shù)還需進(jìn)一步研究。

5 結(jié) 論

本文對(duì)拉曼光譜在精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分檢測(cè)中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了梳理，對(duì)不同拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了分析，得出了以下結(jié)論：

1）在土壤信息的快速檢測(cè)中，采用紫外光或近紅外光波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光源可以一定程度抑制熒光。隨著激光半導(dǎo)體的發(fā)展，雙波長(zhǎng)便攜式激光拉曼光譜儀的開發(fā)，可以將拉曼光譜儀應(yīng)用在背景光及熒光干擾較強(qiáng)的室外環(huán)境，應(yīng)用移頻激發(fā)的方法來(lái)濾除背景噪聲，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤成分的在線分析。應(yīng)用共焦顯微拉曼光譜技術(shù)，可以聚焦目標(biāo)微粒，提升對(duì)待測(cè)目標(biāo)的選擇性，屏蔽其他成分的干擾。結(jié)合共焦顯微拉曼技術(shù)與移頻激發(fā)技術(shù)，可有效地濾除熒光、快速提取目標(biāo)物質(zhì)的拉曼信號(hào)，將是未來(lái)便攜式拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)及設(shè)備發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。表面增強(qiáng)信號(hào)可以提升拉曼信號(hào)的強(qiáng)度，當(dāng)前的問(wèn)題是如何設(shè)計(jì)金屬基底以提高表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)的穩(wěn)定性。

2）拉曼光譜技術(shù)在土壤有機(jī)質(zhì)、土壤氮素以及土壤磷素的定性、定量分析中展現(xiàn)了潛力。在土壤有機(jī)質(zhì)的檢測(cè)中，有機(jī)質(zhì)的熒光成分沒(méi)有完全覆蓋拉曼峰，在國(guó)內(nèi)典型土壤識(shí)別中分類精度達(dá)到96%，但對(duì)于有機(jī)質(zhì)含量的分析精度還有待提高。融合紅外吸收光譜與拉曼光譜數(shù)據(jù)可以顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)含量的預(yù)測(cè)精度，進(jìn)一步揭示紅外吸收光譜與拉曼光譜的互補(bǔ)性質(zhì)。在土壤氮素檢測(cè)中，對(duì)于土壤溶液中的硝酸鹽含量，拉曼光譜可以取得很高的預(yù)測(cè)精度。但是對(duì)于土壤樣本中的硝酸鹽，拉曼光譜技術(shù)難以對(duì)其定量分析。在土壤磷素的檢測(cè)中，拉曼光譜可以精確識(shí)別參雜土壤中不同種類的磷酸鹽，其檢測(cè)限優(yōu)于傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法。對(duì)于混合于土壤中不同濃度的磷酸鹽，拉曼光譜對(duì)其的定量分析也取得了很高的精度。采用融合算法提升模型的定量分析精度，減少冗余變量，提升預(yù)測(cè)模型的重現(xiàn)性與可解讀性，將是拉曼光譜技術(shù)的一個(gè)重要研究方向。

3）拉曼光譜選擇性好、檢測(cè)限低、不受水分干擾、樣本預(yù)處理小、與紅外光譜信息互補(bǔ)，這些特點(diǎn)使拉曼光譜在土壤養(yǎng)分分析中具有較大優(yōu)勢(shì)。由于檢測(cè)的樣本范圍取決于激發(fā)光照射在樣本上的光點(diǎn)尺寸，而土壤樣本的空間變異性為目標(biāo)物質(zhì)檢測(cè)帶來(lái)了一定困難。因此獲取有效拉曼信號(hào)、抑制背景光及熒光信號(hào)是實(shí)現(xiàn)高分辨率檢測(cè)的關(guān)鍵。開發(fā)農(nóng)田現(xiàn)場(chǎng)的拉曼光譜的快速、高效獲取技術(shù)，建立土壤樣本的檢測(cè)規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)，將會(huì)大力推進(jìn)土壤成分信息實(shí)時(shí)獲取技術(shù)的發(fā)展。

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Research progress on the rapid detection of soil components using Raman spectroscopy: A review

LI Qichen1,2, LI Minzan1,2※, YANG Wei1,3, SUN Hong1,3, ZHANG Yao1

(1. Key Laboratory of Smart Agriculture System Integration of Ministry of Education, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Yantai Institute of China Agricultural University, Yantai 264003, China; 3. Key Laboratory of Agricultural Information Acquisition Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The current measurement of soil properties can be limited in the variable-rate fertilizer application using soil analysis, due to the labor-intensive and time-consuming in the laboratory. Rapid, non-destructive soil detection is highly required to be developed using visible-infrared spectroscopy. Among them, Raman spectroscopy can be used to detect the vibrational properties of molecules, due to the fast, non-invasive, small sample treatment, and free interference from water in various fields. Nevertheless, incident light is also required to induce the Raman scattering, in order to compensate for the information with infrared spectroscopy. Therefore, the Raman scattering measurement can be widely used in the composition and dynamic process of soil minerals, bacteria colonies, and humic fraction in soil sensing. However, it is still lacking on the fluorescence effect of soil in the sensing of soil nutrients, which can weaken the Raman signals and the information extraction for the quantitative analysis. Raman spectroscopy has been introduced into some novel measurement techniques to improve the signal-to-noise ratio in recent years, including the shifted excitation Raman difference spectroscopy (SERDS), confocal Raman microscope, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). Meanwhile, both aliphatic and aromatic compounds are Raman active in the quantitative and qualitative detection of soil organic matter (SOM). Moreover, many phosphorous compounds in soil are also Raman active, leading to low prediction accuracy using visible-near infrared spectroscopy. In this review, the research progress was proposed on the Raman spectroscopy in the rapid detection of soil nutrients, together with the technical means in suppressing soil fluorescence interference to obtain high-resolution Raman signals. In the detection of SOM, the fusion of infrared and Raman spectral data significantly improved the prediction accuracy of 43% in the root mean square error (RMSE). In addition, the SERDS technique was used to detect the SOM of 33 soil samples. The reconstructed Raman peaks of soil minerals and organic materials obtained an excellent prediction accuracy of the SOM, with the determination of coefficient2=0.82, and the residual prediction deviation RPD=1.81. Raman spectroscopy was used to detect the water-soluble nitrogen in the soil solution, whereas, the SERS was to enhance the Raman peaks. An excellent correlation was obtained between the concentration of water-soluble nitrogen and the SERS data (2=0.91). Research showed that Raman spectroscopy can be an effective tool to identify the different phosphate species in soil. Wavelet packet decomposition of Raman spectra was used to predict the phosphorus concentration in the phosphate-mixed soil with the SOM leached, where the accuracy of the regression model reached2=0.94. Since the measurement area of Raman spectroscopy depended mainly on the spot size of the laser that irradiated on the sample surface, the spatial variability of the soil sample can be difficult to focus on the target substance. The effective Raman signal of soil nutrients can be obtained with high spatial resolution while suppressing the interferences from the background light. The combination of SERDS and micro-Raman technologies can be expected to serve as an in-situ measurement of soil nutrients. Reducing the redundant variables is crucial when applying spectral fusion since interpretability and reproducibility of the prediction model are paramount in the sensor development using Raman spectroscopy.

soil; Raman spectroscopy; infrared spectroscopy; shifted excitation; confocal Raman microscope; surface-enhanced Raman spectroscopy; precision agriculture

2022-05-01

2022-09-14

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD2001501）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31971785）；煙臺(tái)市校地融合發(fā)展項(xiàng)目（2020XDRHXMPT35）

李奇辰，博士后，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)信息快速獲取技術(shù)。Email：liqichen@cau.edu.cn

李民贊，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榫?xì)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)集成。Email：limz@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.202205006

S24

A

1002-6819(2023)-07-0001-09

李奇辰，李民贊，楊瑋，等. 拉曼光譜在精細(xì)農(nóng)業(yè)土壤成分快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2023，39(7)：1-9. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202205006 http://www.tcsae.org

LI Qichen, LI Minzan, YANG Wei, et al. Research progress on the rapid detection of soil components using Raman spectroscopy: A review[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(7): 1-9. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202205006 http://www.tcsae.org