王 暉, 李艷春, 高秋英, 張 玎, 鄭 研

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一種血液惡性腫瘤,在中老年人群發(fā)生率較高,其中以男性患者居多[1]。其發(fā)病機(jī)制是生成大量不成熟細(xì)胞,堆積于骨髓,導(dǎo)致骨髓造血功能障礙,臨床可表現(xiàn)為貧血、感染、出血等,以肝、脾腫大,以及消瘦、盜汗最為常見(jiàn)。臨床上常以基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的水平作為衡量腫瘤活性的標(biāo)準(zhǔn)[2]。MMP-2破壞細(xì)胞基膜,加快胞外基質(zhì)降解[3]。婆羅雙樹(shù)樣基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)是果蠅中婆羅雙樹(shù)基因同源基因SALL中的一類,含有鋅指結(jié)構(gòu)域的新反式作用因子,對(duì)于保護(hù)胚胎干細(xì)胞功能具有重要作用。SALL4位于染色體20q13.13-13.2區(qū)域,該區(qū)域突變通常與腫瘤發(fā)生有關(guān)[4]。血清α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性[5]。伊馬替尼屬于酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)抑制劑,對(duì)治療CML具有持久的血液和遺傳學(xué)反應(yīng),可有效緩解病情,是目前CML的一線治療藥物。干擾素可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,降低腫瘤基因的表達(dá)水平。重組人干擾素α-2b(recombinant human interferon α-2b,IFNα-2b)是CML的傳統(tǒng)治療藥物,但長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)降低治療效果。IFNα-2b與伊馬替尼聯(lián)合使用能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),提高療效[6]。然而,目前關(guān)于伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療加速期CML患者的研究尚少,其對(duì)血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平影響的研究更為鮮見(jiàn)。鑒此,本研究旨在探討伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療加速期CML患者的療效以及對(duì)血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平的影響,為優(yōu)化臨床CML的治療方案提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2017年1月至2021年1月陜西省人民醫(yī)院收治的加速期CML住院患者90例。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為觀察組(采用伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療,45例)和對(duì)照組(采用伊馬替尼治療,45例)。兩組基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):L164835),研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組基線資料比較

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)》[7]中關(guān)于CML的診斷標(biāo)準(zhǔn),Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因陽(yáng)性[8];(2)加速期CML患者,即原始細(xì)胞占比為10%～19%,外周血中嗜堿性粒細(xì)胞≥20%,對(duì)治療無(wú)反應(yīng)或非治療引起的持續(xù)血小板減少(<100×109/L)或增高(>1 000×109/L),治療過(guò)程中出現(xiàn)基于Ph染色體的克隆演化,呈現(xiàn)出進(jìn)行性脾增大或白細(xì)胞增高[9];(3)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他疾病,需使用與研究藥物可能存在相互作用的藥物;(2)近期接受過(guò)TK抑制劑治療且未過(guò)洗脫期;(3)合并吸收障礙或存在影響藥物吸收的其他疾病;(4)合并心、肝、腎等重要臟器疾病;(5)曾接受過(guò)造血干細(xì)胞移植術(shù);(6)妊娠期和哺乳期婦女。

1.3治療方法 對(duì)照組給予甲磺酸伊馬替尼片(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133200,規(guī)格0.1 g×12片)治療,初始治療劑量為400 mg/d,進(jìn)餐時(shí)服藥,1次/d,出現(xiàn)耐藥后(治療后效果不明顯),劑量增至600～800 mg/d。出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)(主要為胃腸道反應(yīng)導(dǎo)致的惡心嘔吐、腹痛腹脹等現(xiàn)象;骨髓抑制導(dǎo)致的白細(xì)胞下降、血小板降低;腫瘤破潰出血、肝腎功能損傷)則立即停藥。觀察組在對(duì)照組的治療基礎(chǔ)上給予IFNα-2b注射液(北京凱因科技股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字S20030030,規(guī)格0.3 ml∶300萬(wàn)IU),300萬(wàn)IU/次,隔天肌內(nèi)注射1次。兩組均持續(xù)治療6周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 臨床療效 參考《中國(guó)慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016年版)》[7],于治療期結(jié)束后進(jìn)行評(píng)估。(1)完全血液學(xué)緩解(complete hematological remission,CHR):P190和P210的BCR-ABL融合基因分別下降2.9和2.0個(gè)對(duì)數(shù);(2)完全細(xì)胞遺傳緩解(complete cytogenetic remission,CCyR):要求至少檢查20個(gè)有絲分裂中期相,未見(jiàn)Ph染色體;僅存在b2a2和(或)b3a2 BCR-ABL1轉(zhuǎn)錄本的患者進(jìn)行分子學(xué)緩解評(píng)估。(3)主要分子學(xué)反應(yīng)(major molecular response,MMR):BCR-ABL1轉(zhuǎn)錄本水平≤0.1%。

1.4.2 血清學(xué)指標(biāo) 于治療前后抽取患者空腹靜脈血5 ml,離心后取上清液。通過(guò)微孔板檢測(cè)器(北京諾匯誠(chéng)科技有限公司,Spark 10M)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及MMP-2水平。試劑盒均購(gòu)自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司,檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3 SALL4 mRNA表達(dá)水平 于治療前后抽取患者靜脈血2 ml,分別置于經(jīng)乙二胺四乙酸處理的15 ml無(wú)酶離心管內(nèi)。30 min內(nèi)進(jìn)行以下操作:在離心管內(nèi)加入3 ml紅細(xì)胞裂解液,輕輕振蕩混勻后靜置10 min,室溫下470×g離心5 min,棄上清液。重復(fù)裂解紅細(xì)胞1次,加入1 ml Trizol試劑,-70 ℃保存?zhèn)錂z。采用Trizol法提取標(biāo)本總RNA,以紫外分光光度儀測(cè)定總RNA含量。每份標(biāo)本取總RNA 1 μg,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR),擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為143 bp。反應(yīng)總體積25 μl:cDNA 50 ng、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 24.0 mmol/L、上下游引物各0.4 μmol/L、EvaGreenPCR核酸染料(20×水溶液)1.2 μl、50×熒光參比溶液0.5 μl、DNA聚合酶1.0 U。所用引物序列見(jiàn)表2。所用儀器為PE9600型PCR擴(kuò)增儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min,變性30 s、61 ℃(ABL 60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s、84 ℃(ABL 82 ℃)收集熒光30 s,共50個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列無(wú)誤的SALL4 cDNA陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照,以雙蒸水作為無(wú)模板陰性對(duì)照。采用SDS軟件分析檢測(cè)數(shù)據(jù),以ABL為內(nèi)參計(jì)算SALL4轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)定量,NSALL4=SALL4轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)/ABL的拷貝數(shù)×100%。

表2 引物序列

1.4.4 AGP水平 于治療前后抽取患者空腹靜脈血5 ml,3 500 r/min離心10 min,取血清,-80 ℃保存?zhèn)錂z。采用抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)測(cè)定方法(免疫散射比濁法)對(duì)AGP進(jìn)行檢測(cè)。將以等滲鹽水1∶10稀釋的3 μl血清加入300 μl α1-AGP抗體液,充分混勻。延遲時(shí)間5～10 s,反應(yīng)時(shí)間5 min,反應(yīng)溫度37 ℃,測(cè)定波長(zhǎng)為340 nm。所用儀器為特定蛋白分析儀BN ProSpec(天津通怡科技有限公司),試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.4.5 不良反應(yīng) 觀察患者治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況,包括白細(xì)胞減少[低于正常范圍(4～10)×109/L]、血小板減少(<100×109/L)、水腫、惡心、嘔吐、頭疼、發(fā)熱的發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床療效比較 觀察組治療后獲CHR的人數(shù)比例較對(duì)照組更高,獲CCyR、MMR的人數(shù)比例低于對(duì)照組,觀察組整體療效優(yōu)于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組臨床療效比較[n(%)]

2.2兩組治療前后血清學(xué)指標(biāo)水平比較 兩組血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2治療前水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后均較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對(duì)照組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組治療前后血清學(xué)指標(biāo)水平比較

2.3兩組治療前后SALL4 mRNA表達(dá)水平比較 兩組治療前SALL4 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對(duì)照組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩組治療前后SALL4 mRNA表達(dá)水平比較 相對(duì)表達(dá)量]

2.4兩組治療前后血清AGP水平比較 兩組治療前血清AGP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),治療后較治療前顯著降低(P<0.05),且觀察組較對(duì)照組更低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 兩組治療前后血清AGP水平比較

2.5兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 觀察組白細(xì)胞減少4例,血小板較少6例,血液學(xué)不良反應(yīng)發(fā)生率高于對(duì)照組[22.22%(10/45)vs 6.67%(3/45);χ2=4.406,P=0.039]。兩組非血液學(xué)不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[6.67%(3/45)vs 4.44%(2/45);χ2=0.000,P=1.000]。兩組總不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者均采取對(duì)癥治療后好轉(zhuǎn)。見(jiàn)表7。

表7 兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[n(%)]

3 討論

3.1CML在慢性白血病中占比較高,患者一般表現(xiàn)為貧血、身體乏力、身體素質(zhì)下降、肝脾區(qū)不適等。這些癥狀并未表現(xiàn)出特異性,常未能引起患者及其家屬足夠的重視而延誤診治,使得大部分患者確診時(shí)已處于疾病加速期,嚴(yán)重影響患者預(yù)后[8]。CML具有Ph染色體,即染色體異常[9]。染色體異常產(chǎn)生的BCR/ABL融合基因可啟動(dòng)下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,這也是CML的發(fā)病機(jī)制。流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示,我國(guó)每年CML發(fā)病率達(dá)(0.39～0.99)/10萬(wàn),占所有白血病的10%左右,以中年人群最為常見(jiàn),其中男性患者相對(duì)較多[10]。

3.2CML傳統(tǒng)的治療方法有重組人干擾素-α、化療及干細(xì)胞移植等[11]。重組人干擾素-α可對(duì)DNA多聚酶的活性產(chǎn)生抑制作用,提升Ph(+)細(xì)胞人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子的表達(dá)水平,可識(shí)別Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)、抗原遞呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞,繼而發(fā)揮抗腫瘤、提升機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[12]。伊馬替尼屬于2-苯胺嘧啶衍生物,可對(duì)TK的活性產(chǎn)生抑制作用,阻斷細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),同時(shí)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯以及凋亡,發(fā)揮治療CML的作用。其應(yīng)用于臨床具有起效快、作用時(shí)間長(zhǎng)和減少腫瘤負(fù)荷等優(yōu)點(diǎn),然而一部分患者可發(fā)生伊馬替尼耐藥,導(dǎo)致治療失敗。與單獨(dú)伊馬替尼治療比較,聯(lián)合IFNα-2b治療可使患者更早獲得較好的遺傳學(xué)反應(yīng),且在后期仍可獲得較好的分子學(xué)反應(yīng)。通常而言,分子學(xué)反應(yīng)的提升表明患者生存質(zhì)量的提升,可減少殘留的微小病灶,因此對(duì)腫瘤患者的預(yù)后改善具有一定的價(jià)值。本研究伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療并未發(fā)現(xiàn)新的嚴(yán)重并發(fā)癥,血液學(xué)不良反應(yīng)發(fā)生率顯著高于單獨(dú)伊馬替尼治療,非血液學(xué)不良反應(yīng)與單獨(dú)伊馬替尼治療比較無(wú)顯著差異,與劉璽等[13]的研究結(jié)果相似。

3.3本研究觀察組治療后獲CCyR、MMR的人數(shù)比例低于對(duì)照組,獲CHR的人數(shù)比例高于對(duì)照組,提示伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療的臨床療效優(yōu)于單獨(dú)伊馬替尼治療,能夠緩解患者的病情,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,考慮這與伊馬替尼和IFNα-2b聯(lián)合使用具有協(xié)同作用有關(guān)。另外,本研究?jī)山M治療后血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2水平均較治療前顯著降低,且觀察組水平較對(duì)照組更低,說(shuō)明伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療對(duì)患者腫瘤的抑制作用更強(qiáng)。MMP-2在腫瘤細(xì)胞跨基膜侵犯肝臟、脾臟和淋巴結(jié)等器官中發(fā)揮著十分重要的作用,治療藥物可控制腫瘤細(xì)胞合成MMP-2,抑制新生血管的形成,阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。

3.4根據(jù)細(xì)胞癌變假說(shuō)的分子模型,在造血干細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化為白血病的過(guò)程中SALL4基因可能是較早發(fā)生突變的癌基因。SALL4基因在白血病中表達(dá)水平升高,使失去自我更新能力的過(guò)渡性增生性細(xì)胞群體定向祖細(xì)胞獲得自我更新能力,使其有機(jī)會(huì)轉(zhuǎn)化為白血病干細(xì)胞,這可能是SALL4參與白血病發(fā)生機(jī)制的途徑。SALL4可結(jié)合WNT信號(hào)通路中的重要調(diào)節(jié)蛋白β-catenin,從而增強(qiáng)此信號(hào)通路活性,激活下游靶基因,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖,從而引發(fā)白血病。本研究?jī)山M治療后SALL4 mRNA表達(dá)水平較治療前顯著降低,且觀察組水平較對(duì)照組更低,提示藥物通過(guò)下調(diào)SALL4基因而阻斷WNT信號(hào)通路,繼而對(duì)下游靶基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用,最終對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用[15-16]。

3.5本研究?jī)山M治療后血清AGP水平較治療前降低,且觀察組下降幅度較對(duì)照組更顯著,分析認(rèn)為白血病發(fā)生過(guò)程中AGP的這種變化可能與腫瘤細(xì)胞刺激肝臟和腫瘤細(xì)胞自身合成糖蛋白存在一定的關(guān)系[17-18]。治療過(guò)程中,藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力較大,被殺滅的腫瘤細(xì)胞釋放糖蛋白;而這種殺傷過(guò)程也會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷作用,患者可表現(xiàn)出急性時(shí)相反應(yīng),刺激肝臟合成更多的糖蛋白。上述兩個(gè)因素均使血清AGP水平升高,對(duì)于治療后病情緩解的患者,機(jī)體組織損傷逐漸恢復(fù),白細(xì)胞數(shù)量下降,AGP水平也隨之下降[19-20]。本研究觀察組白細(xì)胞、血小板減少等血液學(xué)不良反應(yīng)發(fā)生率顯著高于對(duì)照組,而水腫、惡心、嘔吐、頭疼、發(fā)熱等非血液學(xué)不良反應(yīng)發(fā)生率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),對(duì)此需要進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,伊馬替尼聯(lián)合IFNα-2b治療加速期CML的效果較單獨(dú)使用伊馬替尼更優(yōu),可降低患者M(jìn)MP-2、SALL4 mRNA和AGP水平,起到緩解病情的作用,但可能會(huì)增加其血液學(xué)不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究為單中心研究,樣本量較小,研究結(jié)論還需進(jìn)一步通過(guò)多中心、前瞻性研究加以驗(yàn)證。