李 欠，姬黨通，高 慧

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070

獨活為傘形科當(dāng)歸屬藥用植物，根據(jù)《中國藥典》記載，其為重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根[1]。獨活作為中國傳統(tǒng)中藥，始載于東漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，已有幾千年的用藥歷史，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛、解表等功效。獨活藥材已在醫(yī)療、保健、植保和美容化妝等領(lǐng)域取得廣泛應(yīng)用。研究表明，獨活含有香豆素、揮發(fā)油、多糖和有機酸等多種成分，其中香豆素類成分為其主要成分，具有抗炎、抗凝血、抗癌多種藥理活性[2-7]?！吨袊幍洹?020 年版將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作為獨活質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

目前，常采用色譜和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)對藥材中的化學(xué)成分進行定性、定量分析和質(zhì)量控制[8-10]，在藥材樣品前處理過程中，樣品提取液中的部分代謝物會損失，導(dǎo)致在使用該技術(shù)進行分析時，造成化學(xué)成分檢出程度低。除此之外，常用的技術(shù)手段也無法實現(xiàn)對藥材中代謝物的組織空間分布特征的可視化分析。基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜成像技術(shù)是一種新型的分子成像和原位檢測技術(shù)，具有免標(biāo)記，高靈敏度和高通量等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于植物代謝物分析和組織分布研究等方面[11-15]。本課題組在前期的研究中采用一測多評法，定量核磁共振波譜法和熒光成像法分析了了獨活中香豆素類化合物含量和分布特征[16-18]。本研究采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry imaging，MALDI-TOF-MS）技術(shù)探討建立一種可視化原位分析獨活根組織中香豆素類化學(xué)成分空間分布特征的新方法，為獨活代謝物的提取分離、鑒定及探索代謝物的空間信息提供一定的參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

iMScope TRIO 型質(zhì)譜成像顯微鏡（日本島津公司），iMLayer 基質(zhì)噴涂儀（Shimadzu，Kyoto，日本），氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電載玻片（德國Bruker公司），CM1950 冷凍切片機（德國Leica 公司），Agilent 7890B-7000D 型三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試劑

2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）、9-氨基吖啶（9-aminoacridineare，9AA）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）購于美國Sigma 公司，OCT 包埋劑，蛇床子素（批號18032005，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（批號19091001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、歐前胡素（批號18051502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、氧化前胡素（批號1y27s9s65152，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜醇）。

1.3 樣品

新鮮獨活藥材采集于甘肅省華亭市馬峽鎮(zhèn)趙莊村兩年生人工栽培獨活，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院陳垣教授鑒定為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸A.pubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan。前期通過熒光成像分析研究[18]，10 月份是獨活根中香豆素含量相對較高的時期，因此本研究選擇該時期的獨活根進行質(zhì)譜分析和成像研究。

2 方法

2.1 質(zhì)譜成像樣品的制備

將新鮮獨活根清洗干凈，取獨活主根中段橫切成小段（約0.5 cm）。然后將其用OCT 包埋膠包埋。采用冷凍切片機將其切成厚度為25 μm 的獨活根組織切片[18]。再單獨剝下獨活的根皮，最終將切片和根皮負(fù)載至ITO 導(dǎo)電玻璃上，真空干燥。

2.2 GC-MS 實驗樣品的制備

將獨活根在40 ℃條件下進行干燥處理，粉碎后過40 目篩。取獨活藥材粉末材粉末約5 g，精密稱定后置于250 mL 蒸餾瓶中，加入甲醇50 mL 后稱定總質(zhì)量。藥材粉末經(jīng)甲醇浸泡30 min 后，采用超聲波輔助提取40 min，超聲波儀器功率為400 W，頻率為40 kHz，經(jīng)過濾得提取液。提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后用于GC-MS 分析。

2.3 基質(zhì)和對照品溶液的制備

以70%的甲醇水溶液為溶劑，將CHCA、DHB和9AA 分別配制成10 mg/mL 的基質(zhì)溶液；將蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素和氧化前胡素等對照品配制成1 mg/mL 對照品混合溶液。

取1 μL 混合對照品溶液滴加至靶板上，待樣品點溶劑揮發(fā)干燥后，然后分別滴加1 μL 基質(zhì)溶液，使之覆蓋樣品點，干燥后進行MALDI-TOF-MS分析。

2.4 基質(zhì)的噴涂

采用升華噴涂的方法將基質(zhì)噴涂于組織切片上，條件如下：基質(zhì)DHB、9-AA 和CHCA 質(zhì)量為300 mg，厚度為0.5 μm，溫度分別為180、220、250 ℃。

2.5 MALDI-TOF-MS 分析

首先將組織切片放置于圖像掃描儀中進行拍照和成像定位，然后將噴涂基質(zhì)的組織切片置于MALDI-TOF-MS 型質(zhì)譜成像儀中分別在正離子和負(fù)離子模式進行成像分析研究。

MALDI-TOF-MSI 數(shù)據(jù)是使用成像質(zhì)譜儀（島津iMScope TRIO）獲得的，該質(zhì)譜儀配備有內(nèi)部光學(xué)顯微鏡和355 nm Nd: YAG 激光源。

使用Imaging MS Solution version 1.30 軟件（島津）記錄和分析分子圖像。經(jīng)條件優(yōu)化后，在正電離模式下測量m/z100～500 的離子。激光直徑設(shè)置為 1（約10 μm，是 iMScope 的任意單位）。MALDI-TOF-MSI 的其他相關(guān)參數(shù)如下：探測器電壓1.87 kV；采樣電壓3.50 kV；累計1 次/像素；激光重復(fù)頻率1000 Hz；激光射擊80 次；間距為（35×35）μm2；激光強度為25。

2.6 GC-MS 分析

2.6.1 氣相色譜條件 色譜柱HB-23毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，分流比5∶1，體積流量1 mL/min。35～150 ℃，升溫速度為8 ℃/min，升至150 ℃后保持1 min；150～250 ℃，升溫速度為4 ℃/min，升溫至250 ℃后保持12 min。

2.6.2 質(zhì)譜條件 進樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI 源，電子能量為70 eV；離子檢測模式：選擇性離子檢測（selected ion monitor，SIM）；掃描范圍m/z50～650。

3 結(jié)果與分析

3.1 基質(zhì)的選擇與優(yōu)化

在基質(zhì)輔助的質(zhì)譜成像研究過程中，基質(zhì)的選擇是至關(guān)重要的?；|(zhì)不僅會影響待分析物的解析、離子化，還會影響成像效果。根據(jù)文獻報道[5]獨活富含香豆素類化合物，其中蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素等成分含量較高。本研究以上述化合物為對照品分別在正、負(fù)2 種離子檢測模式下對基質(zhì)DHB、9-AA和CHCA 進行篩選。由圖1 可知，DHB 和9-AA 基質(zhì)會影響蛇床子素的離子化程度，并且對分析物的質(zhì)譜信號產(chǎn)生干擾。結(jié)果表明CHAA 適合蛇床子素和其他香豆素類化合物的質(zhì)譜成像分析。由圖2 可知，正、負(fù)2 種離子模式檢測條件下，正離子模式下檢出的化合物種類多，分析物離子峰的相對峰強度更高。因此本研究在正離子檢測模式下選擇CHCA 進行獨活質(zhì)譜成像分析。

圖1 蛇床子素在不同基質(zhì)下的信號強度Fig. 1 Signal intensity of osthol in different substrates

圖2 CHCA 基質(zhì)輔助下混合對照品在正 (A) 和 負(fù) (B) 離子模式下質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectrum of mixed reference substance in positive (A) and negative (B) ion modes assisted by CHCA matrix

3.2 獨活根組織中香豆素類化合物的MALDITOF-MS 質(zhì)譜成像分析

本研究在正離子模式下對獨活根和根皮進行MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜成像分析，質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 獨活鮮根 (A) 和根皮 (B) 的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of roots (A) and root bark (B) of Angelica pubescens

由表1 可知，在CHCA 作為基質(zhì)，正離子模式下經(jīng)MALDI 質(zhì)譜成像分析，獨活根及根皮分別鑒定出25 和28 個香豆素類成分[5,18-28]。其中歐前胡素和異歐前胡素、補骨脂素和異補骨脂素、花椒毒素和佛手苷內(nèi)酯分別為同分異構(gòu)體，由文獻報道[28]可知，這些同分異構(gòu)體均存在于獨活中，僅僅通過質(zhì)譜技術(shù)無法區(qū)分它們，必須與核磁共振等技術(shù)手段結(jié)合才能鑒別。在鑒定出的28 個化學(xué)成分中，二氫歐山芹醇、月橘香豆素、異茴芹內(nèi)酯和橙皮內(nèi)酯水合物僅在根皮中檢測到，未在根橫切片面組織切片中檢測到上述化合物的特征離子。獨活根組織在制備切片過程中受到了一定程度的破壞，影響了切片的完整度，導(dǎo)致未檢測出部分化合物的質(zhì)譜信號。本研究還采用GC-MS 分析手段分析了獨活根的提取物中的成分。根中分析鑒定出了59 種化合物，包括香豆素類化合物、醇酚類化合物、酯類化合物、烯烴類化合物和脂肪酸類化合物。其中香豆素類化合物為主要化合物（表2），蛇床子素、二氫歐山芹素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、花椒毒素、補骨脂素和橙皮內(nèi)酯等與質(zhì)譜成像分析結(jié)果一致。面積歸一法定量結(jié)果表明，蛇床子素為最主要成分，占31.62%，總香豆素占比超過40%。

表1 獨活鮮根及根皮中香豆素類化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of coumarins in the roots and roots bark at A. pubescens

續(xù)表1

表2 獨活化學(xué)成分分析Table 2 Chemical composition analysis of A. pubescens

3.3 獨活根組織中香豆素類成分的空間分布特征

獨活中化學(xué)成分的研究集中于香豆素類化合物，主要包括：以蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯和二氫歐山芹醇乙酸酯等為代表的化學(xué)成分。在優(yōu)化的條件下，將制備好的獨活根組織切片噴涂基質(zhì)后進行MALDI 質(zhì)譜成像分析，在分析軟件中靶向提取香豆素類化合物的離子類型，離子峰通過質(zhì)譜成像圖的構(gòu)建，其中香豆素類化合物代表性成分的質(zhì)譜成像圖如圖4～6 所示。由圖4 可知，獨活根中以蛇床子素為代表性香豆素類化合物的分布與熒光成像分析結(jié)果基本一致，主要分布在分泌腔、分泌道等分泌組織中。其中蛇床子素（[M＋H]+，m/z245.12）、東莨菪內(nèi)酯（[M＋K]+，m/z231.14）、白花前胡醇（[M＋Na]+，m/z301.10）、紫花前胡素（[M＋Na]+，m/z359.06）、佛手酚（[M＋K]+，m/z241.09）和川白芷素（[M＋H]+，m/z229.09）等在韌皮部分泌腔中的強度最高，在其他部位也有少量分布。

圖5 分泌腔外香豆素類化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 5 Mass spectrometry image of coumarin compounds out of secretory cavity

圖6 獨活鮮根中香豆素類化合物的質(zhì)譜成像圖Fig. 6 Mass spectrometry image of coumarin compounds in A. pubescens fresh roots

由圖5 可知，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯（[M＋Na]+，m/z245.12）、二氫歐山芹醇乙酸酯（[M＋H]+，m/z291.11）、白當(dāng)歸素（M，m/z336.11）和新比克白芷內(nèi)酯（[M＋H]+，m/z317.10）與上述化合物不同，在分泌腔中強度最低，主要分布在除分泌腔以外的木質(zhì)部和韌皮部。此外，這4 種成分根皮部位的離子強度較大，含量較高。

如圖6 所示，歐芹酚（[M＋Na]+，m/z254.09）等其他成分在整個根部分布較為均勻，無明顯差異。

4 討論

傳統(tǒng)的GC/LC-MS技術(shù)需要對待測樣品進行勻漿，導(dǎo)致被分析物的空間信息丟失；此外，天然活性成分通常需要使用有機溶劑從植物中提取出來進行分析，耗時耗力，還容易造成不穩(wěn)定成分的分解。MALDI-TOF-MSI 技術(shù)作為一種重要的分子成像技術(shù)，具有樣品前處理簡單、免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏度和高通量等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽和小分子代謝物的組織分布研究。本實驗通過采用CHCA 作為基質(zhì)，正離子模式下實現(xiàn)了獨活根中香豆素類成分的質(zhì)譜成像分析，檢測到28 個香豆素類成分，并得到其空間分布信息。通過質(zhì)譜成像可以實現(xiàn)對單個香豆素化合物空間分布特征的研究，為獨活的鑒定、提取分離等研究提供指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突