徐雨辰 葉旭星

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中心，浙江金華 321000

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性炎癥性致殘性疾病[1]，發(fā)病率和病死率都較高，已成為死亡的主要原因[2]。慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是COPD 進展的關(guān)鍵[3]。中醫(yī)藥對COPD 具有預(yù)防急性加重和治療的積極作用[4]。中醫(yī)學(xué)將COPD 歸屬于“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇[5]，本虛標(biāo)實為其主要病理特征。資生湯出自張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》載：“資生湯主治勞瘵羸弱已甚，飲食減少，喘促咳嗽……?！盵6]本方為虛損性疾病而設(shè)，從“虛”入手，取“補土生金”之意。研究表明資生湯可以提高COPD 患者免疫功能及生活質(zhì)量[7]。但其具體有效成分、作用靶點等尚未見有報道。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探討資生湯治療COPD 的潛在分子機制，為臨床提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資生湯有效成分提取

將資生湯藥物組成“山藥、白術(shù)、玄參、牛蒡子”4 味中藥（雞內(nèi)金由于非草本類藥物無數(shù)據(jù)資料，故不納入）分別輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（traditional chinesemedicine systems pharmacology，https://tcm-spw.com /tcmsp.php），將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設(shè)置為≥50%及藥物相似性（drug-likenes，DL）設(shè)置為≥0.20，最終合并以獲得活性成分數(shù)據(jù)集。

1.2 資生湯藥物作用靶點挖掘

同樣利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集資生湯有效活性成分對應(yīng)的作用靶點，然后運用UniProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進行作用靶點匹配及基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理以用于網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析。

1.3 資生湯治療COPD的潛在作用靶點篩選

以“COPD”作為搜索條件輸入GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，收集得到慢性阻塞性肺疾病靶點。運用Venn 圖在線工具（https://www.bioinformatics.com.cn/）提取疾病靶點和藥物作用靶點的交集，即得到資生湯治療COPD 的潛在作用靶點。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將資生湯治療COPD 潛在作用靶點數(shù)據(jù)集上傳至String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），導(dǎo)出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)信息。再利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

利用David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），對潛在作用靶點進行基因本體和通路富集分析，并進行數(shù)據(jù)可視化處理。

1.6 分子對接

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫下載資生湯有效成分分子式作為配體，從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點蛋白，去除水分子及配體，作為受體。運用AutoDock Vina 1.2.3 軟件對篩選所得的配體及受體逐個進行批量分子對接以驗證結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 資生湯活性成分

運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，將篩選條件設(shè)為OB ≥50%且DL ≥0.20，共獲得8 個活性成分，見表1。

表1 資生湯主要有效成分及來源

2.2 資生湯治療COPD潛在作用靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜集目標(biāo)中藥活性成分對應(yīng)作用靶點78 個。通過比對Genecards 數(shù)據(jù)庫中COPD 疾病靶點集，最后得到17 個資生湯治療COPD 的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 資生湯治療COPD 的潛在作用靶點

2.3 “中藥-成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

將上述篩選得到的中藥、有效成分及作用靶點整理得到三者相互對應(yīng)的數(shù)據(jù)信息，并導(dǎo)入至Cytoscape 3. 8.2 軟件生成“中藥- 成分- 作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，得到1 個90 個節(jié)點，97 條邊的網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖2 中藥-成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

將篩選得到的17 個潛在作用靶點，上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)信息。再利用Cytoscape 3.8. 2 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進行拓撲分析，得到各靶點的介度（Betweenness centrality）、緊密度（Closeness centrality）和度（Degree）。以介度、緊密度大于中位數(shù)和度大于兩倍中位數(shù)進行篩選共得到9 個核心靶點，見表2。

圖3 資生湯潛在作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)

表2 9個核心靶點拓撲學(xué)性質(zhì)

2.5 GO和KEGG分析

利用David 6. 8 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析，共得到88 個條目，其中生物過程（biological process，BP）72 個條目，主要涉及細胞凋亡過程和DNA 的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程正調(diào)控等方面；細胞組成（cellular component，CC）8 個條目，主要涉及質(zhì)膜外側(cè)、溶酶體、胞外區(qū)等方面；分子功能（molecular function，MF）8 個條目，主要涉及細胞因子活性等。各取P≤0.01 且排名前8 條目進行可視化作圖，見圖4。

圖4 資生湯治療COPD 潛在靶點GO 功能分析

KEGG 信號通路富集共獲得8 條通路，見圖5。通路主要涉及Toll 樣受體信號通路（tolllike receptor signaling pathway）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、移植物抗宿主?。╣raftversus-host disease）等。

圖5 資生湯治療COPD 潛在靶點KEGG 通路分析

2.6 分子結(jié)合能力驗證

炎癥反應(yīng)是COPD 發(fā)生、發(fā)展的核心。因此，我們從以上篩選出的9 個核心靶點中選取白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）3 個炎癥靶點作為受體與資生湯中8 個有效成分進行分子對接。結(jié)果顯示8 種有效成分與IL-6、IL-1β、TNF 的Vina affinity 得分均小于-5.0 kcal/mol，提示均有較好的結(jié)合能力，見圖6。

圖6 資生湯有效成分與炎性靶點對接結(jié)果（affinity 得分 kcal/mol）

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法來探究資生湯治療COPD 的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制。資生湯主要活性成分有惡唑烷-2-酮、紫杉醇、海風(fēng)藤酮、山酮 C、薯蕷皂苷元、3β-乙酰氧基白術(shù)酮、14-去氧-12 （R）-磺酸基穿心蓮內(nèi)酯、玄參苷8 種，涉及IL-6、IL-1β、TNF 等與炎癥相關(guān)的主要靶點。分子對接結(jié)果提示8 種有效成分與以上3 種炎癥靶點均具有較好的結(jié)合能力。

環(huán)境因素與多基因變異的相互作用是COPD發(fā)病的關(guān)鍵。目前認為COPD 的發(fā)病機制與炎癥反應(yīng)、氧化和抗氧化失衡、氣道高反應(yīng)和主動防御等炎癥免疫機制密切相關(guān)[8]。然而炎癥是COPD發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，炎癥細胞釋放炎性介質(zhì)和破壞性酶，參與了COPD 肺實質(zhì)的進行性破壞[9]，并與肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著至關(guān)重要的聯(lián)系。IL-6、IL-1β、TNF-α 均能參與COPD 的炎癥反應(yīng)，是介導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的重要細胞因子[10]。IL-6 不僅能激發(fā)T 淋巴細胞、B 淋巴細胞分泌炎癥介質(zhì)，促進B 淋巴細胞分化成熟，趨化中性細粒細胞和單核-巨噬細胞，還能增強IL-1β、TNF-α 炎癥效應(yīng)[11]。IL-1β 在氣道上皮細胞及肺泡巨噬細胞中發(fā)揮作用，又能上調(diào)IL-6 表達水平，從而形成IL-6 與IL-1β 互相激發(fā)的惡性循環(huán)不斷放大炎癥反應(yīng)，加重肺部損傷[12]。TNF-α 作為一種重要的促炎細胞因子，在COPD 發(fā)展過程中也起著至關(guān)重要的作用[13]。研究證實TNF-α 過表達與氣流阻塞的程度、肌肉功能障礙密切相關(guān)[14]。從KEGG 信號通路分析來看，資生湯可能通過Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路來發(fā)揮治療作用。目前，已有多項研究表明TLR4 與COPD 的發(fā)病密切相關(guān)[15]。

綜上所述，資生湯可能通過8 種不同活性成分共同作用，抑制TLR 信號通路，下調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平，減輕炎癥，阻斷肺血管重塑，從而達到治療COPD 的目的。