王 琳,嚴達偉,馬 黎,張 博,王莉興,張 浩,董新星

(1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院,昆明 650201;2.云南農業(yè)職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)學院,昆明 650212;3.中國農業(yè)大學動物科學技術學院,北京 100193;4.云南省畜牧總站,昆明 650224)

【研究意義】目前中國豬肉生產中存在的一個主要矛盾是地方豬種生長緩慢、體脂含量高、瘦肉率低,而改良型豬種雖然瘦肉率高、體脂含量低,但肌內脂肪少,肉質差。在不影響豬肉品質的前提下,減少豬脂肪沉積已成為當前畜牧業(yè)亟需解決的關鍵科學問題之一。豬的背膘厚與生長速度和胴體瘦肉率呈負相關,與肌內脂肪含量呈正相關[1-2],研究豬背膘厚的功能基因及其調控機制,對豬瘦肉產量和肉品質的遺傳改良具有重要意義。【前人研究進展】Song等[3]發(fā)現(xiàn),瘦肉型豬脂肪沉積較少,可能與脂肪酸氧化能力強和能量代謝快有關。Albuquerque等[4]發(fā)現(xiàn),葡萄牙脂肪型豬較高的脂肪沉積可能與脂肪酸從頭合成、膽固醇合成及胰島素抵抗有關。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn),嘉興黑豬較高的脂肪率可能與PI3K-Akt信號通路和MAPK/p38通路等與脂肪生成相關的通路有關。Yuan等[6]發(fā)現(xiàn),脂肪酸氧化相關基因CPT1A、ENNP1、APOBEC3F、PDK4在長白豬皮下脂肪高表達,長白豬的脂肪分解代謝高于金華豬,pFAM134B基因通過上調PPARγ、FAS、ACC等脂肪合成相關基因表達,下調ATGL、HSL脂肪分解相關基因表達,促進脂肪細胞內甘油三酯的積累。Chen等[7]發(fā)現(xiàn),脂肪代謝相關基因CES1通過參與脂酰和膽固醇代謝而促進甘油三酯生成。Xing等[8]發(fā)現(xiàn),AMPD1基因通過抑制脂肪酸氧化分解相關基因AMPK的活性,減少脂肪酸氧化,促進脂肪積累,CKMT2基因通過促進線粒體呼吸,增加能量消耗,減少脂肪存儲。Liu等[9]、Zhao等[10]發(fā)現(xiàn),PPAR信號通路、類固醇激素生物合成、TNF信號通路和甘油酯代謝等通路協(xié)同調節(jié)豬皮下前脂肪細胞分化,在分化的不同時間點,甘油三酯在脂肪細胞中不斷積累?！颈狙芯壳腥朦c】不同豬種的不同組織調控脂肪沉積的功能基因及其通路并不完全相同,表現(xiàn)出豬種特異性和時空特異性。迪慶藏豬是中國特有的高原型豬種之一,沉脂能力強、肉質好[11],目前關于藏豬的報道主要集中在血液生理[12]、低氧適應[13]、生長[14]、肉質[15],未見有迪慶藏豬背脂沉積功能基因及其調控機制的報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用RNA-Seq技術篩選大型迪慶藏豬背部皮下脂肪不同生長階段的差異表達基因并分析其調控網絡,為迪慶藏豬的育種工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇胎次相同、日齡和體重相近的純種大型迪慶藏豬36頭隨機分3組(均已去勢,公母各半),每組12頭(表1),在云南省香格里拉市綠源生態(tài)種養(yǎng)專業(yè)合作社進行育肥試驗,分別在體重達40、80和120 kg左右(S1:10～40 kg、S2:40～80 kg、S3:80～120 kg)時屠宰,每組選擇接近平均體重的3頭去勢公豬,采集背部皮下脂肪組織,分別為S1_背脂_1、S1_背脂_2、S1_背脂_3、S2_背脂_1、S2_背脂_2、S2_背脂_3、S3_背脂_1、S3_背脂_2、S3_背脂_3,液氮速凍運回實驗室,保存于-80 ℃冰箱,用于提取總RNA。

表1 試驗豬只分組情況Table 1 Group of experimental pigs

1.2 試驗方法

總RNA提取、mRNA文庫構建參照文獻[16],用Illumina HiseqTM2000上機測序。用軟件Primer Premier 5.0設計qPCR引物(表2),內參基因選用豬GAPDH,qPCR定量驗證重要DEGs。

表2 差異表達基因引物Table 2 The primers of differentially expressed genes

1.3 數據處理與分析

1.3.1 測序數據處理 原始數據(Raw data)質控、過濾后(Clean reads)與豬參考基因組(Susscrofa11.1)比對,使用軟件StringTie組裝、定量比對到基因組各染色體上的reads,得到reads對應的每千個堿基轉錄每百萬映射讀取的片段(Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads,FPKM)值。

1.3.2 差異基因篩選及功能富集分析 使用軟件DEGseq2對歸一化的FPKM值進行差異基因分析,參考王志秀[16]方法,以|log2fold change|>1且P<0.05為標準篩選差異表達基因;參考陸秀紅等[17]方法,用在線軟件DAVID對差異表達基因進行GO和KEGG分析,顯著富集基因的閾值定為富集度Count≥2且矯正P<0.05。

1.3.3 差異基因STEM分析 參考Lu等[18]方法,以3個不同生長階段全部差異基因的表達量數據用短時間序列表達模式分析軟件(Short-time series expression miner,STEM)進行表達模式聚類分析,以不同階段兩兩比較的組間差異倍數>2倍且P<0.05為數據過濾標準。

1.3.4 差異基因互作網絡分析 選擇STEM分析中顯著富集的模塊,參考Chen等[19]方法,利用R語言計算模塊中差異基因間的共表達相關性,選擇Pearson相關系數大于0.98的轉錄本,用軟件Cytoscape 3.7.1繪制基因共表達網絡。

2 結果與分析

2.1 迪慶藏豬背脂轉錄組測序數據統(tǒng)計

RNA-seq數據(表3)顯示,每個樣品原始reads數均在46.06 M以上,有效reads比例高于90%,有效 Q30比例均高于94%,3組樣品的比對率均高于87%,符合生物信息學分析要求。

表3 RNA-Seq數據統(tǒng)計Table 3 RNA-Seq data statistics

2.2 qPCR定量驗證

對ACOX1、ANGPTL4等15個差異基因進行qPCR驗證(圖1)。驗證結果表明,15個基因在背脂組織中的表達量與轉錄組測序結果一致。

圖1 迪慶藏豬背脂差異表達基因qPCR定量驗證結果Fig.1 qPCR results of differentially expressed genes in back fat of Diqing Tibetan pigs

2.3 迪慶藏豬背脂差異基因表達水平分析

利用全部DEGs的FPKM值繪制小提琴圖,由圖2可見,S1、S2和S3組lg(FPKM+1)值的中位數分別為0.81、0.85和0.86。

圖2 迪慶藏豬背脂差異基因表達水平的小提琴圖Fig.2 Violin diagram of differential gene expression levels of back fat of Diqing Tibetan pigs

2.4 迪慶藏豬背脂mRNA差異表達分析

10～40 kg(S1)、40～80 kg(S2)和80～120 kg(S3)階段共得到19 706個DEGs(圖3),僅在S1階段表達的基因有835個,僅在S2階段表達的基因有666個,僅在S3階段表達的基因有950個。

圖3 迪慶藏豬背脂三階段間基因表達Fig.3 Gene expression between back fat in 3 stages of Diqing Tibetan pigs

2.5 迪慶藏豬不同生長階段背脂顯著差異基因篩選

在S1與S2階段共篩選到顯著差異表達基因845個,其中,263個上調,582個下調(圖4-A);在S2與S3階段共篩選到558個,其中,292個上調,266個下調(圖4-B)。

A:S1與S2階段差異基因火山圖;B:S2與S3階段差異基因火山圖。A:Volcanic map of differential genes in S1 and S2; B:Volcanic map of differential genes in S2 and S3.圖4 迪慶藏豬背脂差異基因火山圖Fig.4 Volcano map of differential genes in back fat of Diqing Tibetan pigs

2.6 迪慶藏豬不同生長階段背脂顯著差異基因功能富集分析

S1與S2階段:GO分析顯示,顯著DEGs主要富集在鈣離子結合、碳水化合物結合、細胞增殖正調控等(圖5-A)。KEGG分析顯示,顯著DEGs主要富集在PPAR信號通路、PI3K-Akt信號通路、胰島素抵抗等(圖5-B),其中,ACOX1、ANGPTL4和ADIPOQ基因富集于PPAR信號通路并顯著下調。

A:S1與S2階段差異基因GO分析氣泡圖;B:S1與S2階段差異基因KEGG分析氣泡圖;C:S2與S3階段差異基因GO分析氣泡圖;D:S2與S3階段差異基因KEGG分析氣泡圖。A:GO bubble diagram of differential genes in S1 and S2;B:KEGG bubble diagram of differential genes in S1 and S2;C:GO bubble diagram of differential genes in S2 and S3;D:KEGG bubble diagram of differential genes in S2 and S3.圖5 迪慶藏豬背脂差異基因GO和KEGG分析Fig.5 GO and KEGG of differential genes in back fat of Diqing Tibetan pigs

S2與S3階段:GO分析顯示,顯著DEGs主要富集在脂肪細胞分化、碳水化合物結合、脂質代謝過程等(圖5-C)。KEGG分析顯示,顯著DEGs主要富集在胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、糖酵解/糖異生、PPAR信號通路等(圖5-D),其中,EGR2、ID4、FFAR4基因富集于脂肪細胞分化,PCK1、PPP1R3C基因富集于胰島素信號通路,5個基因均顯著上調。

2.7 迪慶藏豬不同生長階段背脂差異基因短時間序列分析

短時間序列分析(圖6)發(fā)現(xiàn)共有4個差異顯著模塊,分別為模塊4(P=6.4E-26)、模塊0(P=2.0E-9)、模塊3(P=7.3E-5)和模塊14(P=2.7E-6),其中模塊4、模塊0和模塊3的差異基因總體聚為一類,基因表達量隨著大型迪慶藏豬體重的增加逐漸下降;模塊14中基因的表達量先上調表達后輕微下調表達;其余模塊差異不顯著(P>0.05)。

模塊以基因數量和模塊顯著性排序。Clusters are ordered based on number of genes and cluster significance.圖6 迪慶藏豬背脂STEM分析Fig.6 STEM analysis in back fat of Diqing Tibetan pigs

2.8 迪慶藏豬背脂差異表達基因互作網絡

2.8.1 模塊0/3/4差異基因互作網絡 將STEM分析中3個階段均顯著下調的差異基因合并,繪制基因互作網絡(圖7)。CPT1B、LPIN3、PTGER3基因位于網絡中心,與ND3、DEGS2、HHIP、CYTB、SMPD3、CALML5基因有互作關系,CPT1B基因調控ND3、DEGS2、HHIP、LPIN3、CYTB、SMPD3、PTGER3、CALML5基因;LPIN3基因調控ND3、DEGS2、HHIP、CYTB、SMPD3、CALML5基因;PTGER3基因調控ND3、DEGS2、HHIP、LPIN3、CYTB、SMPD3、CALML5基因。

紅色節(jié)點表示位于網絡核心的基因,藍色節(jié)點表示位于網絡外周的基因,箭頭起始端代表調控關系的上游,箭頭末端代表調控關系的下游,即箭頭連接兩個基因,代表箭頭起始端的基因對末端的基因起調控作用,下同。Red nodes represent genes located in the core of the network, and blue nodes represent genes located outside the network. The beginning and end of the arrows represent the upstream and downstream of the regulatory relationship. The arrow connects two genes, where the gene at the beginning regulates the gene at the end. The same as below.圖7 迪慶藏豬背脂模塊0/3/4差異基因互作網絡Fig.7 Interaction network diagram of differential genes at module 0/3/4 in back fat of Diqing Tibetan pigs

2.8.2 模塊14差異基因互作網絡 將STEM分析中先上調、后輕微下調的基因繪制基因互作網絡(圖8)。AACS、SOCS3、AQP3、RPS6KA1基因位于網絡中心,與STC2、CYP2C42、PCK2、ACP5和SPP1基因有互作關系,AACS基因調控CYP2C42、SOCS3、AQP3、PCK2、RPS6KA1、ACP5、SPP1基因;SOCS3基因調控STC2、SPP1基因;AQP3基因調控STC2、SOCS3、CYP2C42、PCK2、RPS6KA1、SPP1基因;RPS6KA1基因調控STC2、SOCS3、ACP5、SPP1基因。

圖8 迪慶藏豬背脂模塊14差異基因互作網絡圖Fig.8 Interaction network diagram of differential genes at module 14 in back fat of Diqing Tibetan pigs

3 討 論

3.1 迪慶藏豬S1與S2階段背脂沉積差異基因

ACOX1基因編碼脂肪酸β氧化的第一限速酶,ACOX1基因表達下調,抑制脂肪酸氧化,體內甘油三酯積累,導致大鼠肥胖[20]。ANGPTL4編碼的蛋白可調節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)、脂質代謝,促進脂肪細胞中的甘油三酯釋放到血漿,在缺失ANGPTL4的小鼠血漿中幾乎檢測不到甘油三酯,過表達ANGPTL4的小鼠血漿甘油三酯含量升高[21],ANGPTL4編碼的蛋白可將血漿甘油三酯運送到代謝需求量大的組織,促進甘油三酯分解為脂肪酸,進一步氧化分解,為組織代謝供能[22]。ADIPOQ編碼脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結構域,它的突變或異常表達都會引起胰島素抵抗相關的代謝綜合征,其僅在脂肪組織中表達,在調節(jié)脂代謝和糖代謝中發(fā)揮作用[23],ADIPOQ編碼的脂聯(lián)素能在脂肪組織中誘導AMPK蘇氨酸殘基磷酸化,激活的AMPK促進脂肪酸氧化分解,減少脂肪存儲,ADIPOQ是脂肪生成的負調控因子[24]。在本研究中,ACOX1、ANGPTL4和ADIPOQ基因在S1與S2階段下調,ACOX1基因下調可能抑制脂肪酸氧化、甘油三酯積累,ANGPTL4基因下調可能抑制脂肪細胞中甘油三酯分解,ADIPOQ基因下調可能減少脂肪酸分解、增加脂肪存儲,背膘增厚,與S2階段背膘厚顯著高于S1階段的結果一致。

3.2 迪慶藏豬S2與S3階段背脂沉積差異基因

EGR2是脂肪形成誘導因子之一,EGR2基因位于C/EBPβ的上游,通過誘導C/EBPβ的表達而促進脂肪細胞分化[25],隨EGR2表達量減少,3T3-L1細胞分化能力降低[26]。ID4編碼蛋白是DNA結合抑制劑蛋白家族成員,可調節(jié)脂肪細胞分化,促進脂肪生成,前脂肪細胞中C/EBPα、PPARγ、FABP4、LPL等脂肪細胞分化標志物表達水平隨ID4基因表達降低而降低,ID4基因缺失小鼠,脂肪組織減少、體重降低[27]。FFAR4編碼蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,作為長鏈脂肪酸的受體,可調節(jié)脂肪生成,FFAR4在ω-3脂肪酸的刺激下,作用于前脂肪細胞的纖毛上,誘導脂肪細胞增殖,產生更多新的脂肪細胞來儲存飽和脂肪酸,進而維持脂肪組織的脂質穩(wěn)態(tài)[28],此外,在游離脂肪酸誘導下,FFAR4與脂膜上的G蛋白偶聯(lián),抑制細胞內cAMP的積累,cAMP是一種第二信使,可激活脂肪分解、葡萄糖攝取和產熱,FFAR4對cAMP抑制,減少脂肪分解和能量消耗,促進脂肪沉積[29]。在本研究中,相比于S2階段,基因EGR2、ID4、FFAR4在S3階段上調,可能對脂肪細胞存在誘導分化、促進增殖,降低代謝,維持胞內脂質穩(wěn)態(tài)等作用。

PCK1和PPP1R3C基因在糖代謝和脂代謝中發(fā)揮重要作用,PCK1編碼促進甘油生成的調節(jié)酶,敲除PCK1基因的小鼠,脂肪組織中甘油三酯沉積減少[30],過表達PCK1的轉基因小鼠甘油生成增加,游離脂肪酸重新酯化,脂肪細胞大小和脂肪質量增加[31],表明PCK1通過生成甘油三酯的前體—甘油,促進脂肪沉積;PPP1R3C編碼碳水化合物結合蛋白,敲除PPP1R3C基因的小鼠,其脂肪組織中脂肪生成的關鍵基因mTORC1和SREBP1表達水平降低,脂質合成減少[32],表明PPP1R3C基因可促進脂肪合成。在本研究中,與S2階段相比,PCK1和PPP1R3C基因在S3階段中顯著上調,可能促進甘油三酯合成、脂質生成增加,背膘增厚,符合S3階段背膘厚顯著高于S2階段的結果。

3.3 迪慶藏豬S1與S2與S3階段背脂沉積差異基因

PTGER3是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,能誘導異丙腎上腺素合成而促進脂肪分解,缺失PTGER3基因的小鼠因不能合成異丙腎上腺素,脂肪分解被抑制、脂肪沉積增加;其與正常小鼠相比,有更大的脂肪細胞和更高的體脂含量[33]。CPT1B基因編碼長鏈脂肪酸β氧化的限速酶,脂肪組織CPT1B表達減少會導致脂肪組織中脂肪酸氧化能力降低,未氧化的脂肪酸新酯化為甘油三酯,引起機體肥胖[34]。LPIN3基因編碼蛋白是脂蛋白家族成員之一,參與甘油三酯運輸,缺失LPIN3基因的脂肪細胞,脂肪生成關鍵基因PPARγ、FABP4表達降低、脂滴減小,LPIN3的表達水平與脂肪含量呈負相關,肥胖小鼠通過負反饋機制抑制LPIN3基因的表達以維持脂質穩(wěn)態(tài)[35]。本研究中,基因PTGER3、CPT1B和LPIN3在迪慶藏豬3個階段背脂中均顯著下調表達,PTGER3基因下調可能抑制脂肪分解、促進脂肪細胞增大,CPT1B基因下調可能使脂肪酸氧化能力降低、導致甘油三酯增多,LPIN3基因下調可能防止脂滴的過度聚集以維持脂質穩(wěn)態(tài),最終導致背膘增厚,與S3階段背膘顯著高于S2階段、S2階段顯著高于S1階段的結果一致。

AACS編碼位于脂滴周圍的酮體利用酶,將乙酰乙酸轉化為乙酰乙酰輔酶A,為脂肪合成提供乙?；鶈挝?缺失AACS基因導致脂肪細胞分化標志物PPARγ和CEBP/α表達量降低,脂肪細胞分化受阻[36]。SOCS3編碼細胞因子信號傳導抑制蛋白,敲除SOCS3基因的肝細胞,與脂肪生成相關的SREBP1c、ACCα和IL-6等蛋白表達顯著降低、脂肪生成減少[37]。RPS6KA1基因是絲氨酸/蘇氨酸激酶RSK家族成員,RPS6KA1基因可誘導CREB基因磷酸化,激活后的CREB與CEBPB基因啟動子結合,促進脂肪生成[38]。AQP3編碼水通道蛋白,促進水和甘油的運輸,AQP3基因通過促進成脂相關基因PPARγ、aP2等的表達而促進脂肪細胞內甘油三酯沉積[39]。在本研究中,從S1到S2階段,AACS基因上調,可能促進脂肪細胞分化、細胞數量增多;SOCS3和RPS6KA1基因上調,可能促進脂肪生成;AQP3基因上調,可能導致脂肪細胞內甘油三酯增多、背膘增厚;但從S2階段到S3階段,這4個基因均稍下調,可能導致脂肪生成速率降低、脂肪細胞分化減緩,脂肪細胞內甘油三酯速率減慢,背膘增速變慢,與S2階段平均背膘厚、6～7肋間膘厚比S1階段分別增加83.26%、75.79%,而S3階段平均背膘厚、6～7肋間膘厚比S2階段分別增加38.83%、25.15%,增幅下降的結果一致。

4 結 論

大型迪慶藏豬從40 kg長至80 kg,AACS基因上調促進脂肪細胞分化、細胞數量增多,SOCS3、RPS6KA1基因上調促進脂肪生成,AQP3基因上調促進脂肪細胞內甘油三酯增多;ACOX1基因下調抑制脂肪酸氧化,ADIPOQ基因下調減少脂肪酸分解、增加脂肪存儲,PTGER3基因下調抑制脂肪分解,CPT1B基因下調促進甘油三酯合成,ANGPTL4基因下調抑制脂肪細胞中甘油三酯分解,LPIN3基因下調表達調控脂滴的過度聚集以維持脂質穩(wěn)態(tài),AACS、SOCS3和LPIN3等10個基因協(xié)同作用,導致其背膘厚顯著增加。從80 kg長至120 kg,EGR2基因上調誘導脂肪細胞分化、促進脂肪細胞增殖,PPP1R3C基因上調促進脂肪合成,ID4基因上調促進脂肪生成,PCK1基因上調促進甘油三酯合成,FFAR4基因上調減少脂肪分解、維持脂質穩(wěn)態(tài);PTGER3基因下調抑制脂肪分解、脂肪細胞增大,CPT1B基因下調使脂肪酸氧化能力降低、甘油三酯增多,LPIN3基因下調調控脂滴的過度聚集以維持脂質穩(wěn)態(tài),EGR2、PPP1R3C和LPIN3等8個基因協(xié)同作用,導致其背膘厚顯著增加。