田迪 陳志云 吳沖 宋羚 趙英良 桂明英 馬嘯

摘 要：目的：探究腎癌細(xì)胞 ACHN 經(jīng)不同濃度茶皂素（TS）組處理后，對(duì)細(xì)胞凋亡及遷移的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法：以腎癌細(xì)胞ACHN為研究對(duì)象，在二甲基噻唑藍(lán)比色法（MTT）細(xì)胞活性測定后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，分別用0、10、20、30 mg/L濃度的茶皂素處理細(xì)胞24 h。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法（HE）、DAPI染色法（DAPI）觀察不同茶皂素處理濃度時(shí)腎癌細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及凋亡情況。劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度茶皂素處理情況下細(xì)胞的遷移狀況，蛋白免疫印跡法對(duì)調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白，如Bax、Bcl-2、核轉(zhuǎn)錄因子-кB（NF-кB P53）、Caspase-9等與對(duì)細(xì)胞遷移有影響的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白進(jìn)行印跡分析。結(jié)果：在一定范圍內(nèi)，隨著茶皂素處理濃度的增加腎癌細(xì)胞ACHN凋亡程度逐漸增大，對(duì)其遷移能力的抑制逐漸增加，對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用的Bax、P53、Caspase-9等蛋白的表達(dá)與無茶皂素處理組相比有增加趨勢，而對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用的蛋白Bcl-2表達(dá)則呈降低的趨勢，促進(jìn)細(xì)胞遷移的MMP-2蛋白表達(dá)也受到抑制。結(jié)論：茶皂素在腎癌治療方面具有一定的潛在價(jià)值。

關(guān)鍵詞：茶皂素；腎癌細(xì)胞；細(xì)胞活性；凋亡；機(jī)制

腎細(xì)胞癌又稱腎癌，主要起源于腎小管上皮細(xì)胞，屬于惡性腫瘤的一種，多發(fā)生于泌尿系統(tǒng)中，是成人腎臟中最常見的一種惡性疾病，且男性發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性[1-4]。近年來，全球腎癌患者的數(shù)量以每年30萬人的速度持續(xù)上漲[5]。目前，腎癌的主要治療方法為手術(shù)切除和傳統(tǒng)藥物治療[6]。盡管手術(shù)治療效果較好，但是手術(shù)治療也存在著復(fù)發(fā)率較高和早期轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[7]，而以白介素和干擾素為代表的傳統(tǒng)免疫治療在腎癌的治療過程中不僅效率低而且還存在著較大的副作用[8]，并且腎癌細(xì)胞對(duì)這些傳統(tǒng)藥物具有一定的耐藥性。因此，研發(fā)出一種能更加有效抑制腎癌細(xì)胞增殖與遷移并且安全性較高、耐藥性小的藥物具有重要的意義。茶皂素又稱茶皂甙，是茶葉的主要活性成分之一，屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷的混合物，主要存在于茶樹的種子中，除此之外在茶樹的根、莖、葉和花中也有分布[9]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素具有多種藥理活性，如抗炎、抑菌、降血脂、抗氧化和抗癌等[10-12]，但目前有關(guān)茶皂素對(duì)癌癥治療方面的研究報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素可通過抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Bax蛋白表達(dá)，并活化Caspase-3蛋白的活性來誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠肝瘤癌細(xì)胞凋亡[13]。因此，推測茶皂素對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞的增殖與遷移也具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)通過研究茶皂素對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN凋亡與遷移的作用，通過細(xì)胞遷移、DAPI細(xì)胞核染色、對(duì)凋亡蛋白進(jìn)行檢測等試驗(yàn)，初步明確茶皂素對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN增殖與遷移抑制的作用機(jī)制，為茶皂素對(duì)腎癌的抑制方面研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶皂素，購自北京索萊寶科技有限公司；人腎癌細(xì)胞株ACHN，購自中科院昆明細(xì)胞庫；MTT、DAPI，均購自Sigma公司；DMEM高塘培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青鏈霉素，購自美國Hyclone公司；Bax、Bcl-2、MMP-2、P53、Caspase-9、β-Tubulin等抗體，購自美國CST公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；北京六一電泳儀；Thermo Fisher倒置顯微鏡；盧湘儀自動(dòng)平衡離心機(jī)；低溫高速離心機(jī)；Thermo Fisher高端酶標(biāo)儀；蛋白熒光成像系統(tǒng)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將腎癌ACHN細(xì)胞株按1×106個(gè)細(xì)胞/板的密度培養(yǎng)在100 mm直徑培養(yǎng)皿中，在含10%牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中保持生長，保持培養(yǎng)箱中含5%CO2，溫度維持在37 ℃。當(dāng)細(xì)胞生長到鋪滿培養(yǎng)皿底的90%～95%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.4 MTT法檢測腎癌細(xì)胞ACHN的存活率

將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，分別為對(duì)照組和茶皂素處理組，茶皂素處理組濃度梯度為0、10、30、60、100 mg/L，設(shè)6組平行，避光培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入濃度為3 mg/mL的MTT試劑20 μL，在5% CO2和37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h后，除去培養(yǎng)基，加160 μL的DMSO在搖床上混合10 min后，在酶標(biāo)儀上492 nm處測吸光度并按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=藥物處理組的OD值/對(duì)照組的OD值×100%（1）

1.5 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測腎癌細(xì)胞ACHN的遷移能力

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，采用3×105個(gè)細(xì)胞/板的密度接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，在5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí)，用200 μL的滅菌槍頭在培養(yǎng)皿內(nèi)劃一條直線，用PBS清洗兩次，洗去細(xì)胞碎渣，每皿加入4 mL的高糖培養(yǎng)基，分別用0（對(duì)照組）、10、20、30 mg/L的茶皂素處理。在5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕區(qū)遷移的相對(duì)距離并拍照，按式（2）計(jì)算細(xì)胞遷移率。每組設(shè)5個(gè)平行，取平均值。

遷移率（%）=給藥組細(xì)胞遷移面積/對(duì)照組細(xì)胞遷移面積×100%（2）

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

將細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種于事先放置爬片的12孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞均勻鋪滿爬片并貼壁生長后，加入0（對(duì)照組）、10、20、30 mg/L茶皂素處理24 h。處理結(jié)束后，用PBS清洗1次，多聚甲醛固定15 min后，將爬片放置事先滴有DAPI染液的載玻片上避光靜置25 min，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。設(shè)置3組平行。

1.7 HE染色

將細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中進(jìn)行分組培養(yǎng)，待細(xì)胞均勻鋪滿底部后加入0（對(duì)照組）、10、20、30 mg/L茶皂素處理24 h。對(duì)照組和給藥組均采用無血清培養(yǎng)，處理結(jié)束后，用冷PBS清洗2次，按照說明書加入蘇木精-伊紅染料，然后在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.8 Western blot分析

將細(xì)胞以1×106個(gè)/板的密度接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長后，加入不同濃度茶皂素處理24 h，棄去廢液，用冷PBS清洗2次，每板加入270 μL的細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液∶PMSF為100∶1）放入冰盒處理30 min后，刮下培養(yǎng)皿上的細(xì)胞及液體，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)為4 ℃，15 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行制樣，95 ℃煮樣10 min。將樣品逐一加入事先配制好的SDS-PAGE膠板中，設(shè)置電泳參數(shù)：第一階段為50 V，30 min；第二階段為120 V，70 min，隨后轉(zhuǎn)膜57 min。用5%脫脂乳粉封閉1 h后，加一抗在4 ℃冰箱過夜，然后用1xTBST洗膜3次，加二抗常溫孵育1 h，1xTBST洗膜3次，曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，采用SPSS 17.0軟件用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，蛋白印跡圖像采用Image J軟件進(jìn)行處理分析，采用GraphPad prism 5軟件作圖（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN存活率的影響

ACHN細(xì)胞經(jīng)0、10、30、60、100 mg/L的茶皂素處理24 h后，用MTT檢測細(xì)胞的存活率，如圖1所示，與對(duì)照組相比，12.5 mg/L茶皂素處理組的ACHN細(xì)胞生長受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著茶皂素濃度的增加這種抑制作用就越強(qiáng)（P＜0.001），成濃度劑量依賴性，在50 mg/L時(shí)，ACHN細(xì)胞存活率降至最低（P＜0.001）。茶皂素24 h的IC50值為25.38 mg/L。

2.2 茶皂素抑制腎癌細(xì)胞ACHN的遷移能力

為了減少茶皂素對(duì)細(xì)胞的毒副作用，分別采取0（空白對(duì)照組）、10、20、30 mg/L的茶皂素處理細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞遷移試驗(yàn)。如圖2所示，隨著茶皂素濃度的增加ACHN細(xì)胞遷移率逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明，茶皂素對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用，且遷移率呈濃度依賴性降低。

2.3 茶皂素促進(jìn)腎癌細(xì)胞ACHN的凋亡

由圖3可以觀察出，隨著茶皂素濃度的增加，細(xì)胞核的數(shù)量越來越少，表明腎癌細(xì)胞ACHN隨茶皂素濃度的遞增其凋亡的程度也逐漸增加。

2.4 HE染色結(jié)果

由圖4可以看出，加入不同濃度的茶皂素處理24 h后，隨著茶皂素濃度的增加，細(xì)胞核數(shù)量越來越少，并且細(xì)胞核體積整體出現(xiàn)增大的趨勢。

2.5 茶皂素對(duì)Bax、Bcl-2、MMP-2、Caspase-9、P53蛋白表達(dá)的影響

凋亡是抑制癌細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一，Bcl-2基因家族主要調(diào)控著細(xì)胞的凋亡，包括抑凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax等，可通過抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax基因的表達(dá)來促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[14]。而P53則是Bax上游的一個(gè)十分重要的抑癌基因，該基因編碼的蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖，在腫瘤血管的生成方面也發(fā)揮著有效的抑制作用[15]。因此，可通過激活P53基因的表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散并且促進(jìn)其凋亡。細(xì)胞凋亡途徑最終是通過激活Caspase家族成員，然后作用于基底蛋白，使其分解而引起凋亡[16]。Caspase-9作為腎癌細(xì)胞凋亡通路中的重要因子，是細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)蛋白，可激活下游的細(xì)胞凋亡因子Cappase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]，該凋亡通路可由Bax來激活[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中增加Caspase-9及其下游靶蛋白Caspase-3的蛋白表達(dá)水平，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。癌細(xì)胞除了具有無限增殖的特點(diǎn)外，還有著極強(qiáng)的侵襲和遷移功能[20]。腫瘤細(xì)胞的侵襲是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，其中細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是必需的步驟[21]。而MMP-2及其下游的MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶[22]，對(duì)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[23]，因此降低MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)可使癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到抑制，對(duì)癌癥的預(yù)防及治療具有重要的意義。與0 mg/L組對(duì)比，30、40 mg/L茶皂素處理組顯著抑制了Bcl-2、MMP-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)了Bax、P53、Caspase-9蛋白的表達(dá)。隨著茶皂素濃度的增加，Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，而Bax、P53、Caspase-9蛋白表達(dá)水平則呈增高趨勢，組間蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）。

3 結(jié)論

腎癌的發(fā)生主要是由于細(xì)胞不能正常進(jìn)行程序性死亡，進(jìn)而表現(xiàn)為細(xì)胞的無限增殖。試驗(yàn)首先檢測茶皂素對(duì)腎癌ACHN細(xì)胞活性的影響，在24 h內(nèi)，茶皂素呈濃度依賴性地抑制了腎癌ACHN細(xì)胞的活性，可初步證實(shí)茶皂素具有體外抗腎癌ACHN細(xì)胞的活性。通過western blot可得，茶皂素對(duì)P53、Bax和Caspase-9蛋白表達(dá)水平均具有促進(jìn)作用，對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)水平具有抑制作用，而細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果表明，茶皂素對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN的遷移具有抑制作用，且具有濃度依賴性。研究表明，茶皂素具有可抑制腎癌細(xì)胞ACHN的增殖和遷移的能力，能促進(jìn)腎癌ACHN細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與Bax、Bcl-2、P53、MMP-2、Caspase-9等蛋白的表達(dá)有關(guān)，為茶皂素在抑癌方面的進(jìn)一步開發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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Abstract：Objective To investigate the effects of different concentrations of cordycepin on apoptosis and migration of renal cancer ACHN cell lines and the related mechanisms.Method ACHN cells were used as the research object.After MTT cell activity was determined，the cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum and treated with 0，10，20，30 mg/L tea saponin for 24 h，respectively.He staining and DAPI staining were performed to observe the cell morphology and apoptosis of renal carcinoma cells treated with different concentrations of tea saponin.The migration status of cells treated with different concentrations of tea saponin was observed by scratch experiment.The proteins that regulate cell apoptosis，such as Bax，Bcl-2，P53，Caspase-9，and MMP-2 proteins of matrix metalloproteinase family，which have influence on cell migration，were analyzed by Western Blot.Result Within a certain range，with the increase of tea saponin treatment concentration，the apoptosis degree of ACHN in renal cancer cells gradually increased，and the inhibition of its migration ability gradually increased.Compared with the group without tea saponin treatment，the expression of Bax，P53，Caspase-9 and other proteins which can promote cell apoptosis showed an increasing trend.The expression of Bcl-2，which can inhibit cell apoptosis，was decreased，and the expression of MMP-2，which can promote cell migration，was also inhibited.Conclusion Tea saponin has potential value in the treatment of renal cancer.

Keywords：tea saponin;renal cancer cell;cell activity;apoptosis;mechanism