毛亞浩 丁靜怡 余君 陳雄 王志 楊春雷 姚蘭

摘要 為降低茄芯煙葉中木質(zhì)素含量、改善煙葉品質(zhì)，從煙葉提取液中篩選出一株具有木質(zhì)素降解能力的菌株，鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。其中木質(zhì)素過氧化物酶活性達到19.03 U/L，錳過氧化物酶活性達到4.35 U/L。使用該菌株進行茄芯煙葉發(fā)酵，通過單因素試驗及中心組合響應面法優(yōu)化，得到最佳工藝條件：接種量7%、發(fā)酵溫度37 ℃、起始含水量25%、發(fā)酵時間6 d。在此最佳條件下，茄芯煙葉木質(zhì)素降解率達到23.02%，且發(fā)酵后中性香氣總量較發(fā)酵前提高了30.22%。

關鍵詞 巨大芽孢桿菌；茄芯煙葉；木質(zhì)素降解酶；響應面試驗；中性香氣

中圖分類號 Q815? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）10-0010-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.10.003

Abstract In order to reduce the lignin content in filler tobacco leaves and improve the quality of tobacco leaves， a strain with lignindegrading ability was screened from tobacco leaf extract and identified as Bacillus megaterium. Among them， the enzymatic activity of lignin peroxidase reached 19.03 U/L， and the enzymatic activity of manganese peroxidase reached 4.35 U/L. The strain was used to ferment cigar tobacco leaves， and the optimal process conditions were obtained through single factor experiment and central combined response surface methodology optimization： the inoculum size was 7%， the fermentation temperature was 37 ℃， the initial water content was 25%， and the fermentation time was 6 d. Under this optimal condition， the degradation rate of lignin in cigar tobacco leaves reached 23.02%， and the total amount of neutral aroma after fermentation was increased by 30.22% compared with that before fermentation.

Key words Bacillus megaterium;Cigar filler leaves;Lignin degrading enzyme;Response surface experiment;Neutral aroma

木質(zhì)素是煙草細胞壁的重要組成部分［1-2］，在煙葉中的含量為7%～9%。木質(zhì)素也是一種苯基丙烷類生物大分子，它通過氫鍵和共價鍵與纖維素和半纖維素緊密結合，共同形成了細胞壁致密的網(wǎng)狀結構［3］。木質(zhì)素結構復雜，具有一定的機械強度，難以降解［2］。細胞壁物質(zhì)對雪茄煙的抽吸口感以及品質(zhì)影響相當大，在雪茄點燃抽吸過程中木質(zhì)素由于熱解會產(chǎn)生兒茶酚、烷基兒茶酚等產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會引起澀口，并且有致癌風險［3］。因此，降低煙葉中木質(zhì)素含量，對改善雪茄品質(zhì)至關重要。

研究表明木質(zhì)素降解常用的方法包括微生物降解、外源添加酶制劑降解［4］。但由于木質(zhì)素致密的網(wǎng)狀結構導致外源酶制劑在處理煙葉時很難通過細胞壁，這就給酶法降解煙葉中的木質(zhì)素帶來了一定的難度［3］。相對于酶法降解木質(zhì)素，改善煙葉品質(zhì)，微生物處理更高效［5］。截至目前，發(fā)現(xiàn)的能降解木質(zhì)素的菌株主要是真菌、細菌、放線菌等。相對于真菌，細菌更容易培養(yǎng)，且來源廣泛。因此，細菌更適應煙葉發(fā)酵的環(huán)境［6-7］。另外，煙葉中低糖、高尼古丁的環(huán)境也決定了真菌在煙葉中很難存活，近年來對于木質(zhì)素降解的研究也大多是細菌［2］。如李靈靈等［8］從土壤中篩選出一株變色栓菌，該菌可降解水稻秸稈中35%的木質(zhì)素；Xu等［9］研究了細菌對木質(zhì)素的解聚和利用，發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌可降解堆肥土壤中的木質(zhì)素。但是，目前木質(zhì)素降解菌在雪茄煙葉發(fā)酵中的應用鮮見報道。

該研究從煙葉提取液中篩選得到一株不僅可以產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的巨大芽孢桿菌，還可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶。將該菌應用于雪茄煙葉的發(fā)酵，探究該菌株對雪茄煙葉發(fā)酵后的木質(zhì)素降解率、香氣成分含量的影響，為工業(yè)生產(chǎn)中提高雪茄煙葉發(fā)酵品質(zhì)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙葉來自湖北恩施州晾制結束的CX-014雪茄茄芯煙葉。

煙葉提取液來自湖北省煙草科學研究院。

初篩培養(yǎng)基：堿性木質(zhì)素2 g/L、硫酸銨1.33 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、磷酸氫二鈉0.2 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB-苯胺藍培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、苯胺藍0.1 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

亮藍-BM培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、亮藍0.1 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

堿性木質(zhì)素培養(yǎng)基：堿性木質(zhì)素2 g/L、硫酸銨1.33 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、磷酸氫二鈉0.2 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖4 g/L、堿性木質(zhì)素2 g/L、硫酸銨1.33 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、磷酸氫二鈉0.2 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 木質(zhì)素降解菌株的篩選。

1.2.1.1

初篩。取煙葉提取液5 mL，在無菌條件下，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5的稀釋液各100 μL涂布到初篩培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選生長良好、形態(tài)差異明顯的菌落反復劃線進行分離純化，挑取純化后的單菌落經(jīng)液體培養(yǎng)富集，然后使用終濃度為25%的甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.1.2

復篩。將初篩得到的單菌落接種于LB-苯胺藍培養(yǎng)基和亮藍-BM培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，觀察菌落周圍顏色變化，以平板中菌落周圍是否有脫色圈來定性檢測與木質(zhì)素降解有關的木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，Lip）、錳過氧化物酶（manganese peroxidase，Mnp）、漆酶（laccase，Lac）。其中苯胺藍的脫色與木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶有關［10］，漆酶與亮藍的脫色有關［10］。

1.2.2 菌株的鑒定。

將待測菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，收集菌體，使用細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN DP302）提取細菌DNA。以該DNA為模板，使用引物27F/1492R 進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳驗證后將PCR產(chǎn)物送至武漢昆泰銳生物技術有限公司測序，將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，且用Mega 11.0.8軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷該菌株的屬別。

1.2.3 木質(zhì)素降解酶活性的測定。

根據(jù)Niladevi等［11-12］的方法測定漆酶活性。

根據(jù)Tien等［13］的方法測定木質(zhì)素過氧化物酶活性。

根據(jù)Kapich等［14-15］的方法測定錳過氧化物酶活性。

1.2.4 雪茄煙葉發(fā)酵。

1.2.4.1 雪茄煙葉固態(tài)發(fā)酵。

參照覃明娟等［16］的方法并進行適當?shù)恼{(diào)整。將供試煙葉進行切絲，寬度為2 mm左右，稱取30 g于250 mL三角瓶中，將篩選得到的木質(zhì)素降解菌經(jīng)LB培養(yǎng)基活化后接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（按煙絲重量確定接種量），離心取菌體，加入等體積的無菌水進行重懸，得到重懸液，將重懸液與營養(yǎng)液（按煙絲重量添加1%谷氨酸、2%葡萄糖）混合后，均勻地噴灑在煙絲上，平衡水分，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d，保持恒溫恒濕箱溫度一定，濕度為80%，發(fā)酵結束后75 ℃烘干煙絲，過40目孔徑篩。

1.2.4.2 響應面優(yōu)化。

以接種量、發(fā)酵溫度、起始含水量為考察因素，設計3因素3水平的中心組合試驗，以木質(zhì)素降解率為響應值，得到降解煙葉中木質(zhì)素的最佳試驗方案。

1.2.4.3 煙絲中木質(zhì)素含量的測定。

采用克拉森木素法［17］，將發(fā)酵后的煙絲75 ℃烘干，粉碎后過40目孔徑篩，稱取2 g粉末于索氏抽提裝置中，用苯醇抽提至液體為無色，將抽提好的樣品于105 ℃烘至絕干，取0.3 g于小燒杯中，準確加入濃度為72%的硫酸3 mL，充分潤濕混勻，30 ℃水浴2 h，15 min 攪拌一次，將反應后的樣品用84 mL蒸餾水洗滌轉移到100 mL無菌瓶中，123 ℃蒸煮1 h后，冷卻至室溫，抽濾并將固體木質(zhì)素pH洗至中性，105 ℃烘至恒重，稱量烘干后的樣品重量。

1.2.4.4 蒸餾萃取（SDE）-氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）測定煙草致香物質(zhì)成分。

參考Yao等［18］的方法測定煙草中致香物質(zhì)成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設置3個平行，采用Origin 2019作圖、Mega 11.0.8構建系統(tǒng)發(fā)育樹、Design expert 10進行響應面分析、TBtools軟件進行熱圖繪制。

2 結果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌株的篩選和鑒定

從煙葉提取液中篩選得到一株具有木質(zhì)素降解能力的菌株，將得到菌株命名為m1。隨后，經(jīng)LB-苯胺藍培養(yǎng)基和亮藍-BM培養(yǎng)基復篩，如圖1所示，發(fā)現(xiàn)該菌在LB-苯胺藍培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生明顯的脫色圈，而在亮藍-BM培養(yǎng)基中無脫色圈。說明該菌株具有產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶的能力，而無產(chǎn)漆酶能力。

為進一步確定該菌株的屬別對該菌株進行16S rDNA測序，將測序得到的序列在NCBI上進行比對，選取結果中相似度較高的菌株作為參考菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。由圖2可知，菌株m1的16S rDNA的基因序列與芽孢桿菌屬中的巨大芽孢桿菌相似度最高，為100%，初步確定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），命名為Bacillus megaterium m1。

2.2 木質(zhì)素降解酶活性的檢測

為進一步驗證Bacillus megaterium m1產(chǎn)酶能力，該研究使用產(chǎn)酶培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)，檢測木質(zhì)素降解酶的活性。Bacillus megaterium m1分泌3種酶的活性見圖3，結果表明B.megaterium m1具有較強的產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）的能力，24 h時該酶的活性達到19.03 U/L。但該菌株分泌錳過氧化物酶（Mnp）的能力較弱，培養(yǎng)24 h時該酶的活性僅有4.35 U/L。整個過程中基本沒有檢測到漆酶（Lac）活性。

木質(zhì)素降解是一個復雜的過程，能夠降解木質(zhì)素的微生物并不都能產(chǎn)與木質(zhì)素降解有關的3種酶［19］。該研究結果與前人的研究結果一致，如鮑文英等［20］研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素降解酶中的漆酶大多數(shù)都是在霉菌中被發(fā)現(xiàn)，細菌產(chǎn)漆酶的報道相對較少；Wang等［21］研究巨大芽孢桿菌降解木質(zhì)素發(fā)現(xiàn)該菌不具備產(chǎn)漆酶的能力；于少藤等［22］從煙葉中篩選得到一株降解木質(zhì)素的蓋氏假單胞菌，未優(yōu)化前的Lip活性可以達到20 U/L，Mnp活性達到10 U/L，沒有檢測到Lac活性。

2.3 優(yōu)化巨大芽孢桿菌發(fā)酵工藝

以煙葉中木質(zhì)素的降解率為響應值，以接種量、發(fā)酵溫度、起始含水量為考察因素，設計3因素3水平試驗，試驗設計以及結果見表1。從表1可以看出，方案2是所有方案中木質(zhì)素降解率最高的，其木質(zhì)素降解率達到了23.02%，發(fā)酵條件為接種量7%、發(fā)酵溫度37 ℃、起始含水量25%。

從響應面擬合回歸方程的方差分析（表2）可以看出，3個主效應對木質(zhì)素降解率的影響從大到小依次為C>B>A，即起始含水量＞發(fā)酵溫度＞接種量，該模型的決定系數(shù)（R2）為0.990 6，失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型中因變量與考察的自變量之間線性關系顯著。接種量、發(fā)酵溫度、起始含水量3個主因素均顯著（P＜0.05）。在3個主因素之間的交互作用中，接種量與發(fā)酵溫度的交互作用對煙葉中木質(zhì)素降解率具有顯著影響（P<0.05），起始含水量與發(fā)酵溫度的交互作用、接種量與起始含水量的交互作用均對煙葉中木質(zhì)素降解率影響不顯著（P＞0.05）。不同因素間交互作用對煙葉木質(zhì)素降解率影響見圖4，曲面彎曲程度越大，表明影響越顯著。

2.4 Bacillus megaterium m1對雪茄煙葉中性香氣物質(zhì)的影響

香氣是評價發(fā)酵后雪茄煙葉質(zhì)量的重要標準之一。煙葉香氣成分包括中性香氣成分、酸性香氣成分和堿性香氣成分，其中中性香氣成分種類最多，對煙葉的香氣質(zhì)和香氣量、香味類型影響最大［23］。煙葉中主要的中性致香物質(zhì)成分是由前體物轉化或反應得來的，根據(jù)前體物的來源可以把雪茄煙葉中的致香成分劃分為葉綠素轉化產(chǎn)物、苯丙氨酸轉化產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物、類胡蘿卜素轉化產(chǎn)物、西伯烷類轉化產(chǎn)物［24］。

由于煙葉中還原糖可與氨基化合物發(fā)生美拉德反應，從而影響煙草的香氣品質(zhì)［25］。研究表明葡萄糖與谷氨酸反應可產(chǎn)生木香［26］。張鵬等［27］研究添加不同的外源氨基酸與糖類對煙草薄片的影響發(fā)現(xiàn)，美拉德反應可以有效改善煙草薄片的質(zhì)量。Yao等［18］ 在雪茄煙葉中添加纖維素降解菌和營養(yǎng)液（谷氨酸、葡萄糖）發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)中性香氣物質(zhì)總量有顯著提高。因此，為了確定發(fā)酵后增加的香氣物質(zhì)主要是來源于營養(yǎng)液還是B.megaterium m1的代謝，或者是兩者共同作用的結果，在響應面最佳因素水平下分別做了3組對照試驗：無菌水處理、營養(yǎng)液處理、B.megaterium m1加無菌水處理，與試驗組（B.megaterium m1加營養(yǎng)液）進行比較。

對不同處理下的煙葉進行GC-MS香氣分析，共檢測出24種中性致香成分，其中葉綠素轉化產(chǎn)物1種（新植二烯），類胡蘿卜素轉化產(chǎn)物8種（BETA-環(huán)檸檬醛、β-紫羅蘭酮、4-氧代異佛爾酮、香葉基丙酮、巨豆三烯酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-5-庚烯-2-醇、法尼基丙酮），苯丙氨酸轉化產(chǎn)物3種（苯甲醇、苯甲醛、苯乙醇），美拉德反應產(chǎn)物3種（糠醇、糖醛、3-乙酰基吡啶），西伯烷類轉化產(chǎn)物1種（茄酮），其他類別的香氣物質(zhì)8種。從表4可以看出，相比于發(fā)酵前的煙葉（處理①），其他4個處理下煙葉香氣總量均提高。在響應面最佳工藝條件（處理⑤）下，雪茄煙葉中性香氣物質(zhì)總量相比發(fā)酵前提高了30.22%。

菌落在其自身的生長發(fā)育過程中會利用煙葉中的某些物質(zhì)作為營養(yǎng)成分，同時在這個過程中會分泌多種胞外酶，來降解煙葉中的木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)，從而引起煙葉中性致香成分的變化［28-29］。從表4可以看出，處理③（添加營養(yǎng)液）中糠醇、苯乙醇含量最高，分別達3.11、6.51 μg/g，相比于處理②（無菌水）分別提高了11.07%、14.81%。其中糠醇為美拉德反應產(chǎn)物，具有焦糖香；苯乙醇為苯丙氨酸代謝產(chǎn)物，具有花香［18，30］。這可能是由于在添加營養(yǎng)液的條件下，營養(yǎng)液中葡萄糖和氨基酸在一定條件下會發(fā)生美拉德反應，從而導致美拉德反應產(chǎn)物含量增加，而且添加營養(yǎng)液也有助于煙葉中原有微生物的生長代謝，也會在一定程度上促進煙葉的發(fā)酵，導致煙葉中部分中性香氣物質(zhì)含量增加［18，31］。

在處理④（B.megaterium m1加無菌水）中，4-氧代異佛爾酮、香葉基丙酮含量最高，分別達3.20、3.96 μg/g，其中4-氧代異佛爾酮約是處理②（無菌水）的2.7倍，香葉基丙酮含量相比于處理②提高了65.69%。4-氧代異佛爾酮、香葉基丙酮是煙葉中類胡蘿卜素轉化產(chǎn)物，具有木香和花香［18，30］。這說明加入B.megaterium m1可能會促進煙葉的發(fā)酵過程，而煙葉經(jīng)發(fā)酵徹底后，95%的類胡蘿卜素都能降解，因此類胡蘿卜素轉化產(chǎn)物含量增加［32］。

在處理⑤（B.megaterium m1加營養(yǎng)液）中，新植二烯、巨豆三烯酮、3-乙?；拎ず孔罡?，分別達536.16、30.54、2.81 μg/g。新植二烯、巨豆三烯酮相比于處理②（無菌水）分別提高了10.22%、65.89%，3-乙?；拎ぜs是處理②的2.3倍。新植二烯是煙葉中葉綠素轉化產(chǎn)物，也是煙葉中性香氣中最為豐富的成分，其本身具有清香氣，而且具有降低煙的刺激性和增加香氣的作用［18，30］；巨豆三烯酮是煙葉中類胡蘿卜素轉化產(chǎn)物，具有清香和煙草香［18，30］；3-乙?；拎な菬熑~中美拉德反應產(chǎn)物，具有堅果香［18，30］。這說明在添加營養(yǎng)液的條件下，可能更有助于B.megaterium m1的生長和代謝，促進了B.megaterium m1對煙葉中葉綠素、類胡蘿卜素、淀粉、蛋白質(zhì)等大分子前體物質(zhì)的利用，從而導致這些重要中性香氣物質(zhì)含量的增加［29］。

圖5為雪茄煙葉中性香氣物質(zhì)熱圖，從圖5可以看出，處理⑤（B.megaterium m1加營養(yǎng)液）中3-乙酰基吡啶、植酮、苯甲醇、法尼基丙酮、巨豆三烯酮等含量相比于其他處理較高，而處理④（B.megaterium m1加無菌水）中4-氧代異佛爾酮、Α，2，6，6-四甲基-1-環(huán)己烯-1-巴豆醛含量相比于其他處理較高。說明加入B.megaterium m1發(fā)酵后對于煙葉中性香氣的改善發(fā)揮著重要的作用。

3 結論與討論

該研究利用從煙葉提取液中篩選到一株具有降解木質(zhì)素能力的菌株Bacillus megaterium m1，將其與營養(yǎng)液協(xié)同添加到雪茄煙葉發(fā)酵中，主要考察了發(fā)酵溫度、接種量、起始含水量對煙葉木質(zhì)素降解的影響。通過響應面優(yōu)化得到了最佳的發(fā)酵工藝條件：接種量7%、發(fā)酵溫度37 ℃、起始含水量25%，發(fā)酵過程中影響木質(zhì)素降解率因素順序為起始含水量＞發(fā)酵溫度＞接種量，其中煙葉起始含水量是影響煙葉木質(zhì)素降解的最主要因素，隨著煙葉含水量的變化，煙葉中木質(zhì)素的降解也存在差異。這可能是由于煙葉中的微生物需要一定的水分來滿足自身生長，在合適的水分和營養(yǎng)物質(zhì)下，微生物才會生長并產(chǎn)生一些酶來降解煙葉中的木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)［29］。

香氣是評價煙葉發(fā)酵的重要指標之一［23］。與發(fā)酵后的煙葉相比，發(fā)酵前的煙葉具有刺激性、雜氣大、香氣不突出的特點［33］。該研究利用響應面來優(yōu)化煙葉中大分子物質(zhì)木質(zhì)素的降解，在得到的最佳工藝條件下進行煙葉發(fā)酵，通過香氣分析發(fā)現(xiàn)，中性香氣總量與發(fā)酵前相比明顯提高，煙葉中重要香氣物質(zhì)3-乙酰基吡啶、植酮、苯甲醇、法尼基丙酮、巨豆三烯酮等含量增加，香氣更加突出。說明在此工藝條件下加入B.megaterium m1能夠改善雪茄煙的香氣品質(zhì)。但該研究的發(fā)酵機制還需進一步探索，優(yōu)化發(fā)酵的條件也有待于進一步完善，以期為雪茄煙的工業(yè)發(fā)酵應用提供參考。

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