張少杰, 唐鳳珠, 王 瑢, 班莫璐, 黃蘭誠(chéng), 周 凱, 林鉆平, 瞿申紅, 李東云

耳聾是耳鼻喉科一種常見(jiàn)的臨床疾病,為人類(lèi)殘疾的重要原因。據(jù)第二次全國(guó)殘疾人普查顯示,全國(guó)各類(lèi)殘疾人的總數(shù)為8 296萬(wàn),而聽(tīng)力殘疾占總數(shù)的24.16%[1]。耳聾的影響因素可分為遺傳和環(huán)境兩個(gè)方面,而遺傳性因素是最主要的,研究發(fā)現(xiàn)遺傳缺陷引起的耳聾占比可達(dá)到60%[2]。線(xiàn)粒體基因12S rRNA、GJB2、GJB3、SLC26A4是我國(guó)遺傳性耳聾重要的突變類(lèi)型[3-5]。很多患者是在使用氨基糖苷類(lèi)抗生素如慶大霉素、鏈霉素等藥物后誘發(fā)耳聾。部分人對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物具有易感性,微小的劑量就可造成不可逆的聽(tīng)力損傷,甚至出現(xiàn)“一針致聾”現(xiàn)象。這種易感性通常是母系遺傳的,其可能的發(fā)病機(jī)制與線(xiàn)粒體基因有關(guān)[6]。通常將這類(lèi)耳聾稱(chēng)為氨基糖苷類(lèi)抗生素性聾(aminoglycoside antibiotic-induced deafness,AAID)。廣西作為少數(shù)民族較多的地區(qū),壯族人口眾多,還有瑤族、侗族以及仫佬族等其他少數(shù)民族?；蛟陂L(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中在不同種族、民族、地域間存在差異。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)廣西壯族非綜合征型耳聾的線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變率僅為0.74%,明顯低于我國(guó)其他地區(qū)和民族[7]。這除了與民族及區(qū)域的差異性相關(guān)外,是否還存在其他影響因素,比如是否存在很多同類(lèi)家系因未發(fā)病而隱藏在正常的壯族人群中,值得進(jìn)一步研究。氨基糖苷類(lèi)藥物因價(jià)格低廉、適用性廣、使用方便而被廣泛使用。因此,盡早篩出對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素致聾的易感者(尤其對(duì)于兒童)意義重大。為此,本研究通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)壯族聽(tīng)力正常人群的線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變篩查,了解其突變率及突變特點(diǎn),為早期診斷攜帶者及其家系成員提供合理的用藥指導(dǎo)和遺傳咨詢(xún),以有效避免高危人群出現(xiàn)藥物性聾。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2021年12月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸科門(mén)診就診或者住院的聽(tīng)力正常壯族患者150例。其中男95例,女55例,年齡3～60歲。受試者經(jīng)病史采集、體格檢查、聽(tīng)力學(xué)檢查確定為聽(tīng)力正常(純音測(cè)聽(tīng)檢查雙耳,0.25、0.5、1、2、4、8 kHz閾值均≤25 dB HL,鼓室壓圖為A型,聲反射閾可引出)[8-9]。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)受試者聽(tīng)力正常,并且父母雙方三代均為廣西人,在廣西長(zhǎng)期居住達(dá)20年以上;(2)按民族分類(lèi),父母雙方三代均為壯族;(3)患者和家屬同意參加本研究并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)各種類(lèi)型耳聾(傳導(dǎo)性聾、感音神經(jīng)性聾)的患者;(2)外耳、中耳、內(nèi)耳畸形的患者;(3)有與壯族以外其他民族聯(lián)姻,或者與省外或國(guó)外種族聯(lián)姻家族史者;(4)從外省遷移至廣西居住時(shí)間未達(dá)20年者;(5)患者或家屬不同意參加本研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本采集、DNA提取及處理 采用一次性負(fù)壓EDTA抗凝采血管取受試者外周血5～10 ml,并進(jìn)行編號(hào)。外周血裂解紅細(xì)胞后采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)從白細(xì)胞中提取基因組DNA,用超微核酸測(cè)定儀進(jìn)行DNA濃度和純度的定量檢測(cè)。將提取到的DNA保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2 基因芯片檢測(cè) 采用晶芯十五項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒(微陣列芯片法,博奧生物集團(tuán)有限公司,國(guó)械注準(zhǔn)20173401343)及其配套儀器,檢測(cè)樣本線(xiàn)粒體基因12S rRNA的2個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn):1494C>T,1555A>G。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 取出試劑盒中PCR擴(kuò)增試劑(擴(kuò)增引物與擴(kuò)增試劑混合物)A、B、C按20 μl/管,分裝到3個(gè)PCR擴(kuò)增管中,然后每管加入5 μl的樣品基因組DNA,形成25 μl反應(yīng)體系,并置于PCR擴(kuò)增儀中,擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增程序

1.2.4 磁珠制備 將9 μl磁珠和30 μl結(jié)合緩沖液,置于磁力架上15 s,吸去液體后,再次加入30 μl結(jié)合緩沖液,渦旋混勻。

1.2.5 磁珠純化 取20 μl PCR產(chǎn)物加入上述磁珠溶液,混勻后放置10 min,中間混勻1次。然后置于磁力架15 s,吸棄溶液。將0.1 M NaOH 120 μl加入試管充分混勻,靜置10 min。再次放置磁力架吸附15 s,吸棄溶液,使用雜交緩沖液40 μl清洗一次并吸棄,然后加入雜交緩沖液20 μl配制成磁珠雜交溶液。

1.2.6 磁珠雜交 從上述磁珠雜交溶液中,取15.5 μl加到芯片的微陣列中,50 ℃雜交1 h。配制標(biāo)準(zhǔn)洗滌液Ⅰ(SSC終濃度為0.3×,SDS終濃度為0.1%)、洗滌液Ⅱ(SSC終濃度為0.06×),并使用洗干儀進(jìn)行洗滌與干燥。

1.2.7 掃描檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 將洗滌完并干燥好的芯片放入晶芯?LuxScanTM 10K/B微陣列芯片掃描儀中,使用配套的檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判斷,并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3基因篩查及用藥指導(dǎo) 對(duì)150例聽(tīng)力正常的壯族受試者進(jìn)行耳聾突變基因篩查,為線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變攜帶者提供科學(xué)用藥指導(dǎo)。

2 結(jié)果

150份樣本中,檢出線(xiàn)粒體基因12S rRNA 1555 A>G突變者1例(攜帶率為0.67%,見(jiàn)圖1),并經(jīng)Sanger測(cè)序證實(shí)為1555 A>G突變(見(jiàn)圖2),未發(fā)現(xiàn)1494C>T位點(diǎn)突變。耳聾基因微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

?野生型；?12S rRNA 1555A>G突變

箭頭所示為1555位堿基(A>G)

表2 耳聾基因微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.11993年,Prezant等[10]在一個(gè)非綜合征型母系遺傳的阿拉伯-以色列耳聾家系中首次發(fā)現(xiàn)了線(xiàn)粒體基因12S rRNA A1555G突變,其臨床特征表現(xiàn)為以高頻下降為主的雙側(cè)感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失,從此揭開(kāi)了1555A>G突變與氨基糖苷類(lèi)藥物性聾相關(guān)研究的序幕。線(xiàn)粒體基因全長(zhǎng)16 569 bp,共有37個(gè)基因:編碼13種多肽鏈、22種tRNA、2種rRNA(16S rRNA和12S rRNA)。在人類(lèi)細(xì)胞中,12S rRNA由MT-RNR1基因編碼,所以MT-RNR1即為mtDNA 12S rRNA,基因全長(zhǎng)953 bp[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體基因12S rRNA 1555A>G突變后能夠?qū)е?2S核糖體RNA亞基結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這意味著它更接近細(xì)菌16S核糖體RNA亞基,容易與氨基糖苷類(lèi)結(jié)合,這種親和力的增加在內(nèi)毛細(xì)胞中影響最為顯著,可通過(guò)抑制核糖體蛋白質(zhì)的合成,導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞損傷和細(xì)胞毒性[12]。

3.2氨基糖苷類(lèi)抗生素在多重耐藥革蘭陰性桿菌感染、膿毒血癥、結(jié)核的治療中具有顯著效果,其安全性得到了臨床認(rèn)可,甚至在英國(guó)還被用作新生兒敗血癥的一線(xiàn)用藥[13-14],在世界范圍內(nèi)也常用于治療其他革蘭陰性桿菌感染的疾病[15]。當(dāng)然,在高劑量或長(zhǎng)期治療方案中,氨基糖苷類(lèi)藥物會(huì)引起腎毒性和耳毒性[16-17],后者可表現(xiàn)為前庭毒性或耳蝸毒性[18],并且目前仍無(wú)有效的治療方法。線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變的個(gè)體對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素有強(qiáng)易感性,可能存在使用單劑量或少劑量即可在極短的時(shí)間里誘發(fā)聽(tīng)力損失。但因忌憚氨基糖苷類(lèi)抗生素致聾而在臨床上統(tǒng)一采取慎用或禁用該藥的做法是不可取的,因此利用基因微陣列芯片在特定的群體中高效篩出敏感個(gè)體,是一種有效可行的預(yù)防方法。特別是兒童,因其免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善以及免疫力發(fā)展的不足,極易發(fā)生上呼吸道感染,并有可能累及鄰近器官,如引發(fā)鼻竇炎、中耳炎、扁桃體炎[19],也可向下蔓延形成急性支氣管炎或肺炎,在成長(zhǎng)過(guò)程中患病就診的次數(shù)越多,接觸氨基糖苷類(lèi)抗生素的風(fēng)險(xiǎn)就越高。在廣西壯族聚居地,因家長(zhǎng)缺乏專(zhuān)業(yè)衛(wèi)生知識(shí)自購(gòu)或者在私人診所使用氨基糖苷類(lèi)藥物的概率大大增加。本研究篩出1例線(xiàn)粒體基因12S rRNA 1555A>G突變攜帶者,并通過(guò)對(duì)其母系家庭成員進(jìn)行禁用氨基糖苷類(lèi)藥物健康宣傳教育,能夠起到前瞻性預(yù)防作用,從而避免今后藥物性聾的發(fā)生。

3.3線(xiàn)粒體基因12S rRNA在不同地區(qū)的突變率不盡相同,湖南地區(qū)正常人群1555A>G攜帶率為0.11%[20]。李孟蘭等[21]調(diào)查報(bào)道江蘇地區(qū)人群1555A>G的突變攜帶率為0.31%,石家莊地區(qū)育齡婦女1555A>G突變攜帶率為0.31%[22]。肖穎等[23]通過(guò)對(duì)泰興地區(qū)300例聽(tīng)力正常的孕婦進(jìn)行1555A>G篩查,報(bào)告突變攜帶率為0.67%。本研究在150例壯族聽(tīng)力正常的人群中檢測(cè)出1例線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變患者,突變類(lèi)型為1555A>G突變,檢出率為0.67%,高于全國(guó)大部分地區(qū),與泰興地區(qū)報(bào)道的攜帶率相一致。我國(guó)線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變主要以1555A>G為主,1494C>T突變概率較低[24]。本研究發(fā)現(xiàn)廣西壯族人群中線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變特點(diǎn)表現(xiàn)為1555A>G,較1494C>T突變發(fā)生率高,這與全國(guó)大部分地區(qū)報(bào)道相符。廣西地區(qū)壯族正常聽(tīng)力人群中1555A>G攜帶率相對(duì)較高,分析其原因,可能與以下因素相關(guān):(1)廣西壯族群體中,特別是一些分支,如黑衣壯、藍(lán)衣壯,因言語(yǔ)和生活環(huán)境的特殊性,這些群體在一定的時(shí)間內(nèi)保持著民族內(nèi)通婚,遺傳信息的保守性較好,這可能是耳聾基因突變位點(diǎn)攜帶率民族間差異性所在[25]。(2)本研究的150例進(jìn)行藥物性耳聾基因篩查的受試者對(duì)耳聾基因篩查這項(xiàng)技術(shù)的了解均為首次,說(shuō)明壯族人群中基層專(zhuān)業(yè)衛(wèi)生人員的相關(guān)培訓(xùn)與耳聾基因篩查的衛(wèi)生宣傳不足,很多耳聾基因突變的攜帶者還隱藏在聽(tīng)力正常的人群中,因?yàn)闆](méi)有發(fā)病而沒(méi)有被區(qū)分出,這與廣西某些地區(qū)經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后、醫(yī)療相關(guān)篩查知識(shí)普及率低有關(guān)。因此,通過(guò)相應(yīng)的培訓(xùn)提高基層醫(yī)院醫(yī)務(wù)工作者對(duì)基因篩查的重要認(rèn)知,傳播耳聾基因篩查相關(guān)知識(shí)是非常必要的。

綜上所述,廣西聽(tīng)力正常的壯族人群中存在線(xiàn)粒體基因12S rRNA 1555A>G突變,對(duì)廣西壯族人群進(jìn)行線(xiàn)粒體基因12S rRNA篩查具有重要意義,一方面可以盡早篩出對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素致聾的易感者,降低藥物性聾的發(fā)生;另一方面,根據(jù)線(xiàn)粒體的母系遺傳規(guī)律,對(duì)其母系家庭成員進(jìn)行基因確認(rèn),對(duì)未發(fā)病的家庭成員進(jìn)行禁用氨基糖苷類(lèi)抗生素的宣教,是一種有效的防聾舉措。但本研究樣本量偏小,具有一定局限性,且僅研究了壯族群體,對(duì)于廣西地區(qū)其他民族聽(tīng)力正常人群線(xiàn)粒體基因12S rRNA突變的特點(diǎn)及其差異性,還應(yīng)在后期的工作中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。