張鑫,劉朔,李苗苗,王鳳琦,張仁偉,劉世國

(1 青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學遺傳科,山東 青島 266003; 2 菏澤醫(yī)學?？茖W校生物化學檢驗教研室;3 菏澤市婦幼保健醫(yī)院新生兒疾病篩查中心; 4 青島大學附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是一種常見的、由G6PD基因突變而導致的X性連鎖不完全顯性的遺傳性紅細胞酶缺陷病,在臨床上導致溶血性貧血的發(fā)生[1]。G6PD基因位于X染色體長臂2區(qū)8帶(Xq28),由13個外顯子(其中第1個外顯子屬于非編碼)和12個內(nèi)含子組成,編碼515個氨基酸長度的蛋白質(zhì)[2]。G6PD是一個關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)酶,其功能是調(diào)節(jié)糖酵解并在磷酸戊糖途徑(PPP)的過程中產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),而這也是NADPH的主要的來源途徑。基因突變后,攜帶該突變基因的女性可將突變的等位基因傳遞給其子或女,而對于父親來說只能傳遞給女兒。依據(jù)酶活性和臨床表現(xiàn),WHO將G6PD缺乏癥分為Ⅰ～Ⅴ共5級。本研究對菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥篩查患病率及基因突變情況進行分析,旨在為該病的篩查、診斷、治療等提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2021年1—12月,選取在菏澤地區(qū)出生的共計77 141例新生兒作為研究對象,通過GSP?全自動熒光免疫分析儀篩查并召回檢測確診的G6PD缺乏癥病兒。本文研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準實施,家長均在新生兒疾病篩查前簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

1.2.1檢測儀器 GSP?全自動熒光免疫分析儀(GSP?,Genetic Screening Processor,型號為2021-0010);美國萊伯特LABNET Enduro水平電泳系統(tǒng);美國UV凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD);PCR擴增儀(Applied Biosystems?2720 Thermal Cycler,美國);ABI Prism 3730XL型基因分析儀(DNA測序儀,美國ABI公司)。

1.2.2試劑盒 G6PD測定試劑盒(GSP?Neonatal G6PD kit,熒光分析法);干血斑DNA提取試劑盒(TIANamp Blood Spots DNA Kit,離心柱型);莊盟ZOMANBIO DL 2000 Plus DNA Marker;諾唯贊Vazyme 2×Rapid Taq Master Mix試劑盒。

1.3 研究方法

1.3.1G6PD缺乏癥篩查方法 采集新生兒足跟血液,要求:①于新生兒生后72 h～7 d之內(nèi)采血;②采血前必須充分哺乳6次以上;③血液直接滴到濾紙上制備血片,自然晾干,避免污染,晾干后4 ℃或冷凍密封保存。應(yīng)用GSP?全自動熒光免疫分析儀,檢測新生兒血G6PD水平。若新生兒血紅蛋白G6PD<27 U/g,打電話召回重新采集足跟血制備干血斑片復查,如果3次復查(間隔1周)血紅蛋白G6PD均<27 U/g則確診為G6PD缺乏癥。

1.3.2DNA提取 嚴格按照干血斑DNA提取試劑盒的方法提取病兒干血斑片的基因組DNA,取2 μL,在核酸蛋白分析儀上檢測其濃度和純度。

1.3.3基因突變檢測 根據(jù)NCBI Reference Sequence:NM_001360016.2設(shè)計G6PD引物序列,應(yīng)用primer express 3.0設(shè)計9對引物,擴增產(chǎn)物長500～896 bp,其中Exon3～4、Exon6～7、Exon9～10、Exon11～12合并擴增,見表1。構(gòu)建PCR反應(yīng)體系:上、下游引物各1.0 μL,2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL,蒸餾水5.5 μL,提取的DNA樣品溶液5.0 μL。反應(yīng)條件:先50 ℃孵育2 min,然后95 ℃孵育3 min;95 ℃變性15 s, 60 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,經(jīng)歷35次循環(huán);之后75 ℃延伸5 min。擴增完成以后,取PCR擴增產(chǎn)物3 μL,在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳,反應(yīng)條件為:110 V,35 min。電泳完成后,使用凝膠成像儀成像,經(jīng)鑒定是本研究所需要的DNA片段后,送青島派森諾基因科技有限公司進行一代基因測序并分析。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

2 結(jié) 果

2.1 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥患病率的特點

菏澤地區(qū)2021年1—12月出生的7 7141例新生兒中,經(jīng)篩查并確診G6PD缺乏癥病兒54例,總患病率為0.07%,其中男50例,女4例。菏澤地區(qū)各縣區(qū)G6PD缺乏癥的患病率情況見表2。根據(jù)WHO的分類標準,Ⅱ類占1.85%,Ⅲ類占74.07%,Ⅳ類占24.07%。見表3。

表2 菏澤地區(qū)各縣區(qū)G6PD缺乏癥患病率情況(例)

表3 菏澤地區(qū)54例確診G6PD缺乏癥病兒的WHO分類情況

2.2 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變的情況

對54例確診病兒進行G6PD基因全部外顯子測序分析顯示,基因突變檢出率為100%,共發(fā)現(xiàn)13種突變類型,其中12種G6PD突變類型在中國人群中已報道過,分別為:c.1388G>A,c.487G>A,c.1376G>T,c.95A>G,c.1024C>T,c.871G>A,c.392G>T,c.1192G>A,c.486-34delT,c.1360C>T,c.592C>T,c.196T>A;1種為在中國人群中未見報道的內(nèi)含子變異:Intron5上c.486-7C>G(圖1);其中男性半合子13型,女性雜合子4型。81.48%的G6PD突變位于12、6、9、2號外顯子上,其中c.1388G>A、c.487G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.1024C>T占77.78%,菏澤地區(qū)的突變熱點依次為:c.1388G>A 29.63%,c.487G>A 22.22%,c.1376G>T 11.11%。見表4。

A:正?；蛐蛄?B:c.486-7C>G內(nèi)含子變異;圖中箭頭標示為變異位點。

表4 菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變檢測結(jié)果

3 討 論

常規(guī)檢測G6PD缺乏癥酶學的技術(shù)有很多,常用的篩查方法包括G6PD全自動熒光免疫分析法、硝基四氮唑藍紙片實驗方法、G6PD/6PGD比率法、高鐵血紅蛋白還原試驗等[3-5]。G6PD/6PGD比率法是WHO推薦的G6PD缺乏癥篩查方法,該方法操作比較簡單,檢測結(jié)果的準確度也比較高,而且具有可檢測出更多的雜合子類型的優(yōu)點,所以該方法在國際上應(yīng)用非常廣泛[5-7]。除了可以進行G6PD酶活性定量的檢測,也可以對G6PD缺乏癥的基因突變進行PCR產(chǎn)物直接測序,更加有利于在分子水平上對G6PD缺乏癥進行分析研究[8]。另外,由于全自動熒光免疫分析法可檢測樣本量大和自動化程度比較高,特異度與靈敏度也比較高[9-11],目前,該法在臨床上對新生兒遺傳代謝性疾病篩查中已被大多數(shù)的實驗室所采用。WHO Ⅰ類酶活性范圍為0,病人臨床表現(xiàn)為無明顯誘因情況下就會出現(xiàn)中度貧血、黃疸,肝脾大;Ⅱ類酶活性的范圍一般<10%,會出現(xiàn)間斷性的溶血發(fā)作,在食用某些食物(如蠶豆)、感染、氧化藥物和一些草藥可能會誘發(fā)急性溶血;Ⅲ類酶活性范圍為 10%～60%,病人臨床表現(xiàn)為少數(shù)伯氨喹類藥物或者感染可以引發(fā)溶血;Ⅳ類酶活性范圍>60%,病人無特殊臨床表現(xiàn);Ⅴ類酶活性范圍>200%,病人無特殊臨床表現(xiàn)[12]。相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,世界上G6PD缺乏癥病人大約有4億人,呈全球性分布,總患病率約5%[13-14]。另外有研究顯示,1990—2013年,每年平均有4 100人因為G6PD缺乏癥而死亡[15]。從全世界來看,G6PD缺乏癥分布呈現(xiàn)出不平衡的狀態(tài),在北美和歐洲發(fā)生率低于3%[16-17],而在非洲、亞洲、南美洲部分地區(qū)、地中海、中東等熱帶和亞熱帶地區(qū)發(fā)病率顯著增加,其發(fā)病率可高達15%～26%[18]。我國新生兒遺傳代謝病篩查(NBS)始于20世紀80年代,G6PD缺乏癥在我國兒童總體患病率為4.03%[19]。我國華南及西南各地區(qū)如廣東、廣西、云南、海南等G6PD缺乏癥常見,是該病的高發(fā)區(qū)之一,并呈“南高北低”的梯度分布趨勢。文獻報道,廣東省G6PD缺乏癥兒童患病率為3.1%～16.1%[20],廣西為7.40%[21],云南省為7.39%[22],貴州省為3.43%[23];而G6PD缺乏癥在我國北方地區(qū)的山東青島(患病率為0.02%)[24]、山東聊城(患病率為0.02%)[25]、陜西寶雞(患病率為0.02%)[26]、河北省石家莊(患病率為0.05%)[27]患病率較低。本研究表明2021年1—12月菏澤地區(qū)G6PD缺乏癥總患病率為0.07%,與該病發(fā)生率具有種族及地域差異、在我國存在“南高北低”的特點相符。本文研究結(jié)果顯示,G6PD缺乏癥鄆城縣和鄄城縣患病率為0.12%,巨野縣患病率為0.01%,表明菏澤地區(qū)各縣區(qū)新生兒G6PD缺乏癥篩查患病率亦有地域差異性。

目前,全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在約220種G6PD基因缺陷等位基因,其分布具有明顯的地區(qū)和民族異質(zhì)性等特點[28]。既往有研究表明,緬甸地區(qū)常見的G6PD基因突變?yōu)閏.487G>A[29],在非洲地區(qū)人群中G6PD基因突變常見的類型則以c.202G>A、c.376A>G、c.542A>T突變?yōu)橹鱗30],地中海沿岸、中東以及印度等國家和地區(qū)主要常見的基因突變?yōu)閏.563G>T[31],泰國和馬來西亞常見的基因突變?yōu)閏.871G>A[32],印尼安汶人中常見的基因突變?yōu)閏.383T>C[33],夏威夷州菲律賓裔居民常見的基因突變?yōu)閏.1360C>T[34]。而在我國,G6PD缺乏癥的患病率和基因突變類型明顯具有地域和群體特異性。中國人突變位點主要是c.1388G>A、c.1376G>T、c.95A>G,分布在我國多個民族中[35]。本研究共檢出13種突變類型,其中有12種G6PD突變類型c.1388G>A、c.487G>A、c.1376G>T、c.95A>G、c.1024C>T、c.871G>A、c.392G>T、c.1192G>A、c.486-34delT、c.1360C>T、c.592C>T、c.196T>A在中國人群中已報道過;菏澤地區(qū)的突變熱點依次為:c.1388G>A(29.63%)、c.487G>A(22.22%)和c.1376G>T(11.11%)。通過檢索MasterMind和NCBI Clinvar以及中國國家基因組數(shù)據(jù)庫,本研究發(fā)現(xiàn)1種在中國人群中未見報道的G6PD基因內(nèi)含子變異:c.486-7C>G,該例病兒只有此1種基因變異,并且在Exon6前7個堿基處發(fā)生堿基替換,可能影響G6PD蛋白的剪接,為可能致病變異。提示菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥基因突變的類型有其地域特點。

綜上所述,菏澤地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥患病率較低,為0.07%;G6PD缺乏癥患病率和基因突變的類型有地域特點,通過對G6PD基因全部外顯子進行測序能夠進一步明確基因突變位點的分布情況。本研究發(fā)現(xiàn)了1種G6PD基因新突變,豐富了G6PD基因突變的數(shù)據(jù)庫,為該病的預(yù)防以及治療提供了更加豐富的可供臨床參考的資料。