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        基于質(zhì)譜成像技術(shù)的獨(dú)活鮮根中香豆素類(lèi)成分的空間分布特征研究

        2023-06-08 12:21:20姬黨通
        中草藥 2023年11期
        關(guān)鍵詞:胡素蛇床子香豆素

        李 欠,姬黨通,高 慧

        甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070

        獨(dú)活為傘形科當(dāng)歸屬藥用植物,根據(jù)《中國(guó)藥典》記載,其為重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根[1]。獨(dú)活作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥,始載于東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》,已有幾千年的用藥歷史,具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、解表等功效。獨(dú)活藥材已在醫(yī)療、保健、植保和美容化妝等領(lǐng)域取得廣泛應(yīng)用。研究表明,獨(dú)活含有香豆素、揮發(fā)油、多糖和有機(jī)酸等多種成分,其中香豆素類(lèi)成分為其主要成分,具有抗炎、抗凝血、抗癌多種藥理活性[2-7]?!吨袊?guó)藥典》2020 年版將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作為獨(dú)活質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

        目前,常采用色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)對(duì)藥材中的化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量分析和質(zhì)量控制[8-10],在藥材樣品前處理過(guò)程中,樣品提取液中的部分代謝物會(huì)損失,導(dǎo)致在使用該技術(shù)進(jìn)行分析時(shí),造成化學(xué)成分檢出程度低。除此之外,常用的技術(shù)手段也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)藥材中代謝物的組織空間分布特征的可視化分析。基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜成像技術(shù)是一種新型的分子成像和原位檢測(cè)技術(shù),具有免標(biāo)記,高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于植物代謝物分析和組織分布研究等方面[11-15]。本課題組在前期的研究中采用一測(cè)多評(píng)法,定量核磁共振波譜法和熒光成像法分析了了獨(dú)活中香豆素類(lèi)化合物含量和分布特征[16-18]。本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜成像(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry imaging,MALDI-TOF-MS)技術(shù)探討建立一種可視化原位分析獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)化學(xué)成分空間分布特征的新方法,為獨(dú)活代謝物的提取分離、鑒定及探索代謝物的空間信息提供一定的參考。

        1 材料與儀器

        1.1 儀器

        iMScope TRIO 型質(zhì)譜成像顯微鏡(日本島津公司),iMLayer 基質(zhì)噴涂?jī)x(Shimadzu,Kyoto,日本),氧化銦錫(ITO)導(dǎo)電載玻片(德國(guó)Bruker公司),CM1950 冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司),Agilent 7890B-7000D 型三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)。

        1.2 試劑

        2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid,DHB)、9-氨基吖啶(9-aminoacridineare,9AA)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司,OCT 包埋劑,蛇床子素(批號(hào)18032005,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯(批號(hào)19091001,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、歐前胡素(批號(hào)18051502,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、氧化前胡素(批號(hào)1y27s9s65152,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司;甲醇(色譜醇)。

        1.3 樣品

        新鮮獨(dú)活藥材采集于甘肅省華亭市馬峽鎮(zhèn)趙莊村兩年生人工栽培獨(dú)活,經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳垣教授鑒定為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸A.pubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan。前期通過(guò)熒光成像分析研究[18],10 月份是獨(dú)活根中香豆素含量相對(duì)較高的時(shí)期,因此本研究選擇該時(shí)期的獨(dú)活根進(jìn)行質(zhì)譜分析和成像研究。

        2 方法

        2.1 質(zhì)譜成像樣品的制備

        將新鮮獨(dú)活根清洗干凈,取獨(dú)活主根中段橫切成小段(約0.5 cm)。然后將其用OCT 包埋膠包埋。采用冷凍切片機(jī)將其切成厚度為25 μm 的獨(dú)活根組織切片[18]。再單獨(dú)剝下獨(dú)活的根皮,最終將切片和根皮負(fù)載至ITO 導(dǎo)電玻璃上,真空干燥。

        2.2 GC-MS 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

        將獨(dú)活根在40 ℃條件下進(jìn)行干燥處理,粉碎后過(guò)40 目篩。取獨(dú)活藥材粉末材粉末約5 g,精密稱(chēng)定后置于250 mL 蒸餾瓶中,加入甲醇50 mL 后稱(chēng)定總質(zhì)量。藥材粉末經(jīng)甲醇浸泡30 min 后,采用超聲波輔助提取40 min,超聲波儀器功率為400 W,頻率為40 kHz,經(jīng)過(guò)濾得提取液。提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后用于GC-MS 分析。

        2.3 基質(zhì)和對(duì)照品溶液的制備

        以70%的甲醇水溶液為溶劑,將CHCA、DHB和9AA 分別配制成10 mg/mL 的基質(zhì)溶液;將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素和氧化前胡素等對(duì)照品配制成1 mg/mL 對(duì)照品混合溶液。

        取1 μL 混合對(duì)照品溶液滴加至靶板上,待樣品點(diǎn)溶劑揮發(fā)干燥后,然后分別滴加1 μL 基質(zhì)溶液,使之覆蓋樣品點(diǎn),干燥后進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

        2.4 基質(zhì)的噴涂

        采用升華噴涂的方法將基質(zhì)噴涂于組織切片上,條件如下:基質(zhì)DHB、9-AA 和CHCA 質(zhì)量為300 mg,厚度為0.5 μm,溫度分別為180、220、250 ℃。

        2.5 MALDI-TOF-MS 分析

        首先將組織切片放置于圖像掃描儀中進(jìn)行拍照和成像定位,然后將噴涂基質(zhì)的組織切片置于MALDI-TOF-MS 型質(zhì)譜成像儀中分別在正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行成像分析研究。

        MALDI-TOF-MSI 數(shù)據(jù)是使用成像質(zhì)譜儀(島津iMScope TRIO)獲得的,該質(zhì)譜儀配備有內(nèi)部光學(xué)顯微鏡和355 nm Nd: YAG 激光源。

        使用Imaging MS Solution version 1.30 軟件(島津)記錄和分析分子圖像。經(jīng)條件優(yōu)化后,在正電離模式下測(cè)量m/z100~500 的離子。激光直徑設(shè)置為 1(約10 μm,是 iMScope 的任意單位)。MALDI-TOF-MSI 的其他相關(guān)參數(shù)如下:探測(cè)器電壓1.87 kV;采樣電壓3.50 kV;累計(jì)1 次/像素;激光重復(fù)頻率1000 Hz;激光射擊80 次;間距為(35×35)μm2;激光強(qiáng)度為25。

        2.6 GC-MS 分析

        2.6.1 氣相色譜條件 色譜柱HB-23毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氦氣,分流比5∶1,體積流量1 mL/min。35~150 ℃,升溫速度為8 ℃/min,升至150 ℃后保持1 min;150~250 ℃,升溫速度為4 ℃/min,升溫至250 ℃后保持12 min。

        2.6.2 質(zhì)譜條件 進(jìn)樣口溫度250 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;電離方式為EI 源,電子能量為70 eV;離子檢測(cè)模式:選擇性離子檢測(cè)(selected ion monitor,SIM);掃描范圍m/z50~650。

        3 結(jié)果與分析

        3.1 基質(zhì)的選擇與優(yōu)化

        在基質(zhì)輔助的質(zhì)譜成像研究過(guò)程中,基質(zhì)的選擇是至關(guān)重要的?;|(zhì)不僅會(huì)影響待分析物的解析、離子化,還會(huì)影響成像效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]獨(dú)活富含香豆素類(lèi)化合物,其中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素等成分含量較高。本研究以上述化合物為對(duì)照品分別在正、負(fù)2 種離子檢測(cè)模式下對(duì)基質(zhì)DHB、9-AA和CHCA 進(jìn)行篩選。由圖1 可知,DHB 和9-AA 基質(zhì)會(huì)影響蛇床子素的離子化程度,并且對(duì)分析物的質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生干擾。結(jié)果表明CHAA 適合蛇床子素和其他香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像分析。由圖2 可知,正、負(fù)2 種離子模式檢測(cè)條件下,正離子模式下檢出的化合物種類(lèi)多,分析物離子峰的相對(duì)峰強(qiáng)度更高。因此本研究在正離子檢測(cè)模式下選擇CHCA 進(jìn)行獨(dú)活質(zhì)譜成像分析。

        圖1 蛇床子素在不同基質(zhì)下的信號(hào)強(qiáng)度Fig. 1 Signal intensity of osthol in different substrates

        圖2 CHCA 基質(zhì)輔助下混合對(duì)照品在正 (A) 和 負(fù) (B) 離子模式下質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of mixed reference substance in positive (A) and negative (B) ion modes assisted by CHCA matrix

        3.2 獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)化合物的MALDITOF-MS 質(zhì)譜成像分析

        本研究在正離子模式下對(duì)獨(dú)活根和根皮進(jìn)行MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜成像分析,質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。

        圖3 獨(dú)活鮮根 (A) 和根皮 (B) 的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of roots (A) and root bark (B) of Angelica pubescens

        由表1 可知,在CHCA 作為基質(zhì),正離子模式下經(jīng)MALDI 質(zhì)譜成像分析,獨(dú)活根及根皮分別鑒定出25 和28 個(gè)香豆素類(lèi)成分[5,18-28]。其中歐前胡素和異歐前胡素、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、花椒毒素和佛手苷內(nèi)酯分別為同分異構(gòu)體,由文獻(xiàn)報(bào)道[28]可知,這些同分異構(gòu)體均存在于獨(dú)活中,僅僅通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)無(wú)法區(qū)分它們,必須與核磁共振等技術(shù)手段結(jié)合才能鑒別。在鑒定出的28 個(gè)化學(xué)成分中,二氫歐山芹醇、月橘香豆素、異茴芹內(nèi)酯和橙皮內(nèi)酯水合物僅在根皮中檢測(cè)到,未在根橫切片面組織切片中檢測(cè)到上述化合物的特征離子。獨(dú)活根組織在制備切片過(guò)程中受到了一定程度的破壞,影響了切片的完整度,導(dǎo)致未檢測(cè)出部分化合物的質(zhì)譜信號(hào)。本研究還采用GC-MS 分析手段分析了獨(dú)活根的提取物中的成分。根中分析鑒定出了59 種化合物,包括香豆素類(lèi)化合物、醇酚類(lèi)化合物、酯類(lèi)化合物、烯烴類(lèi)化合物和脂肪酸類(lèi)化合物。其中香豆素類(lèi)化合物為主要化合物(表2),蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、花椒毒素、補(bǔ)骨脂素和橙皮內(nèi)酯等與質(zhì)譜成像分析結(jié)果一致。面積歸一法定量結(jié)果表明,蛇床子素為最主要成分,占31.62%,總香豆素占比超過(guò)40%。

        表1 獨(dú)活鮮根及根皮中香豆素類(lèi)化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of coumarins in the roots and roots bark at A. pubescens

        續(xù)表1

        表2 獨(dú)活化學(xué)成分分析Table 2 Chemical composition analysis of A. pubescens

        3.3 獨(dú)活根組織中香豆素類(lèi)成分的空間分布特征

        獨(dú)活中化學(xué)成分的研究集中于香豆素類(lèi)化合物,主要包括:以蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和二氫歐山芹醇乙酸酯等為代表的化學(xué)成分。在優(yōu)化的條件下,將制備好的獨(dú)活根組織切片噴涂基質(zhì)后進(jìn)行MALDI 質(zhì)譜成像分析,在分析軟件中靶向提取香豆素類(lèi)化合物的離子類(lèi)型,離子峰通過(guò)質(zhì)譜成像圖的構(gòu)建,其中香豆素類(lèi)化合物代表性成分的質(zhì)譜成像圖如圖4~6 所示。由圖4 可知,獨(dú)活根中以蛇床子素為代表性香豆素類(lèi)化合物的分布與熒光成像分析結(jié)果基本一致,主要分布在分泌腔、分泌道等分泌組織中。其中蛇床子素([M+H]+,m/z245.12)、東莨菪內(nèi)酯([M+K]+,m/z231.14)、白花前胡醇([M+Na]+,m/z301.10)、紫花前胡素([M+Na]+,m/z359.06)、佛手酚([M+K]+,m/z241.09)和川白芷素([M+H]+,m/z229.09)等在韌皮部分泌腔中的強(qiáng)度最高,在其他部位也有少量分布。

        圖5 分泌腔外香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 5 Mass spectrometry image of coumarin compounds out of secretory cavity

        圖6 獨(dú)活鮮根中香豆素類(lèi)化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 6 Mass spectrometry image of coumarin compounds in A. pubescens fresh roots

        由圖5 可知,二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯([M+Na]+,m/z245.12)、二氫歐山芹醇乙酸酯([M+H]+,m/z291.11)、白當(dāng)歸素(M,m/z336.11)和新比克白芷內(nèi)酯([M+H]+,m/z317.10)與上述化合物不同,在分泌腔中強(qiáng)度最低,主要分布在除分泌腔以外的木質(zhì)部和韌皮部。此外,這4 種成分根皮部位的離子強(qiáng)度較大,含量較高。

        如圖6 所示,歐芹酚([M+Na]+,m/z254.09)等其他成分在整個(gè)根部分布較為均勻,無(wú)明顯差異。

        4 討論

        傳統(tǒng)的GC/LC-MS技術(shù)需要對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行勻漿,導(dǎo)致被分析物的空間信息丟失;此外,天然活性成分通常需要使用有機(jī)溶劑從植物中提取出來(lái)進(jìn)行分析,耗時(shí)耗力,還容易造成不穩(wěn)定成分的分解。MALDI-TOF-MSI 技術(shù)作為一種重要的分子成像技術(shù),具有樣品前處理簡(jiǎn)單、免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢(shì),被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽和小分子代謝物的組織分布研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用CHCA 作為基質(zhì),正離子模式下實(shí)現(xiàn)了獨(dú)活根中香豆素類(lèi)成分的質(zhì)譜成像分析,檢測(cè)到28 個(gè)香豆素類(lèi)成分,并得到其空間分布信息。通過(guò)質(zhì)譜成像可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)香豆素化合物空間分布特征的研究,為獨(dú)活的鑒定、提取分離等研究提供指導(dǎo)。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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