白 龍, 蘇佳燦

(上海大學轉化醫(yī)學研究院, 上海 200444)

伴隨我國老齡化社會的加速到來, 材料科學和生物醫(yī)學技術的迅猛發(fā)展以及人們生活水平、醫(yī)療保健、康復水平的顯著提高, 人們對人體組織器官修復和置換等方面的需求日益迫切[1]. 由創(chuàng)傷、感染、腫瘤等重大疾病導致的各類骨/軟骨損傷修復, 一直也是骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)[2]. 近年來, 骨組織工程的興起為骨/軟骨損傷的修復治療開辟了全新的研究方向.骨形成相關活性因子/細胞與生物活性材料支架載體的有機復合, 是骨組織工程構建的起始和關鍵, 也是目前國內外研究的熱點[3-4]. 然而, 傳統骨組織工程的設計原則缺乏生物材料對骨組織形成過程中不同階段、多種細胞、特異微環(huán)境等多維度、多層次的有序調控, 無法有效誘導空間化骨微環(huán)境特征, 成骨/軟骨效果有限, 進而極大地限制其引導骨/軟骨再生的活性. 此外, 骨組織工程的研究缺乏接近人體骨組織本身特性的體外模型, 支架材料和種子細胞的篩選單一依靠體內測試, 周期長、成本高, 無法滿足現實科研和臨床需求. 因此, 亟需開發(fā)能夠促進骨/軟骨組織有序再生修復的新技術.

類器官是近年來發(fā)展起來的新興生物技術, 主要通過干細胞自組織方式, 在體外三維(three dimension, 3D) 培養(yǎng)條件下誘導分化形成有功能的組織復合體[5-6]. 類器官具有來源組織或器官的部分關鍵結構和功能特征. 迄今為止, 研究者已成功建立了一系列人體組織(如腦、肝、腎、腸、皮膚、骨骼、血管) 類器官模型. 類器官技術在器官發(fā)育、疾病模擬、精準醫(yī)學、藥物篩選和再生醫(yī)學等領域顯示出廣泛應用前景, 2017 年被Nature Methods 列為年度技術[7]. 骨髓干細胞或骨內膜細胞通過增殖、分化得到骨類器官(如骨小梁、軟骨等類器官), 這些骨類器官表現出與自然骨類似的生理和結構特征, 如呈現特定的生理氧和代謝梯度、維持胞外和細胞間的連接等特點[8-9]. 然而, 與心、腦等組織類器官相比較, 骨類器官研究尚處于起步階段. 本工作系統總結了骨/軟骨類器官發(fā)展歷程、構建策略、評價表征、機制探索以及臨床應用等方面的前沿進展, 通過舉例分別簡述了骨和軟骨類器官的構建過程, 最后對骨/軟骨類器官發(fā)展可能遇到的問題和方向進行了總結和展望.

1 類器官

類器官是指人類成體干細胞或多能干細胞經體外3D 培養(yǎng)后, 自誘導形成的帶有特定結構和功能的細胞簇. 這一類器官雖不能稱為真正意義上的人體器官, 其卻能從構造與功能上與人體真實器官高度相似, 并可在體外持續(xù)穩(wěn)定傳代培養(yǎng). 過去10 年中, 類器官的發(fā)展被譽為干細胞研究中最令人振奮的進展之一. 正如交通方式的更迭, 從人力時代的馬車, 到蒸汽時代和電力時代的火車, 再到目前新時代的飛機汽車, 生命科學領域的研究模型也在不斷更迭, 從初代的細胞培養(yǎng)、1.0 時代的動物模型、1.5 時代的器官芯片, 已然進步到目前2.0 時代的類器官(見圖1). 器官芯片雖然在藥物篩選和安全性評估中極具發(fā)展?jié)摿? 但其存在明顯缺陷.目前器官芯片存在細胞來源少、干細胞分化不穩(wěn)定、芯片細胞種類單一、體外培養(yǎng)無法長時間培養(yǎng)等問題, 這些導致器官芯片的仿真程度仍然有限. 此外, 構建芯片所需聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 材料存在疏水問題, 芯片制備方式多樣不統一無規(guī)范, 制造成本高無法量產. 最近提出的類器官芯片(organoid-on-a-chip) 概念與器官芯片類似, 只是在體外培養(yǎng), 突出使用的是具有三維結構的類器官而不是單純二維培養(yǎng)的細胞. 類器官芯片作為器官芯片的重要發(fā)展方向之一, 伴隨類器官技術的發(fā)展, 有望成為未來藥物開發(fā)、篩選和安全性評估的重要平臺.

圖1 交通方式與生命科學研究模型更迭的對比Fig.1 Comparison of transportation modes and evolution of research models

早在20 世紀80 年代, “類器官” 一詞便已提出, 但直到2009 年, 荷蘭科學家Hans 團隊首次將腸道干細胞在體外培養(yǎng)成具有類腸的隱窩狀和絨毛狀上皮區(qū)域的3D 結構, 即小腸類器官(small-intestinal organoids), 由此開啟了類器官的研究[10]. 此后, 類器官研究步入高速發(fā)展期. 目前, 多種類器官已在體外被成功構建, 包括大腦、腎臟、胃、小腸、卵巢、結腸、肺、膀胱、肝臟、胰腺、食道、心臟等正常組織及相應的腫瘤組織類器官[11-12].

類器官技術作為一種全新的前沿科技, 在多個研究應用領域中極具發(fā)展?jié)摿? 包括發(fā)育機理學、疾病病理學、細胞生物學、再生醫(yī)學、精準醫(yī)學, 以及研究藥品毒性與藥效等試驗領域[5,13]. 類器官技術的發(fā)展為人類健康研究和新藥篩選創(chuàng)造了一個全新平臺, 這也是對目前二維細胞培養(yǎng)和動物模型策略的高信息量互補. 另外, 利用類器官技術可以獲得最貼近真實人類健康細胞, 進行細胞靶向治療也成為可能. 同時利用類器官所培育的干細胞群可以替換損傷或疾病的正常細胞, 實現類器官進行自體和同類異體組織治療, 而未來這一科技在精準醫(yī)學領域也將具有很大的發(fā)展?jié)摿? 日本東京醫(yī)科齒科大學研究團隊從患者健康腸道中提取出了黏膜干細胞, 并將其誘導培養(yǎng)成腸道類器官, 2022 年該研究團隊將體外培養(yǎng)的腸道類器官移植至患者潰瘍性大腸處, 其安全性嘗試結果將在一年后得到驗證. 這種再生移植技術為世界首創(chuàng)的再生醫(yī)學嘗試, 若進展順利, 潰瘍性大腸炎有望被徹底治愈, 這也為“克羅恩病” 的治療提供了可能. 雖然類器官治療技術已經展出了治療頑疾的潛力, 但其臨床轉化應用仍處于起步階段,后續(xù)仍有廣闊的發(fā)展空間. 此外, 通過這種技術手段, 結合CRISPR/Cas9 技術手段可以改善先天性遺傳異常情況, 使健康的轉基因細胞重新回流入病人體內, 并通過后期的再融合重新進入正常細胞中[14]. 在癌癥治療領域中, 病人來源的類器官已被預測為十分有效的藥篩手段. 在實施治療期間, 根據病人樣本來源的類器官可初步檢測病人體外對多種藥物的反應, 從而對癌癥病人的治療進行有效引導和效果預判. 隨著類器官技術的發(fā)展和其衍生的生產技術的研發(fā),類器官將被應用于生命科學的各個領域.

然而, 類器官的發(fā)展仍然面臨諸多問題和挑戰(zhàn). 類器官研究中最主要的問題是重復性和一致性, 這與過程管理欠缺和行業(yè)標準缺失有一定的關系. 類器官在構建階段因機械參與程度低、人為影響較大, 導致系統偶然誤差較大. 另外, 類器官檢測方式和檢測儀器過于缺乏, 活體觀察較多使用形態(tài)學觀察, 斷點觀察用的較多的是熒光檢測的各項數據, 對類器官數據實時檢測的光學、電化學等技術目前仍極不成熟. 目前, 很多科研工作者專注于創(chuàng)新類器官, 制作出的類器官有腺體、脾、腎、海馬體、垂體等, 但無法做出一個符合特定指標(如大小、形態(tài)、基因表達量等) 的類器官, 也無法滿足統計學指標(如類器官間的方差等). 這些問題也將極大地約束類器官的高速發(fā)展和臨床成果轉化. 類器官制造過程階段的工程掌控也是迫切需要解決的問題. 現階段培養(yǎng)類器官主要采用Matrigel 水凝膠作為培養(yǎng)基質. Matrigel 是康寧生命科學公司生產的一種Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 小鼠肉瘤細胞分泌的膠狀蛋白混合物, 因含有外源動物成分, 難以應用于人的很多治療場景. 另外, 即使現有將類器官與微流控技術進行結合的研究例子, 但是采用微流控芯片對類器官生存的流體環(huán)境進行模擬的方法有待進一步提升, 怎樣操作微流控等技術監(jiān)測控制類器官培養(yǎng)過程中流體微環(huán)境仍是亟需解決的問題.另外, 目前培養(yǎng)出的類器官直徑為100～500 μm, 雖然具備一定程度的尺度效應, 但仍然未能模擬人體組織、器官的狀態(tài), 如需培養(yǎng)尺寸更大的類器官, 其血管化問題亟待解決.

2 骨/軟骨類器官

骨與軟骨是構成身體支架的器官, 分別以骨組織和軟骨組織為主要結構成分. 在人的一生中, 這兩種組織尤其是骨組織不斷更新和改建, 以適應成年前機體的生長發(fā)育和成年后機體支撐功能的變化需求. 骨由骨組織、骨膜及骨髓等構成. 骨組織由大量鈣化的細胞間質及數種細胞組成, 堅硬且有一定韌性. 鈣化的細胞間質稱為骨基質. 細胞有骨原細胞、成骨細胞、骨細胞及破骨細胞4 種, 其中位于骨基質內的骨細胞最多, 其余3 種細胞均位于骨組織的邊緣. 軟骨組織由軟骨細胞、基質及纖維構成. 根據軟骨組織所含纖維的不同, 軟骨分為透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨3 種. 軟骨是固態(tài)的結締組織, 略有彈性, 能承受壓力和耐磨擦, 有一定的支持和保護作用(見圖2).

圖2 骨/軟骨結構組成示意圖Fig.2 Schematic diagram of bone and cartilage structure composition

骨/軟骨疾病是常見病、多發(fā)病, 具有起病隱匿、時間長等特點, 其預防和治療往往被忽視. 目前, 骨/軟骨疾病存在如下問題亟待解決:

(1) 研究難度大. 骨/軟骨組織和細胞種類繁多, 且細胞間相互作用極為復雜; 相對于軟組織, 骨骼硬組織研究的難度較大.

(2) 治療藥物和技術滯后. 受限于機制不清, 骨/軟骨疾病治療的藥物極為缺乏, 且絕大多數骨/軟骨疾病缺少有效治療藥物; 現有治療以緩解癥狀為主, 無法真正逆轉或延緩疾病進展.

(3) 組織工程研究進入瓶頸. 骨修復新材料研究周期長、成本高; 種子細胞和細胞因子選擇在安全性和作用機理方面存在爭議; 骨組織工程難以解決血管化難題, 無法用于修復大段骨缺損.

目前, 迫切需要開發(fā)新的研究工具和技術, 以較小成本和簡單方式模擬骨/軟骨的結構和生理功能, 在特定條件下能夠模擬疾病發(fā)生過程, 復制病理特點, 用于發(fā)病機制研究和促進再生修復. 可以說, 骨/軟骨類器官應運而生.

骨/軟骨類器官是體外培養(yǎng)的、含有一種以上細胞類型的微型組織, 表現出骨/軟骨的某些生理特征. 應用3D 培養(yǎng)技術將干細胞誘導特定譜系分化, 自我組裝, 形成與骨/軟骨組織細胞排布相似的微組織, 具有骨/軟骨特有功能. 骨/軟骨類器官能夠在體外實現自我更新和自我組織, 這是其區(qū)別于傳統體外組織培養(yǎng)的關鍵. 自我更新意味著干細胞能夠不斷克隆增殖產生子代細胞替代衰老和死去的細胞, 自我組織意味著干細胞能夠模擬體內情況進行自我分化并形成空間特征化結構, 進而模擬體內骨/軟骨相應功能.

2.1 發(fā)展歷程

相比于其他組織, 骨/軟骨類器官研究尚在起步階段. 由于運動系統內干細胞起源復雜, 種類和功能各異, 分化路徑不明確, 并且疾病種類多、病因復雜、周期長, 因此, 類器官構建具有相當難度. 2017 年Iordachescu 等[15-16]首先提出了骨類器官概念, 將成骨細胞加入含磷酸鈣的纖維素凝膠之中, 成骨細胞能夠自發(fā)形成類似天然骨的多級結構和骨細胞網絡, 模擬鈣鹽沉積及骨成熟多個階段. 引入破骨細胞后同時具備了骨形成和骨吸收功能, 能夠模擬正常骨改建過程. 隨后Akiva 等[17]、Park 等[18]、O’Connor 等[19]、Nilsson 等[20]等通過骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)、人骨膜衍生細胞(human periosteum-derived cell, hPDC) 等分別構建出能夠模擬骨形成的骨類器官. Abraham 等[21]使用兒童捐獻者的軟骨組織酶解后構建了軟骨類器官, 可模擬關節(jié)炎癥. Tam 等[22]使用iPSC 誘導軟骨分化構建了軟骨類器官. Xie 等[23]通過將BMSC 分散在GelMA 水凝膠微球之后培養(yǎng)得到骨痂類器官, 回植后可快速修復兔子大段骨缺損. Zhang 等[24]繪制了首個骨髓組織圖譜, 為骨髓類器官的構建奠定了基礎.

2.2 構建策略

2.2.1 骨類器官

2022 年, 生物材料領域頂級期刊Bioactive Materials 首次總結了骨類器官相關研究并展望了其潛在用途[25]. 骨類器官指以類骨基質生物活性材料為支架, 通過體外3D 培養(yǎng)結合定向誘導技術, 將各類干細胞(如骨骼干細胞、胚胎干細胞等) 或功能細胞(成骨細胞、破骨細胞等) 培育組裝成為具有骨空間特征的類骨組織, 能夠模擬骨生理和病理特征, 具備骨的某些特定功能, 可用于骨骼發(fā)育和調控機制研究, 藥物篩選和骨組織再生修復[26](見圖3). 盡管已有多種類器官成功構建, 但是骨類器官研究尚處于起步階段. 從分化調控角度, 骨形成具有長程性, 在不同時間剖面, 參與骨形成的細胞并不完全相同. 比如在編織骨形成階段, 以間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC) 及其成骨分化發(fā)揮主要作用; 而在骨小梁形成過程中, 破骨細胞介導的骨吸收及破骨細胞-成骨細胞對話是骨形成關鍵, 不同階段需要給予不同外部刺激誘導細胞分化. 此外, 區(qū)別于其他類器官, 骨類器官應具有類骨組織支架結果以提供力學支撐和空間化仿生結構.

圖3 骨類器官構建示意圖Fig.3 Schematic diagram of bone organoids construction

根據報道, 構建骨類器官有2 種方法: 直接構建法和間接構建法, 前者通過骨形成相關細胞形成類骨樣結構, 后者誘導干細胞形成軟骨, 軟骨再發(fā)生礦化形成骨組織.

(1) 直接構建法. 根據成年后骨塑建/骨改建理論, 通過在支架材料上接種成骨前體干細胞、成骨細胞或破骨前體細胞, 通過誘導使細胞與材料發(fā)生自組裝, 形成類骨樣結構, 中間不經歷軟骨階段. Iordachescu 等[15]于2017 年最早提出骨類器官概念, 通過應用含磷酸鈣的纖維素凝膠系統, 加入成骨細胞自我組裝成類骨樣結構, 再現了鈣鹽沉積及骨成熟多個階段, 得到類似天然骨的多級結構和骨細胞網絡. 他們通過介于2 個磷酸鈣陶瓷錨之間的纖維蛋白凝膠模型, 提出了骨形成的自組織結構模型(見圖4). 可以看出: 纖維蛋白支架在培養(yǎng)的第1 周圍繞保留點進行重組, 無細胞發(fā)育的對照類器官在7 d 后顯示出小幅收縮, 但仍保持扁平凝膠狀, 未組裝成3D 結構(見圖4(a)); 2 個錨點之間張力導致6 d 之前的細胞對齊排列, 10 d 后在整個結構中觀察到礦化結核(見圖4(b)); 7 d 后礦床不明顯，但4 d 后可以在靠近磷酸鈣源的地方觀察到個別礦化點(見圖4(c)); 14 d 時可見纖維蛋白框架發(fā)生變化, 從錨定區(qū)域向中心形成明顯基質, 直到3 個月時類器官完全被新基質覆蓋(見圖4(d)). 植入這些結構中的股骨骨膜細胞會有序沉積基質, 該基質在化學(膠原蛋白: 礦物質比例) 和結構方面與成熟骨非常相似. 拉曼光譜和X 射線衍射證實該礦物是與膠原蛋白相關的羥基磷灰石. 二次諧波成像表明, 膠原蛋白的組織方式與成熟的小鼠股骨相似. 納米計算機斷層掃描證實, 分化至骨細胞期的細胞通過小管連接, 并在整個培養(yǎng)過程中保持活力. 該模型可用于研究骨形成.

圖4 骨器官的早期構建Fig.4 Early construction of bone organoids

之后, Iordachescu 等[16]選取牛股骨小梁顆粒作為系統基礎, 將成骨細胞和破骨細胞同時種植在股骨頭微型小孔, 應用破骨細胞分化因子(receptor activator nuclearfactor κβ ligand,RANKL) 及巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) 刺激破骨形成, 應用類固醇及β-甘油磷酸酯促進成骨細胞礦化, 成功構建微米級骨類器官, 置入模擬失重環(huán)境中成功模擬失重導致的骨丟失(見圖5). 由圖5(a)可以看出: 骨組織由小梁組成, 形成致密的骨骼; 骨組織高度礦化, 由磷酸鈣組成, 蛋白質含量很少, 在骨髓腔中檢測硫酸鹽含量. 由圖5(b) 可以看出, 股骨頭由骨小梁組成(黑框), 適合承受較大機械負荷. 為確保骨類器官的解剖學相關結構基礎, 使用來自股骨頭熱處理后的微小梁顆粒(500～1 000 μm). 這些顆粒呈現出骨的層狀結構(見圖5(d)) 和表面形貌(見圖5(e)), 對于正常細胞傳感和附著必不可少. 它們還具有骨相關的生化成分, 由磷酸鈣相(micro-XRF) 組成(見圖5(f)). X 射線衍射分析證實這些是由成熟的骨礦物質羥基磷灰石(紅色條) 的生物衍生相組成(見圖5(g)). 微小梁天然具有高度靜電, 可用于插入液體細胞懸浮液滴以生成微型骨. 懸滴培養(yǎng)系統用于懸浮小梁和原代雌性骨效應細胞, 并通過重力沉降直接附著到骨小梁表面(見圖5(h)). 該模型將原代成骨細胞和破骨細胞接種到股骨頭微小梁, 隨后插入模擬微重力生物反應器(NASA-synthecon)以模擬減少機械刺激的病理狀態(tài). 與靜態(tài)對照組相比, 模擬微重力組破骨細胞骨吸收位點形態(tài)發(fā)生改變. 暴露于微重力5 d 可觀察到大量骨丟失. 在構建的類器官中可觀察到大的骨細胞突起和管狀結構以及新基質生成, 可用于研究骨改建過程, 揭示病理性骨質流失和骨骼重塑疾病機制.

圖5 含磷酸鈣的纖維素凝膠骨類器官構建Fig.5 Construction of cellulose gel bone organoids containing calcium phosphate

Akiva 等[17]利用人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC) 接種在多孔3D 絲素蛋白支架, 通過旋轉瓶生物反應器持續(xù)攪拌進行機械刺激, 而成骨細胞根據分化階段完成自組裝, 骨細胞嵌入產生的礦化細胞外基質中并能夠進行細胞間通訊(見圖6). 熒光免疫組織化學成像顯示標記(見圖6(a)～(c)) 為成骨細胞形成的早期階段,圖6(d)～(f) 為成熟成骨細胞, 圖6(g)～(i) 為骨細胞發(fā)育, 其中紅色為細胞質, 藍色為細胞核.圖6(a)～(i)中, 綠色分別為RUNX2 (第7 天)、OSX (第7 天)、ALP (第26 天)、骨鈣素(第26天)、骨橋蛋白(第26 天)、骨黏連蛋白(第21 天)、DMP1 (第28 天)、podoplanin (第28 天)和硬化素(第28 天). 圖6(j) 為MSCs 分化成成骨細胞和骨細胞的示意圖, 表明在圖6(a)～(i)中預期蛋白質表達的狀態(tài). 熒光圖像表明8 周后嵌入礦化基質中的骨細胞的自組織結構域, 骨細胞(硬化素, 紅色) 和礦物質(鈣黃綠素, 綠色) 的共定位見圖6(k). 圖6(l) 中膠原蛋白(紅色) 和礦物質(鈣黃綠素, 綠色) 表示絲素蛋白支架. 該系統在體外模擬了骨形成的早期狀態(tài),該階段破骨細胞及骨改建尚未發(fā)生作用. 當機械力模擬人體骨骼形成所需壓力時, 骨髓干細胞轉變?yōu)槌晒羌毎蜕L調節(jié)骨細胞, 細胞還分泌完成后續(xù)功能所需所有蛋白質. 經過4 周培養(yǎng), 研究人員最終獲得了由骨質結構相互交織的微型圓柱體, 隨后被更成熟的骨組織替代. 利用這種工具, 研究人員可以在分子水平研究成骨過程中可能出現的問題.

圖6 hBMSCs 分化為成骨細胞和骨細胞Fig.6 Differentiation of hBMSCs into osteoblasts and osteocytes

Park 等[18]使用仿骨小梁脫礦質骨質構建骨小梁類器官研究局部骨改建, 采用脫礦質皮質骨薄片復制了未礦化的骨細胞外基質(extracellular matrix, ECM). 這種生物材料被命名為脫礦質骨粉(demineralized bone powder, DBP). DBP 機械耐用、半透明, 并且具有可控的厚度和表面積. 他們研究了DBP 是否能夠誘導成骨細胞形成礦化骨組織并獲得骨襯細胞表型, 共培養(yǎng)原代鼠成骨細胞和單核巨噬細胞, 使用細胞因子刺激來重現骨重塑周期, 實現了DBP 表面同時含有活性和靜息狀態(tài)成骨細胞, 最后對細胞活動進行了定量空間映射以研究如何調節(jié)局部骨重塑活動. 結果顯示, DBP 能夠誘導成骨細胞發(fā)生快速結構性礦化, 成骨細胞有效轉化為內襯細胞. 當加入激活骨改建的刺激后, 成骨細胞分泌RANKL, 添加的單核/巨噬細胞成功分化為破骨細胞進行骨吸收. 該模型有效地模擬了體內骨改建, 有助于研究調節(jié)因子時空分布在局部骨改建中的作用(見圖7). 圖7(a) 模擬了骨重塑周期順序. 由圖7(b) 可知, D3 和PGE2 刺激DBP 上的骨襯細胞導致RANKL/OPG 分泌比暫時增加. 熒光圖像(見圖7(c))顯示, 激活的成骨細胞(osteoblas, OB) (綠色) 誘導單核巨噬細胞(紅色) 分化為破骨細胞(osteoclast, OC). 圖7(d) 證實破骨細胞可吸收礦物質. 由圖7(e) 可知, 在DBP 和TCP 上,受刺激的OB 遷移速度比未受刺激的OB 快2 倍. 由圖7(f) 可知, DBP 和TCP 上單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中OC 遷移. 在DBP 上, OC 經歷細胞分裂和細胞融合(見圖7(g)). 在TCP 上, OB很容易被大型多核OC 推動, 而在DBP 上OB 保持原位(見圖7(h)). 在TCP 上, OC 反復進行細胞融合, 直到細胞變得巨大并經歷細胞凋亡. 細胞凋亡后, OC 的大肌動蛋白環(huán)結構阻止相鄰OB 遷移(見圖7(i)). 圖7(j) 為OB 堿性磷酸酶(ALP) 染色和定量比較. 圖7(k) 為多核OC 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 染色和定量比較(?p<0.05,??p<0.01, ns, 不顯著).

圖7 構建骨類器官模擬骨改建中骨形成/骨吸收Fig.7 Construction of bone organoids structures simulating bone formation/resorption in bone remodeling

(2) 間接構建法. 軟骨內成骨是大多數骨組織(包括四肢骨、軀干骨及顱底骨等) 發(fā)育和再生的主要機制. 另外一種骨類器官構建策略為先誘導干細胞形成軟骨, 軟骨再發(fā)生礦化形成骨組織. 為了模擬自然愈合和體內骨再生過程, 有人提出了“發(fā)育工程(developmental engineering)” 的概念, 即通過模擬軟骨內成骨過程中的關鍵發(fā)育事件來促進有效骨組織再生.在軟骨內成骨過程中, 間充質干細胞在缺損部位聚集, 分化形成“骨痂(callus)” 軟骨核心, 隨后骨痂內軟骨細胞發(fā)生肥大、鈣化和凋亡, 成骨祖細胞募集并向成骨方向分化.

在骨軟骨組織工程中, 小鼠多能誘導干細胞iPSC(miPSCs) 可以通過轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGFβ) 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphological protein 2,BMP2) 誘導軟骨形成和向成骨譜系特異性分化. O’Connor 等[19]報道了一種通過iPSC培養(yǎng)骨軟骨類器官的方法. 研究人員從小鼠誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC) 中開發(fā)了一種骨軟骨類器官. 將iPSC 時間依賴性連續(xù)暴露于生長因子(TGFβ3、BMP2), 通過軟骨內骨化反映構建效果. 培養(yǎng)獲得包括軟骨區(qū)域和鈣化骨區(qū)域骨類器官,該類器官可以模擬骨關節(jié)炎特點, 進行關節(jié)疾病藥物篩選和遺傳風險評估.

Nilsson 等[20]提出了一種應用人骨膜衍生細胞(human periosteum-derived cell, hPDC)自組裝構建骨痂類器官的方法(見圖8). 圖8(a) 為從細胞聚集、凝聚和分化開始的示意圖.圖8(b) 為隨時間推移微球體的投影面積(87～400 個微球體, 10～90 百分位數). 圖8(c) 表示隨時間微球體代表性明場圖像. 圖8(d) 表示隨時間DAPI (核) 和鬼筆環(huán)肽(F-肌動蛋白) 染色共焦圖像代表性3D 渲染. 圖8(e) 表示微球體DNA 定量. 圖8(f) 表示活(綠色)/死(紅色) 染色. 圖8(g) 表示微球體中細胞增殖半定量. 圖8(h) 表示隨時間微球體中增殖細胞代表性熒光圖像, 其中藍色代表細胞核. hPDC 長期培養(yǎng)遵循軟骨內骨化的早期模式, hPDC 自組裝獲得軟骨微球體, 隨后發(fā)生骨化. 該類器官還可以融合為更大組織, 用來治療較大范圍骨缺損. 由于在骨折愈合過程中形成“軟骨痂” 的大多數細胞都來自骨膜, 因此hPDCs 在長骨缺損的再生中有很大的應用前景. 此外該研究表明, 與骨髓間充質干細胞相比, hPDC 能夠提高骨再生能力. hPDCs 可自組裝, 在植入時形成骨微器官, 基因表達模式與胚胎生長板和骨折愈合過程相似. 多個骨痂類器官組合可形成大骨器官, 有效促進大段骨缺損小鼠骨缺損修復.

圖8 人骨膜衍生細胞自組裝構建骨痂類器官Fig.8 Self-assembly of hPDC to construct bone callus organoids

浙江大學Xie 等[23]報道了體外高效構建骨痂類器官用于大段骨缺損修復. 研究團隊通過數字光處理(digital light processing, DLP) 打印技術, 實現了負載有BMSC 的水凝膠微球的高效生產和BMSC 在微球中的聚集. 在軟骨誘導培養(yǎng)基中誘導分化3 周后, 構建出與發(fā)育過程中相似的骨痂類器官(osteo-callus organoids). 研究者發(fā)現體外逐漸成熟過程中骨愈傷組織類器官的表型基因表達模式與天然軟骨內骨化類似. 此外, 將骨-愈傷組織類器官植入體內后發(fā)現其具備高效的異位骨形成和原位骨再生能力, 有助于大段骨缺損4 周內快速原位骨再生,以往類似缺損修復通常需要3 個月.

以上2 種生物構建策略存在周期長、成本高、重復性差等缺陷. 浙江大學Zhao 等[27]發(fā)明了一種新型的氣流輔助3D 生物打印方法, 并成功構建多細胞骨類器官. 通過氣流輔助3D 生物打印方法, 研究團隊成功構建多細胞骨類器官. 該研究以水凝膠微球體為培養(yǎng)載體, 分別植入骨髓間充質干細胞和人臍帶靜脈內皮細胞進行成骨及成血管誘導. 培養(yǎng)10 d 后, 可以觀察到明顯血管化的骨組織. 與常規(guī)生物制造方法不同, 該研究首次利用數學建模及機械手段, 實現了細胞空間結構的可控成型, 為構建骨類器官提供了新思路.

2.2.2 軟骨類器官

目前, 軟骨類器官的構建有2 種方法: 消化獲得軟骨細胞和誘導干細胞分化為軟骨細胞.

(1) 消化獲得軟骨細胞. Abraham 等[21]從兒童捐獻者獲得骨及軟骨組織, 酶解獲得細胞后分別進行骨及軟骨類器官構建. 為了更好模擬關節(jié)發(fā)育及疾病狀態(tài), 該團隊還將同時含有骨和軟骨成分的肋骨消化獲得的細胞進行骨-軟骨誘導分化, 最終獲得含有骨和軟骨組織的迷你關節(jié)球. 該模型成功模擬關節(jié)炎癥, 能夠對藥物療效進行評價.

(2) 誘導干細胞分化為軟骨細胞. Tam 等[22]研究了人多能干細胞的體外和體內軟骨和骨組織形成能力(見圖9). 誘導的多能干細胞可定向分化為軟骨細胞, 隨后自組裝成軟骨類器官.分化形成的軟骨細胞表達與原代人關節(jié)軟骨細胞相似水平的Ⅱ型膠原蛋白, 并在體內異位植入時產生穩(wěn)定軟骨. 在針對性地促肥大和促炎介質啟動后, 類器官成功橋接了免疫功能低下小鼠的臨界尺寸長骨缺損.

圖9 人多能干細胞衍生的軟骨類器官促進長骨缺損無支架愈合Fig.9 Human pluripotent stem cell-derived cartilage organoids promote scaffold-free healing of long bone defects

2.3 應用前景

骨/軟骨類器官基于3D 體外細胞培養(yǎng)系統建立, 與體內骨/軟骨結構高度相似, 可以復制出骨/軟骨的復雜空間形態(tài)和功能, 表現出細胞與細胞之間、細胞與基質之間相互作用和空間位置形態(tài), 與體內骨/軟骨具有相似生理反應. 基于以上優(yōu)勢, 骨/軟骨類器官能夠在發(fā)育生物學、生物樣本庫、藥物篩選、精準醫(yī)療、再生醫(yī)學、疾病建模等領域有效彌補傳統骨組織工程的不足, 在骨/軟骨再生修復研究中具有巨大潛力(見圖10).

圖10 骨/軟骨類器官的轉化應用場景Fig.10 Translational application scenarios of bone/cartilage organoids

首先, 骨/軟骨類器官能夠模擬體內代謝和再生修復過程, 有助于闡明骨/軟骨在各種生理病理狀態(tài)下再生修復機制. Park 等[18]構建的骨類器官模型可以模擬體內骨改建這一復雜過程. 在此基礎上, 構建病理條件下骨類器官, 模擬骨微環(huán)境特點, 在體外可直觀研究疾病狀態(tài)下骨改建規(guī)律. 在骨類器官上制作骨折、缺損模型, 可動態(tài)連續(xù)研究骨類器官缺損修復機制.其次, 骨/軟骨類器官能夠用于材料和藥物快速篩選. 傳統骨組織工程材料支架、種子細胞和生長因子的篩選主要依賴體內研究評價, 周期長、干擾多、成本高. 通過骨類器官可實現體外高通量快速篩選骨組織工程所需材料, 有效避免盲目設計與測試, 節(jié)約大量時間和資源. 最后,骨/軟骨類器官本身可直接用于骨/軟骨組織修復再生, 其研究目標是實現大尺度宏觀骨/軟骨類器官的制備, 可直接用于骨/軟骨缺損原位修復.

3 總結與展望

骨/軟骨在人體生理活動中發(fā)揮重要功能. 骨/軟骨疾病種類多、起病慢、病程長、危害大,現在尚缺乏有效治療手段. 由于缺乏簡單高效的研究模型, 目前骨/軟骨疾病研究仍有大量問題尚不明確, 如骨/軟骨干細胞的鑒定和分離方法、骨/軟骨微環(huán)境結構和細胞成分的解析等.骨/軟骨類器官的構建和應用為臨床解決上述問題提供了新的研究工具和技術, 其以較小成本和簡單方式仿生骨/軟骨的結構和生理功能, 在特定條件下能夠模擬疾病發(fā)生過程, 復制病理特點, 高效用于骨/軟骨發(fā)病機制和再生修復的研究.

展望未來, 骨/軟骨類器官研究前景巨大. 該技術作為一種新型工具, 在骨/軟骨基礎研究和臨床治療中具有廣泛的應用前景, 有望被應用在精準醫(yī)學、藥物毒性和療效、生物學、疾病病理學、細胞生物學等領域.這項技術也為再生醫(yī)學提供了巨大的潛力, 通過用骨/軟骨類器官培養(yǎng)物替換受損或患病的骨/軟骨組織, 可突破傳統骨組織工程修復極限. 與此同時, 骨/軟骨類器官有望為再生醫(yī)學研究創(chuàng)造出更多的新成果. 將活體實時成像技術應用在骨/軟骨類器官中, 將首次實現人體骨/軟骨組織發(fā)育進程的實時觀察; 將骨/軟骨類器官與生物3D 打印結合,將實現骨/軟骨組織損傷的空間特征化功能修復; 將骨/軟骨類器官與“人類細胞圖譜(human cell atlas, HCA)” 技術結合, 骨/軟骨類器官細胞圖譜將能加速多種骨/軟骨相關罕見病等的治療進程.

綜上所述, 骨/軟骨類器官研究意義重大, 應用前景廣泛, 但目前尚處于起步階段, 需要解決包括細胞外基質材料、干細胞種類、來源及誘導條件等諸多問題, 方能將骨/軟骨類器官真正推向臨床應用, 造福廣大患者.