李 欠，姬黨通，高 慧

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070

獨(dú)活為傘形科當(dāng)歸屬藥用植物，根據(jù)《中國(guó)藥典》記載，其為重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根[1]。獨(dú)活作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，始載于東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有幾千年的用藥歷史，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、解表等功效。獨(dú)活藥材已在醫(yī)療、保健、植保和美容化妝等領(lǐng)域取得廣泛應(yīng)用。研究表明，獨(dú)活含有香豆素、揮發(fā)油、多糖和有機(jī)酸等多種成分，其中香豆素類(lèi)成分為其主要成分，具有抗炎、抗凝血、抗癌多種藥理活性[2-7]?！吨袊?guó)藥典》2020 年版將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作為獨(dú)活質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

目前，常采用色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)對(duì)藥材中的化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量分析和質(zhì)量控制[8-10]，在藥材樣品前處理過(guò)程中，樣品提取液中的部分代謝物會(huì)損失，導(dǎo)致在使用該技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)，造成化學(xué)成分檢出程度低。除此之外，常用的技術(shù)手段也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)藥材中代謝物的組織空間分布特征的可視化分析。基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜成像技術(shù)是一種新型的分子成像和原位檢測(cè)技術(shù)，具有免標(biāo)記，高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于植物代謝物分析和組織分布研究等方面[11-15]。本課題組在前期的研究中采用一測(cè)多評(píng)法，定量核磁共振波譜法和熒光成像法分析了了獨(dú)活中香豆素類(lèi)化合物含量和分布特征[16-18]。本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry imaging，MALDI-TOF-MS）技術(shù)探討建立一種可視化原位分析獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)化學(xué)成分空間分布特征的新方法，為獨(dú)活代謝物的提取分離、鑒定及探索代謝物的空間信息提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

iMScope TRIO 型質(zhì)譜成像顯微鏡（日本島津公司），iMLayer 基質(zhì)噴涂?jī)x（Shimadzu，Kyoto，日本），氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電載玻片（德國(guó)Bruker公司），CM1950 冷凍切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司），Agilent 7890B-7000D 型三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 試劑

2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、9-氨基吖啶（9-aminoacridineare，9AA）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，OCT 包埋劑，蛇床子素（批號(hào)18032005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號(hào)19091001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、歐前胡素（批號(hào)18051502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、氧化前胡素（批號(hào)1y27s9s65152，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜醇）。

1.3 樣品

新鮮獨(dú)活藥材采集于甘肅省華亭市馬峽鎮(zhèn)趙莊村兩年生人工栽培獨(dú)活，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳垣教授鑒定為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸A.pubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan。前期通過(guò)熒光成像分析研究[18]，10 月份是獨(dú)活根中香豆素含量相對(duì)較高的時(shí)期，因此本研究選擇該時(shí)期的獨(dú)活根進(jìn)行質(zhì)譜分析和成像研究。

2 方法

2.1 質(zhì)譜成像樣品的制備

將新鮮獨(dú)活根清洗干凈，取獨(dú)活主根中段橫切成小段（約0.5 cm）。然后將其用OCT 包埋膠包埋。采用冷凍切片機(jī)將其切成厚度為25 μm 的獨(dú)活根組織切片[18]。再單獨(dú)剝下獨(dú)活的根皮，最終將切片和根皮負(fù)載至ITO 導(dǎo)電玻璃上，真空干燥。

2.2 GC-MS 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

將獨(dú)活根在40 ℃條件下進(jìn)行干燥處理，粉碎后過(guò)40 目篩。取獨(dú)活藥材粉末材粉末約5 g，精密稱(chēng)定后置于250 mL 蒸餾瓶中，加入甲醇50 mL 后稱(chēng)定總質(zhì)量。藥材粉末經(jīng)甲醇浸泡30 min 后，采用超聲波輔助提取40 min，超聲波儀器功率為400 W，頻率為40 kHz，經(jīng)過(guò)濾得提取液。提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后用于GC-MS 分析。

2.3 基質(zhì)和對(duì)照品溶液的制備

以70%的甲醇水溶液為溶劑，將CHCA、DHB和9AA 分別配制成10 mg/mL 的基質(zhì)溶液；將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素和氧化前胡素等對(duì)照品配制成1 mg/mL 對(duì)照品混合溶液。

取1 μL 混合對(duì)照品溶液滴加至靶板上，待樣品點(diǎn)溶劑揮發(fā)干燥后，然后分別滴加1 μL 基質(zhì)溶液，使之覆蓋樣品點(diǎn)，干燥后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

2.4 基質(zhì)的噴涂

采用升華噴涂的方法將基質(zhì)噴涂于組織切片上，條件如下：基質(zhì)DHB、9-AA 和CHCA 質(zhì)量為300 mg，厚度為0.5 μm，溫度分別為180、220、250 ℃。

2.5 MALDI-TOF-MS 分析

首先將組織切片放置于圖像掃描儀中進(jìn)行拍照和成像定位，然后將噴涂基質(zhì)的組織切片置于MALDI-TOF-MS 型質(zhì)譜成像儀中分別在正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行成像分析研究。

MALDI-TOF-MSI 數(shù)據(jù)是使用成像質(zhì)譜儀（島津iMScope TRIO）獲得的，該質(zhì)譜儀配備有內(nèi)部光學(xué)顯微鏡和355 nm Nd: YAG 激光源。

使用Imaging MS Solution version 1.30 軟件（島津）記錄和分析分子圖像。經(jīng)條件優(yōu)化后，在正電離模式下測(cè)量m/z100～500 的離子。激光直徑設(shè)置為 1（約10 μm，是 iMScope 的任意單位）。MALDI-TOF-MSI 的其他相關(guān)參數(shù)如下：探測(cè)器電壓1.87 kV；采樣電壓3.50 kV；累計(jì)1 次/像素；激光重復(fù)頻率1000 Hz；激光射擊80 次；間距為（35×35）μm2；激光強(qiáng)度為25。

2.6 GC-MS 分析

2.6.1 氣相色譜條件 色譜柱HB-23毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，分流比5∶1，體積流量1 mL/min。35～150 ℃，升溫速度為8 ℃/min，升至150 ℃后保持1 min；150～250 ℃，升溫速度為4 ℃/min，升溫至250 ℃后保持12 min。

2.6.2 質(zhì)譜條件 進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI 源，電子能量為70 eV；離子檢測(cè)模式：選擇性離子檢測(cè)（selected ion monitor，SIM）；掃描范圍m/z50～650。

3 結(jié)果與分析

3.1 基質(zhì)的選擇與優(yōu)化

在基質(zhì)輔助的質(zhì)譜成像研究過(guò)程中，基質(zhì)的選擇是至關(guān)重要的?；|(zhì)不僅會(huì)影響待分析物的解析、離子化，還會(huì)影響成像效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]獨(dú)活富含香豆素類(lèi)化合物，其中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素等成分含量較高。本研究以上述化合物為對(duì)照品分別在正、負(fù)2 種離子檢測(cè)模式下對(duì)基質(zhì)DHB、9-AA和CHCA 進(jìn)行篩選。由圖1 可知，DHB 和9-AA 基質(zhì)會(huì)影響蛇床子素的離子化程度，并且對(duì)分析物的質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生干擾。結(jié)果表明CHAA 適合蛇床子素和其他香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像分析。由圖2 可知，正、負(fù)2 種離子模式檢測(cè)條件下，正離子模式下檢出的化合物種類(lèi)多，分析物離子峰的相對(duì)峰強(qiáng)度更高。因此本研究在正離子檢測(cè)模式下選擇CHCA 進(jìn)行獨(dú)活質(zhì)譜成像分析。

圖1 蛇床子素在不同基質(zhì)下的信號(hào)強(qiáng)度Fig. 1 Signal intensity of osthol in different substrates

圖2 CHCA 基質(zhì)輔助下混合對(duì)照品在正 (A) 和 負(fù) (B) 離子模式下質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of mixed reference substance in positive (A) and negative (B) ion modes assisted by CHCA matrix

3.2 獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)化合物的MALDITOF-MS 質(zhì)譜成像分析

本研究在正離子模式下對(duì)獨(dú)活根和根皮進(jìn)行MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜成像分析，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 獨(dú)活鮮根 (A) 和根皮 (B) 的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of roots (A) and root bark (B) of Angelica pubescens

由表1 可知，在CHCA 作為基質(zhì)，正離子模式下經(jīng)MALDI 質(zhì)譜成像分析，獨(dú)活根及根皮分別鑒定出25 和28 個(gè)香豆素類(lèi)成分[5,18-28]。其中歐前胡素和異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、花椒毒素和佛手苷內(nèi)酯分別為同分異構(gòu)體，由文獻(xiàn)報(bào)道[28]可知，這些同分異構(gòu)體均存在于獨(dú)活中，僅僅通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)無(wú)法區(qū)分它們，必須與核磁共振等技術(shù)手段結(jié)合才能鑒別。在鑒定出的28 個(gè)化學(xué)成分中，二氫歐山芹醇、月橘香豆素、異茴芹內(nèi)酯和橙皮內(nèi)酯水合物僅在根皮中檢測(cè)到，未在根橫切片面組織切片中檢測(cè)到上述化合物的特征離子。獨(dú)活根組織在制備切片過(guò)程中受到了一定程度的破壞，影響了切片的完整度，導(dǎo)致未檢測(cè)出部分化合物的質(zhì)譜信號(hào)。本研究還采用GC-MS 分析手段分析了獨(dú)活根的提取物中的成分。根中分析鑒定出了59 種化合物，包括香豆素類(lèi)化合物、醇酚類(lèi)化合物、酯類(lèi)化合物、烯烴類(lèi)化合物和脂肪酸類(lèi)化合物。其中香豆素類(lèi)化合物為主要化合物（表2），蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素和橙皮內(nèi)酯等與質(zhì)譜成像分析結(jié)果一致。面積歸一法定量結(jié)果表明，蛇床子素為最主要成分，占31.62%，總香豆素占比超過(guò)40%。

表1 獨(dú)活鮮根及根皮中香豆素類(lèi)化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of coumarins in the roots and roots bark at A. pubescens

續(xù)表1

表2 獨(dú)活化學(xué)成分分析Table 2 Chemical composition analysis of A. pubescens

3.3 獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)成分的空間分布特征

獨(dú)活中化學(xué)成分的研究集中于香豆素類(lèi)化合物，主要包括：以蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和二氫歐山芹醇乙酸酯等為代表的化學(xué)成分。在優(yōu)化的條件下，將制備好的獨(dú)活根組織切片噴涂基質(zhì)后進(jìn)行MALDI 質(zhì)譜成像分析，在分析軟件中靶向提取香豆素類(lèi)化合物的離子類(lèi)型，離子峰通過(guò)質(zhì)譜成像圖的構(gòu)建，其中香豆素類(lèi)化合物代表性成分的質(zhì)譜成像圖如圖4～6 所示。由圖4 可知，獨(dú)活根中以蛇床子素為代表性香豆素類(lèi)化合物的分布與熒光成像分析結(jié)果基本一致，主要分布在分泌腔、分泌道等分泌組織中。其中蛇床子素（[M＋H]+，m/z245.12）、東莨菪內(nèi)酯（[M＋K]+，m/z231.14）、白花前胡醇（[M＋Na]+，m/z301.10）、紫花前胡素（[M＋Na]+，m/z359.06）、佛手酚（[M＋K]+，m/z241.09）和川白芷素（[M＋H]+，m/z229.09）等在韌皮部分泌腔中的強(qiáng)度最高，在其他部位也有少量分布。

圖5 分泌腔外香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 5 Mass spectrometry image of coumarin compounds out of secretory cavity

圖6 獨(dú)活鮮根中香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 6 Mass spectrometry image of coumarin compounds in A. pubescens fresh roots

由圖5 可知，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（[M＋Na]+，m/z245.12）、二氫歐山芹醇乙酸酯（[M＋H]+，m/z291.11）、白當(dāng)歸素（M，m/z336.11）和新比克白芷內(nèi)酯（[M＋H]+，m/z317.10）與上述化合物不同，在分泌腔中強(qiáng)度最低，主要分布在除分泌腔以外的木質(zhì)部和韌皮部。此外，這4 種成分根皮部位的離子強(qiáng)度較大，含量較高。

如圖6 所示，歐芹酚（[M＋Na]+，m/z254.09）等其他成分在整個(gè)根部分布較為均勻，無(wú)明顯差異。

4 討論

傳統(tǒng)的GC/LC-MS技術(shù)需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行勻漿，導(dǎo)致被分析物的空間信息丟失；此外，天然活性成分通常需要使用有機(jī)溶劑從植物中提取出來(lái)進(jìn)行分析，耗時(shí)耗力，還容易造成不穩(wěn)定成分的分解。MALDI-TOF-MSI 技術(shù)作為一種重要的分子成像技術(shù)，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽和小分子代謝物的組織分布研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用CHCA 作為基質(zhì)，正離子模式下實(shí)現(xiàn)了獨(dú)活根中香豆素類(lèi)成分的質(zhì)譜成像分析，檢測(cè)到28 個(gè)香豆素類(lèi)成分，并得到其空間分布信息。通過(guò)質(zhì)譜成像可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)香豆素化合物空間分布特征的研究，為獨(dú)活的鑒定、提取分離等研究提供指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突