張秉華?牛龍青?衷紅梅?杜亞俊?鄧玉龍?周志云

摘要：目的 評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)不同企業(yè)生產(chǎn)的甲硝唑片的質(zhì)量。方法 按照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)合探索性研究，包括有關(guān)物質(zhì)方法的測(cè)定、亞硝酸鹽含量的測(cè)定、溶出行為一致性及溶出度方法考察、微生物限度方法適用性實(shí)驗(yàn)及分析，綜合評(píng)價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的可控性。結(jié)果 抽取的130批樣品，按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格率為100.0%。探索性研究結(jié)果表明，本品的雜質(zhì)水平主要與原料藥有關(guān)，不同企業(yè)的雜質(zhì)檢出情況差異不明顯；不同企業(yè)樣品均檢出亞硝酸鹽，但均符合ICH限度要求；各企業(yè)樣品15 min的溶出度均大于85%；微生物限度試驗(yàn)結(jié)果顯示甲硝唑片對(duì)需氧菌總數(shù)均有不同程度的抑制作用。結(jié)論 目前甲硝唑片總體質(zhì)量較好；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)需進(jìn)一步提高，建議現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)增加有關(guān)物質(zhì)和亞硝酸鹽含量的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：甲硝唑片；質(zhì)量評(píng)價(jià)；藥品標(biāo)準(zhǔn)；有關(guān)物質(zhì)；亞硝酸鹽；溶出行為

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract? ? Objective To evaluate the quality of metronidazole tablets from different manufactures. Methods The quality and standard controllability of metronidazole tablets was evaluated by researching on the original standard and the exploratory experiments including the determination of related substances and nitrite， dissolution behavior consistency and dissolution method inspection， and microbial limit method suitability test and analysis. Results? ? The qualified rate was 100.0% for the 130 batches of samples extracted according to the original standard. The exploratory research results showed that the impurity level of this product was mainly related to the API， and the difference of impurity detection among different enterprises was not obvious. Nitrite was detected in samples from different enterprises， which met the ICH limit requirements. The dissolution of samples from all enterprises in 15 min was more than 85%. The results of microbial limit test showed that metronidazole tablets had different degrees of inhibition on aerobic bacteria. Conclusion? ? The quality of metronidazole tablets was good at present and the current standard should be further improved. It was proposed that the related substance method and the nitrite method should be added.

Key words Metronidazole tablets; Quality evaluation; Drug standard; Related substance; Nitrite;

Dissolution behavior

甲硝唑?yàn)榈谝淮趸溥蝾惪垢腥舅幬?，?duì)厭氧菌具有較強(qiáng)是抗菌作用，其抗菌原理是其硝基被易感生物激活還原成一種高活性的自由基陰離子，以蛋白質(zhì)和DNA分子為靶點(diǎn)，抑制細(xì)菌的DNA合成，從而干擾細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。甲硝唑由GD SEARLE公司（輝瑞子公司）研發(fā)，1960年甲硝唑片在法國(guó)上市，商品名“FLAGYL”，1981年在中國(guó)境內(nèi)上市。目前國(guó)內(nèi)上市的制劑包括片劑（主要規(guī)格為0.2 g，另外還有0.1 g、0.25 g和0.5 g上市）、膠囊、注射液、溶液劑、凝膠劑、栓劑等?，F(xiàn)行的USP、JP及ChP均收載有甲硝唑原料和甲硝唑片。

甲硝唑片為2022年國(guó)家質(zhì)量評(píng)價(jià)抽驗(yàn)品種，共抽到35個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的130批樣品，涉及全國(guó)31個(gè)省、自治區(qū)和直轄市的藥品生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和醫(yī)療單位，其中93批抽自經(jīng)營(yíng)單位，6批抽自醫(yī)療機(jī)構(gòu)，31批抽自生產(chǎn)企業(yè)，可較客觀地反映國(guó)內(nèi)該品種的質(zhì)量現(xiàn)狀。本文按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)130批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，并針對(duì)其中發(fā)現(xiàn)的問題開展相應(yīng)的探索性研究，進(jìn)而從有效性、安全性角度對(duì)該產(chǎn)品目前的質(zhì)量現(xiàn)狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)完善制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提出建議。

1 儀器及試藥

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（島津LC-2030 3D）、離子色譜色譜儀（22176-6000）、RC1208D型溶出度儀（天津天大天發(fā)科技公司）、UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）、電子分析天平（瑞士梅特勒XPE205）、高純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）、臥式矩形壓力蒸汽滅菌器（上海華成醫(yī)用核子儀器公司）、霉菌培養(yǎng)箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠）、OLYMPUS.CH型三目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、pH酸度計(jì)（賽多利斯科技（北京）有限公司）。

甲醇（色譜純，美國(guó)SIGMA-ALORICH公司）、氫氧化鉀（分析純）、鹽酸（分析純）。

1.2 對(duì)照品

2-甲基-5-硝基咪唑?qū)φ掌罚号?hào)100191-20180，純度100.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。亞硝酸鈉對(duì)照品：批號(hào)E003013，純度99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]，大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B） 44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（ Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]。

1.4 樣品

甲硝唑片為2022年國(guó)家抽驗(yàn)樣品，共130批，樣品涉及35個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，個(gè)別企業(yè)未提供原輔料，部分企業(yè)提供了近效期樣品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)

分別按照《中國(guó)藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)及各企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)130批甲硝唑片進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2 探索性研究

2.2.1 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

篩選并優(yōu)化已通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)G和企業(yè)H有關(guān)物質(zhì)HPLC方法，并對(duì)所有企業(yè)樣品及部分近效期樣品有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察[1-2]。色譜方法為：Welch

（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇：水（20：80， V/V）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 亞硝酸鹽測(cè)定

篩選并優(yōu)化已通過一致性評(píng)價(jià)兩家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的亞硝酸鹽IC方法，并對(duì)部分企業(yè)的亞硝酸鹽含量進(jìn)行考察[3-4]。色譜條件：色譜柱AS11-HC RFICTM；柱溫：30℃；淋洗液：氫氧化鉀溶液；進(jìn)樣量：10 μL，梯度洗脫表見表 1。

2.2.3 溶出行為一致性及溶出度方法考察

考察35家廠家的樣品在15 min時(shí)的溶出度，同時(shí)對(duì)兩種溶出度計(jì)算方式進(jìn)行比較[5-6]。

2.2.4 微生物限度方法適用性實(shí)驗(yàn)及分析

根據(jù)《中國(guó)藥典》附錄“微生物限度檢查法”對(duì)甲硝唑片進(jìn)行需氧菌總數(shù)的檢驗(yàn)，分別采用平皿傾注（直徑90 mm，1 mL/皿）法和中和培養(yǎng)基稀釋法對(duì)需氧菌總數(shù)和控制菌大腸埃希菌進(jìn)行適用性試驗(yàn)[7]。平皿傾注法適用性試驗(yàn)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值均應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，即方法有效。中和培養(yǎng)基稀釋法適用性試驗(yàn)分別設(shè)立試驗(yàn)組、陽性組和陰性組，革蘭染色鏡檢試驗(yàn)組和陽性組均應(yīng)檢出大腸埃希菌革蘭陰性菌直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢），陰性組應(yīng)無任何菌落生長(zhǎng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗(yàn)結(jié)果

按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，130批甲硝唑片全部合格，合格率為100.0%。

比較不同企業(yè)法定檢驗(yàn)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)差異，主要區(qū)別：①是否設(shè)置有關(guān)物質(zhì)和亞硝酸鹽檢查項(xiàng)目；②亞硝酸鹽限度存在差異；③溶出度計(jì)算方式存在差異。

3.2 探索性研究結(jié)果

3.2.1 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

對(duì)不同企業(yè)的甲硝唑片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)考察，典型色譜圖見圖1。從典型色譜圖可以看出，不同廠家甲硝唑片主要檢出4個(gè)雜質(zhì)，查詢文獻(xiàn)，同時(shí)利用中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院提供的甲硝唑雜質(zhì)A（2-甲基-5-硝基咪唑）對(duì)照品進(jìn)行定位，確定檢出的4個(gè)雜質(zhì)中有一個(gè)已知雜質(zhì)，其他3個(gè)均為未知雜質(zhì)。雜質(zhì)I為起始物料，雜質(zhì)A為起始物料位置異構(gòu)體，參照通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)提供的研究資料和國(guó)抽標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)有關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)情況，雜質(zhì)A和雜質(zhì)I出峰位置基本一致，兩者合并控制。

采用通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，對(duì)未通過一致性評(píng)價(jià)企業(yè)樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)考察。已知雜質(zhì)2-甲基-5-硝基咪唑按外標(biāo)法計(jì)算，檢出范圍在0.004%～0.02%，其中企業(yè)A有一批樣品已知雜質(zhì)檢出量為0.02%，企業(yè)E和F均有一批樣品已知雜質(zhì)檢出量為0.01%，但均小于企業(yè)G和H的已知雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限度（0.1%）；雜質(zhì)總量檢出范圍為0.01%～0.06%，均在限度0.4%范圍內(nèi)。與通過一致性企業(yè)G和企業(yè)H比較，6家企業(yè)雜質(zhì)檢出情況與企業(yè)G和H無較大差異。對(duì)所有企業(yè)樣品的雜質(zhì)A（雜質(zhì)I）、和雜質(zhì)總量數(shù)據(jù)繪制頻數(shù)分布圖和箱式圖，見圖2～3。

從頻數(shù)圖可以看出，各企業(yè)樣品基本呈正態(tài)分布，已知雜質(zhì)、其他單個(gè)最大雜質(zhì)和雜質(zhì)總量分布較為均勻。從箱式圖可以看出，與通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)G和企業(yè)H的樣品檢驗(yàn)情況比較，其他6家企業(yè)樣品中檢出的其他未知雜質(zhì)個(gè)數(shù)更多，各雜質(zhì)水平稍偏大，企業(yè)A個(gè)別批次的樣品已知雜質(zhì)檢出情況和雜質(zhì)總量出現(xiàn)了離散情況，但各企業(yè)整體雜質(zhì)檢出情況比較穩(wěn)定，雜質(zhì)檢出含量普遍較小。

通過對(duì)企業(yè)A和E提供的近效期樣品和各企業(yè)提供的原料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，企業(yè)A、E近效期樣品的雜質(zhì)檢出情況和效期樣品檢出情況一致，且各雜質(zhì)含量無較大差異，也反應(yīng)了甲硝唑片在正常的保存情況下，藥品質(zhì)量較穩(wěn)定；不同企業(yè)甲硝唑片檢出雜質(zhì)種類、個(gè)數(shù)和甲硝唑原料檢出雜質(zhì)基本一致，說明甲硝唑片劑生產(chǎn)過程中基本不引入其他工藝雜質(zhì)。

綜上可知，甲硝唑片中的雜質(zhì)水平基本由其原料藥的雜質(zhì)水平?jīng)Q定，提示甲硝唑片中的雜質(zhì)主要來源于原料藥，控制好原料藥生產(chǎn)工藝是保證制劑質(zhì)量的關(guān)鍵。從甲硝唑片有關(guān)物質(zhì)檢出情況推測(cè)，各企業(yè)由原料引入的工藝雜質(zhì)均較低。

3.2.2 亞硝酸鹽測(cè)定結(jié)果

參考文獻(xiàn)[8-9]及通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)H企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，采用離子色譜法對(duì)部分企業(yè)的亞硝酸鹽含量進(jìn)行了考察，并進(jìn)行比較分析，測(cè)定結(jié)果頻數(shù)分布圖見圖4，箱式圖見圖5。

甲硝唑片最大日服劑量2400 mg，治療期不超過1個(gè)月，參照ICH M7指導(dǎo)原則，日攝入量按120 μg/d計(jì)算，亞硝酸鹽限度應(yīng)為0.005%。按通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)H亞硝酸鹽檢查標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)抽樣批數(shù)≥2的其他未控制亞硝酸鹽的企業(yè)進(jìn)行亞硝酸鹽計(jì)算，通過分析甲硝唑片亞硝酸鹽測(cè)定結(jié)果，亞硝酸鹽檢出范圍在0.00017%～0.0019%，各企業(yè)亞硝酸鹽均在限度0.0045%范圍內(nèi)。與通過一致性評(píng)價(jià)的企業(yè)G和H的樣品檢驗(yàn)情況比較，13家企業(yè)樣品亞硝酸鹽檢出情況基本一致。

由頻數(shù)分布圖和箱式圖可知，各企業(yè)樣品基本呈正態(tài)分布，亞硝酸鹽含量分布較為均勻，企業(yè)B和N亞硝酸鹽含量批間差異較大，但各企業(yè)整體亞硝酸鹽檢出情況比較穩(wěn)定，檢出含量普遍較小。

亞硝酸鹽為甲硝唑結(jié)構(gòu)中硝基的降解產(chǎn)物，大量攝入亞硝酸鹽可誘導(dǎo)高鐵血紅蛋白血癥，臨床表現(xiàn)為口唇，指甲發(fā)紺，皮膚出現(xiàn)紫斑等缺氧癥狀，可致死亡；此外，亞硝酸鹽存在一定的致癌性，為了更好地控制甲硝唑片的質(zhì)量，建議各企業(yè)在內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)亞硝酸鹽含量進(jìn)行控制。

3.2.3 溶出行為一致性及溶出度方法比較

按《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，對(duì)35家企業(yè)15 min溶出度進(jìn)行了考察，同時(shí)對(duì)溶出度兩種計(jì)算方法進(jìn)行了比較，如圖6～7所示。

由頻數(shù)分布圖和箱式圖可知，各企業(yè)溶出度均值并未出現(xiàn)明顯的離散，35家企業(yè)樣品15 min溶出度均大于85%，70批樣品的溶出度均值數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，分布均勻。

通過對(duì)70批樣品分別按吸收系數(shù)法和對(duì)照品比較法考察，實(shí)驗(yàn)表明兩種方法的溶出度結(jié)果基本一致?？紤]兩種計(jì)算方式各有優(yōu)勢(shì)，且計(jì)算結(jié)果無較大差異，故各企業(yè)可繼續(xù)沿用各自執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算方式。

3.2.4 微生物限度測(cè)定

對(duì)35家企業(yè)的130批甲硝唑片采用平皿傾注法分別進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢測(cè)，所有供試品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均符合規(guī)定。采用中和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行控制菌（大腸埃希菌）檢查方法，所有供試品均沒有檢出大腸埃希菌。

4 結(jié)論

按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，甲硝唑片合格率為100%，結(jié)合探索性研究情況認(rèn)為，甲硝唑片總體質(zhì)量情況較好。探索性研究結(jié)果顯示，甲硝唑片整體雜質(zhì)檢出情況比較穩(wěn)定，雜質(zhì)檢出量普遍較小，與原料藥雜質(zhì)含量相近；近效期樣品雜質(zhì)檢出情況和效期樣品檢出情況一致，且各雜質(zhì)含量無較大差異，反應(yīng)了甲硝唑片在正常保存情況下，藥品質(zhì)量穩(wěn)定。為更好地反映藥品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，建議對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行統(tǒng)一。

參 考 文 獻(xiàn)

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