秦富吉,李妮妮,鄒延新,李鳳林

急性心肌梗死是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因,隨著冠狀動(dòng)脈介入等再灌注策略在臨床的廣泛運(yùn)用,可最大限度地挽救缺血心肌,但恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流往往對心肌造成二次損傷,即心肌缺血再灌注損傷,其中氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-141-3p可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞存活及凋亡等相關(guān)基因改善心肌缺血再灌注損傷,劉大朋等[3]研究發(fā)現(xiàn),脂多糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-141-3p表達(dá)水平明顯降低,miR-141-3p可調(diào)控Krupec-6(KLF6)的表達(dá)影響心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)是Kelch家族中的一員,生理狀態(tài)下與Nrf2形成“門閂-鉸鏈”結(jié)構(gòu)?；钚匝?ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可使Keap1構(gòu)象發(fā)生變化而與Nrf2解離,Nrf2不能繼續(xù)被泛素化降解,繼而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,激活下游通路發(fā)揮抗氧化作用,因此,Keap1在Nrf2/血紅素氧合酶1(HO-1)抗氧化應(yīng)激通路中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用[4]。本研究通過生物信息學(xué)分析顯示,Keap1是miR-141-3p的潛在靶基因,但miR-141-3p能否靶向Keap1參與對缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的調(diào)控有待闡明。本研究通過建立缺氧/復(fù)氧(H/R)H9c2心肌細(xì)胞模型,探討miR-141-3p靶向Keap1對H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的分子機(jī)制及對制及對Nrf2/HO-1通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)細(xì)胞庫,V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞毒性試驗(yàn)(CCK-8)試劑盒、ROS染液、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自碧云天生物技術(shù)有限公司,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司,SYBR Green PCR試劑盒購自Thermo公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas,Lipofectamine 2000試劑購自美國Thermofisher公司,miR-141-3p mimics、miR-NC、Keap1-野生型(WT)質(zhì)粒和Keap1-突變型(MUT)質(zhì)粒均購自廣州銳博生物科技有限公司,Keap1、Nrf2和HO-1抗體由Proteintech提供,蛋白印跡電泳儀購自美國BIO-RAD公司,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(ABI 7500)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞H/R模型建立 H9c2細(xì)胞采用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí),加入胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞置于無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于37 ℃、95% N2、5%CO2的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)6 h;然后換為正常培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)6 h,其中經(jīng)過H/R處理的心肌細(xì)胞作為H/R組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 6孔板接種H9c2細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%,按照Lipofectamine 2000操作說明分別轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics、NC質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為control組(正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞)、H/R組(H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理)、H/R+miR-NC組(H9c2細(xì)胞NC轉(zhuǎn)染經(jīng)H/R處理)和H/R+miR-141-3p組(H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-141-3p經(jīng)H/R處理),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測H9c2細(xì)胞中miR-141-3p、Keap1 mRNA表達(dá) 取生長狀況良好的H9c2細(xì)胞,采用Trizol法提取各細(xì)胞株總RNA,所得RNA D260/D280>1.7,符合純度要求。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 45 s,共40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后通過分析Ct值,結(jié)果采用2-ΔΔCt表示miR-141-3p和Keap1 mRNA相對表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8法檢測各組H9c2細(xì)胞存活率 取各組對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度值(OD),計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=(OD處理組/OD對照組)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞凋亡 取各組對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞,按照操作說明分別加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞、10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液,室溫避光孵育15 min,隨后進(jìn)行冰浴。同時(shí)以不加Annexin V-FITC及PI的一管作為陰性對照,通過流式細(xì)胞儀檢測H9c2細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 先用TargetScan7.1軟件預(yù)測miR-141-3p與Keap1的3′UTR之間存在堿基互補(bǔ)關(guān)系,然后構(gòu)建野生型及突變型Keap1-3′UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒,并將所構(gòu)建的質(zhì)粒和miR-141-3p及其陰性對照轉(zhuǎn)染到H9c2細(xì)胞中,分為WT+miR-NC組、WT+miR-141-3p mimics組、MUT+miR-NC組、MUT+miR-141-3p mimics組,培養(yǎng)48 h后,嚴(yán)格按照雙熒光素酶檢測說明書操作,檢測各組熒光素酶活性。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western Blotting)檢測H9c2細(xì)胞蛋白表達(dá) 分別取各組H9c2細(xì)胞置于EP試管中,應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入稀釋后的一抗,室溫孵育2 h,TBST洗滌后加入二抗,與膜37 ℃孵育1 h,加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影,Image J軟件計(jì)算條帶灰度值,分析蛋白表達(dá)量。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測SOD、MDA、GSH水平 按ELISA試劑盒說明步驟進(jìn)行檢測,用酶聯(lián)儀在450 nm波長處測定各孔的光密度(OD值),根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出SOD、MDA、GSH表達(dá)水平。

1.2.9 二氫乙錠(DHE)染色檢測ROS含量 用稀釋后的DHE染液(稀釋濃度為1∶500)染片后,孵育洗滌;用DAPI染液室溫避光染核20 min,在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,用Image Pro Plus 7.0進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析,計(jì)算細(xì)胞ROS的含量。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞H9c2中miR-141-3p、Keap1 mRNA表達(dá)情況 通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-141-3p和Keap1 mRNA在心肌細(xì)胞H9c2的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞中miR-141-3p表達(dá)量明顯下降(P<0.05),Keap1 mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05);與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p組心肌細(xì)胞中miR-141-3p水平升高,Keap1 mRNA表達(dá)量明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞miR-141-3p和Keap1 mRNA表達(dá)比較

2.2 miR-141-3p對H/R模型H9c2細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05);與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p心肌細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05)。詳見圖1。

H/R組與control組比較,＊P<0.05;H/R+miR-141-3p組與H/R+miR-NC組比較,#P<0.05。

2.3 miR-141-3p對H/R模型H9c2細(xì)胞凋亡的作用 與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05);與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。詳見圖2。

H/R組與control組比較,＊P<0.05;H/R+miR-141-3p組與H/R+miR-NC組比較,#P<0.05。

2.4 miR-141-3p對H/R模型H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 采用DHE熒光探針檢測ROS含量,綠色熒光為ROS陽性表達(dá),結(jié)果顯示,與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞ROS含量明顯升高(P<0.05),與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p組ROS含量明顯降低(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示,與control組比較,H/R組心肌細(xì)胞MDA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),SOD和GSH表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p組MDA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),SOD和GSH表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。詳見圖3、表2。

圖3 各組H9c2細(xì)胞ROS的熒光染色圖(DHE染色法,×200)

表2 各組H9c2細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量的比較

2.5 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-141-3p靶向調(diào)控Keap1表達(dá) TargetScan等生物學(xué)信息軟件預(yù)測結(jié)果顯示,Keap1是miR-141-3p的潛在靶基因。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,質(zhì)粒與miR-NC或miR-141-3p mimics共轉(zhuǎn)染入H/R模型H9c2細(xì)胞后,與miR-NC組比較,miR-141-3p mimics組WT Keap1熒光素酶的活力值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-141-3p mimics組MUT Keap1熒光素酶的活力值無明顯變化,證明miR-141-3p靶向結(jié)合Keap1的3′UTR。Western Blotting進(jìn)一步驗(yàn)證miR-141-3p與Keap1的靶向調(diào)控關(guān)系,結(jié)果顯示,miR-141-3p mimics組H9c2心肌細(xì)胞中Keap1蛋白表達(dá)明顯低于miR-NC組(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 miR-NC組與miR-141-3p mimics組Keap1表達(dá)雙熒光素酶報(bào)告

與miR-NC組比較,＊P<0.05

2.6 miR-141-3p過表達(dá)對H/R模型H9c2細(xì)胞Nrf2/HO-1通路的影響 Western Blotting結(jié)果顯示,與control組比較,H/R組Nrf2、HO-1蛋白水平明顯降低(P<0.05);與H/R+miR-NC組比較,H/R+miR-141-3p組Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高(P<0.05)。詳見圖6、表3。

圖6 各組H9c2細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的條帶圖

表3 各組Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

急性心肌梗死是導(dǎo)致慢性心力衰竭的首要原因,也是死亡率較高的不良心血管事件之一[5]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等治療方法的廣泛開展,明顯降低了急性心肌梗死的死亡率,但由于缺血再灌注治療引發(fā)的心肌損傷和心臟重塑嚴(yán)重影響病人預(yù)后,Maeda等[6]研究顯示,缺血再灌注造成的心肌損傷程度甚至可能遠(yuǎn)高于缺血造成的損傷。近期研究證實(shí),氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡可能是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制,其中ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌線粒體功能障礙,并與其他機(jī)制相互作用,是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[7]。本研究結(jié)果顯示,H9c2細(xì)胞發(fā)生H/R后,心肌細(xì)胞ROS和MDA水平明顯升高,GSH和SOD水平明顯降低,細(xì)胞存活率明顯下降,凋亡率明顯增加,提示心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡是缺血再灌注損傷進(jìn)展的關(guān)鍵,減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡對防治心肌缺血再灌注損傷具有重要的意義。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA,可通過靶向結(jié)合靶基因mRNA,從而調(diào)控目的基因的表達(dá),參與心肌缺血再灌注的信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞的存活和凋亡。秦少強(qiáng)等[8]通過構(gòu)建心肌細(xì)胞H/R損傷模型,證實(shí)miR-202-5p靶向下調(diào)SOX6減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激,促進(jìn)細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡。作為miRNA家族成員之一,miR-141-3p是一種內(nèi)皮細(xì)胞中豐富表達(dá)的miRNA,與心肌細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和間充質(zhì)干細(xì)胞衰老等有關(guān)[9-10],尹嵐軒[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-141-3p在內(nèi)毒素血癥大鼠心肌組織中下調(diào)表達(dá),其可能與心肌損傷發(fā)生有關(guān),Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-141-3p模擬物可通過靶向Wnt5a減輕動(dòng)脈粥樣硬化模型細(xì)胞的增殖和遷移,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。但miR-141-3p在心肌H/R病理過程的作用機(jī)制尚未完全闡明,本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測H/R模型H9c2細(xì)胞中miR-141-3p的表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-141-3p表達(dá)減低,進(jìn)一步通過細(xì)胞凋亡、CCK-8等實(shí)驗(yàn)證實(shí),外源性上調(diào)miR-141-3p可提高H/R模型H9c2細(xì)胞的存活率,抑制心肌細(xì)胞凋亡。

Nrf2/HO-1是機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要通路,Keap1是Nrf2 的負(fù)調(diào)控因子[13]。正常生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1結(jié)合并游離在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)細(xì)胞受到氧化物攻擊時(shí),Nrf2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核,造成Nrf2/HO-1通路的激活,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。Wang等[14]研究證實(shí)過表達(dá)miR-200a或si-Keap1可降低脊髓損傷大鼠MDA水平,增加SOD活性和Nrf2表達(dá)及其下游HO-1等蛋白表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,Chen等[15]研究證實(shí),si-Keap1可抑制高糖介導(dǎo)的ROS積累,活化Nrf2/ARE信號(hào)通路,減輕氧化應(yīng)激損傷。Holmstr?m等[16]研究發(fā)現(xiàn),Nrf2敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的線粒體膜電位和三磷酸腺苷(ATP)合成水平與野生型小鼠細(xì)胞比較均出現(xiàn)降低,通過藥理途徑增強(qiáng)Nrf2的活化,可以保護(hù)大鼠免受氧化應(yīng)激損傷。本研究通過數(shù)據(jù)庫篩查和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),Keap1是miR-141-3p的下游靶基因,并且通過Western Blotting證實(shí)miR-141-3p可負(fù)性調(diào)控Keap1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,外源性上調(diào)miR-141-3p可抑制Keap1的表達(dá),降低心肌細(xì)胞ROS和MDA水平,增加GSH和SOD水平,激活Nrf2/HO-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而通過減輕H/R模型H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述,miR-141-3p可通過負(fù)向調(diào)控Keap1減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,抑制心肌細(xì)胞凋亡,miR-141-3p和Keap1有望成為干預(yù)心肌細(xì)胞H/R的臨床治療新靶點(diǎn)。