高夢 榮勝忠 任志穎 苗國慶 李曉霞

[摘要]?環(huán)狀RNA（circular?RNA，circRNA）是一類具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，主要存在于真核生物中，內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可經(jīng)由多種途徑發(fā)揮作用。膀胱癌（bladder?cancer，BC）是目前最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，且近年發(fā)病率較高。由于缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物，早期BC往往不能被及時發(fā)現(xiàn)，因此對特異性腫瘤標(biāo)志物進行探索，具有很大的臨床意義和價值。circRNA作為研究方向，值得進一步深入，本綜述較為系統(tǒng)的介紹了circRNA及其與膀胱癌的關(guān)系，并對現(xiàn)有研究的局限性進行了展望。

[關(guān)鍵詞]?circRNA；生物發(fā)生；分子特征；生物學(xué)功能；膀胱癌；生物標(biāo)志物

[中圖分類號]?R737??????[文獻標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.11.026

膀胱癌（bladder?cancer，BC）是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界排名第9位[1]，目前還沒有針對侵入性高級別BC的完美治療方法。臨床主要以手術(shù)切除與化療為主，但BC中晚期時易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，耐藥嚴重，且臨床效果較差，療效通常并不理想。由于缺乏特異性的診斷和治療方法，大多數(shù)患者無法在早期被及時發(fā)現(xiàn)。因此，探索新的生物標(biāo)志物和確定膀胱癌的有效治療靶點至關(guān)重要。人類基因組中，非編碼RNA占據(jù)了真核基因組上總RNA的95%。非編碼RNA中主要分為轉(zhuǎn)錄的超保守區(qū)、微RNA（microRNA，miRNA）、小核仁RNA、與PIWI相互作用RNA、長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA（circular?RNA，circRNA），circRNA是具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[2-3]。隨著高通量測序技術(shù)和基因生信分析的迅速發(fā)展，近些年已經(jīng)成功鑒定了成千上萬個circRNAs，證實circRNA具備組織特異性的表達模式。

1??circRNA的生物發(fā)生

circRNA源自前體mRNA，具有顯著的連續(xù)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，通過自由3′和5′端共價連接，又稱為“反向剪接”結(jié)構(gòu)[3]。反向剪接結(jié)構(gòu)的形成不僅需要規(guī)范的剪接信號，還需要規(guī)范的剪接體機制。多種途徑參與circRNA的環(huán)化。circRNA一般可分為3種：外顯子環(huán)狀RNA（exonic?circRNA，ecircRNA），環(huán)狀內(nèi)含子RNA（circular?intronic?RNA，ciRNA）和外顯子–內(nèi)含子環(huán)狀RNA（exon-intron?circular?RNA，EIciRNA）[4]。RNA結(jié)合蛋白配對和內(nèi)含子配對直接驅(qū)動環(huán)化circRNA形成的反向剪接途徑。肌盲蛋白（muscleblind?protein，MBL）、Quaking（QKI）和RNA特異性腺苷脫氨酶1（adenosine?deaminase?acting?on?RNA?1，ADAR1）等RNA結(jié)合蛋白參與調(diào)控circRNA的發(fā)生。MBL和QKI與側(cè)翼內(nèi)含子的序列基序結(jié)合并將兩個側(cè)翼內(nèi)含子連接在一起，調(diào)節(jié)相鄰的剪接位點以促進circRNA的形成[4]。ADAR1通過與雙鏈RNA結(jié)合并融合莖結(jié)構(gòu)來抑制circRNA的形成，從而產(chǎn)生ecircRNA和EIciRNA。關(guān)于內(nèi)含子配對，側(cè)翼內(nèi)含子中反向重復(fù)Alu元件的替代形成及跨側(cè)翼內(nèi)含子或單個內(nèi)含子內(nèi)部的RNA配對之間的競爭都可能引起替代環(huán)化，進而引起單個基因產(chǎn)生了多個circRNAs和線性轉(zhuǎn)錄本[5]。此外，circRNA可以通過含有外顯子的套索驅(qū)動途徑產(chǎn)生，由外顯子跳躍事件形成帶有外顯子的套索，再通過套索內(nèi)部剪接去除側(cè)翼內(nèi)含子序列，最終產(chǎn)生ecircRNA或EIciRNA[6]。ciRNA也是通過套索衍生的機制而形成的，該機制基于一個共識基序，該基序在5'剪接位點附近包含一個7-nt的富Gu元件，在分支點位點附近包含一個11-nt的富C的元件[7]。據(jù)報道，古細菌和真核生物中都存在另一種保守的circRNA生物發(fā)生模式。在這種情況下，轉(zhuǎn)運核糖核酸（transfer?ribonucleic?acid，tRNA）剪接核酸內(nèi)切酶復(fù)合物會在凸起–螺旋–凸起基序處切割含內(nèi)含子的前tRNA，然后將外顯子兩半連接起來，內(nèi)含子末端也連接起來形成tRNA內(nèi)含子環(huán)狀RNA[8]。當(dāng)剪接體或轉(zhuǎn)錄終止因子在細胞中耗盡時，circRNA成為首選的基因輸出，通過抑制或減緩規(guī)范的前mRNA加工事件，將蛋白質(zhì)編碼基因的穩(wěn)態(tài)輸出傳遞至環(huán)狀RNA[9]，為更好地理解circRNA的產(chǎn)生提供了參考。

2??circRNA的特征

circRNA擁有一些共同的特征，主要如下：①廣泛的分布和多樣性，在植物、動物及所有組織的許多真核生物中，均存在circRNA[10]；②高度的穩(wěn)定性，由于具有封閉的環(huán)形結(jié)構(gòu)特點，circRNA對核糖核酸酶R的降解產(chǎn)生了抗性，且比線性RNA穩(wěn)定；③特定的表達方式，在不同的發(fā)育階段和不同的細胞與組織中，circRNA有相應(yīng)的表達；④序列保守性，研究證明，許多circRNA在物種間的進化方面存在序列保守性[10]；⑤正常與病理狀態(tài)的動態(tài)表達譜，研究發(fā)現(xiàn)許多circRNA在正常組織和癌癥組織之間的表達發(fā)生了變化[11]；⑥主要由外顯子衍生而來，由單一或多個外顯子組成，而且一個最小的外顯子長度能形成反向剪切。

3??circRNA的生物學(xué)功能

3.1??充當(dāng)miRNA海綿

miRNA是非編碼RNA家族中的一類短的小分子RNA，能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄過后的基因表達水平，特別是在癌癥中。circRNA可以作為內(nèi)源競爭性RNA，通過與miRNA結(jié)合并阻止miRNA調(diào)節(jié)其下游靶基因來影響基因表達。例如，人類小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物（cerebellar?degeneration?related?protein?1?antisense，CDR1as/ciRS-7）和小鼠Y染色體性別決定區(qū)（sex?determining?region?Y，Sry）是兩個最著名的circRNA充當(dāng)miRNA海綿的示例。CDR1as下調(diào)許多癌癥相關(guān)信號通路中致癌因子的表達，從而通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide?3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein?kinase?B，PKB/AKT）途徑調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲途徑[12]。據(jù)報道circBIRC6直接與miR-34a和miR-145相互作用調(diào)節(jié)維持多能性的靶基因，circBIRC6減弱這些靶基因的下調(diào)并抑制人類胚胎干細胞的分化[13]。越來越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)作為miRNA海綿，如circHIPK3能夠與9個miRNA結(jié)合，還能與miR-124結(jié)合并抑制其活性，在癌細胞中產(chǎn)生強增殖作用[14]。由此可見，海綿化miRNA可能是許多circRNA的重要作用機制，circRNA可以海綿化許多不同的miRNA，而并非通過結(jié)合某個特定的miRNA的多個位點產(chǎn)生生物抑制或致癌功能。

3.2??與蛋白質(zhì)相互作用

circRNA還可以與蛋白質(zhì)相互作用以調(diào)節(jié)基因表達。MBL是人類盲肌樣蛋白1（muscleblind?like?splicing?regulator?1，MBNL1）的同源物，該基因在果蠅和人類體內(nèi)產(chǎn)生circMbl，其與MBL側(cè)翼內(nèi)含子擁有傳統(tǒng)的肌盲結(jié)合位點，從而強力而特異地結(jié)合，促進新生RNA環(huán)化和circMb1的生物發(fā)生，MBL含量的變化強烈影響circMbl的生物合成，這種作用主要依賴于MBL的結(jié)合位點[15]。其他circRNA如circPABPN1和circANRIL，也可通過與靶蛋白相互作用來發(fā)揮重要作用。circPABPN1與RNA結(jié)合蛋白HuR大量結(jié)合，使HuR與PABPN1mRNA的結(jié)合減少，降低PABPN1的翻譯水平，通過與翻譯激活因子HuR競爭而降低其可用性，調(diào)節(jié)PABPN1mRNA的翻譯[16]。circANRIL通過與pescadillo核糖體生物發(fā)生因子結(jié)合，影響了前核糖體RNA的加工和核糖體的生物發(fā)生，因此，circANRIL可以誘導(dǎo)核仁應(yīng)激和p53的激活，隨后凋亡增加，增殖率下降，這一途徑可以通過在動脈粥樣硬化斑塊中消除過度增生細胞來促進動脈粥樣硬化保護[17]。另外，某些circRNA如circ-Amotl1和circ-Foxo3，可充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的支架，促進酶及其底物的共定位。circ-Amotl1能夠結(jié)合3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent?kinase?1，PDK1）和AKT1，并促進AKT1的PDK1依賴性磷酸化。AKT1隨后轉(zhuǎn)移到細胞核，在小鼠模型中顯示出心臟保護功能[18]。circ-Foxo3的主要作用之一是促進小鼠的由雙微體同源基因2介導(dǎo)的突變p53泛素化，使其靶向蛋白酶體誘導(dǎo)降解[19]。最后，circRNA可能會把某些特定蛋白募集到細胞的特定位置，如circFECR1可把甲基胞嘧啶雙加氧酶1募集到其宿主基因FLI1的啟動子區(qū)域，從而引起CpG位點的去甲基化和轉(zhuǎn)錄活性[20]。

3.3??調(diào)控轉(zhuǎn)錄

circRNA可以順式或反式影響其親本基因。ciRNA由脫離分支結(jié)構(gòu)的套索內(nèi)含子產(chǎn)生，通常積聚在人類細胞的細胞核中，并通過與RNA聚合酶Ⅱ（polymerase?Ⅱ，Pol?Ⅱ）機制相互作用，使其親本編碼基因的轉(zhuǎn)錄得到調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮RNA?Pol?Ⅱ轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)節(jié)作用[7]。同時，EIciRNA能夠與U1小核糖核蛋白和Pol?Ⅱ相互作用，使親本基因的轉(zhuǎn)錄得到促進[21]。

3.4??翻譯

circRNA曾被視為非編碼RNA，但最近的研究成果表明了circRNA參與翻譯的能力。真核生物核糖體翻譯僅需要內(nèi)部核糖體進入位點（internal?ribosome?entry?site，IRES）元件[22]。此外，在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)千個新的與帽無關(guān)的翻譯序列，進一步表明circRNA可能是可翻譯的[23]。研究顯示，circRNA在活體細胞中可通過滾動循環(huán)擴增機制高效翻譯，產(chǎn)生豐富的蛋白產(chǎn)物[24]。研究人員還發(fā)現(xiàn)大量的circRNA能夠成為信使RNA，并利用N6-甲基腺苷來編碼非帽依賴性翻譯機制的蛋白[25]。據(jù)報道，circRNA的一個子集與翻譯核糖體有關(guān)，其通常與宿主RNA共享起始密碼子，編碼具有特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，并以不依賴帽的方式翻譯[26]。最近的一項研究也證明，circ-FBXW7能夠直接翻譯成一個與親代基因編碼的FBXW7蛋白相關(guān)聯(lián)的蛋白，使核蛋白類癌基因c-Myc的穩(wěn)定性得到調(diào)整，進而阻止膠質(zhì)瘤的發(fā)展[27]。

4??circRNA與膀胱癌的關(guān)系

研究顯示，許多circRNA在BC組織和健康的鄰近組織中存在差異表達。circRNA與BC相關(guān)的功能有促進腫瘤和抑制腫瘤兩種。與健康的鄰近組織、正常組織和正常細胞系相比，許多circRNA如circBPTF、circTFRC、circPDSS1、circZFR等在BC組織和細胞系中的表達水平均升高，并在促進腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。這些circRNA的高水平與BC的臨床病理階段密切相關(guān)，并影響B(tài)C的生存。例如，在BC的臨床分期中，circPDSS1的表達水平不同，該分期越高，表達水平越高[28]。腫瘤復(fù)發(fā)是影響預(yù)后的一個重要因素，研究發(fā)現(xiàn)circBPTF與BC的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，復(fù)發(fā)性腫瘤組織可顯示出比原發(fā)性腫瘤組織更高的circRNA水平[29]。

4.1??促癌因子

4.1.1??circBPTF??circBPTF在BC組織和細胞系中的表達明顯高于非癌組織和細胞系，circBPTF的過度表達與BC患者的不良生存率、較高的腫瘤分期和腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，表明circBPTF在BC中發(fā)揮致癌作用[29]。

4.1.2??circTFRC??circTFRC在BC組織中表達上調(diào)，并與患者的腫瘤分級和生存率相關(guān)，基因敲除circTFRC可抑制BC細胞體外侵襲、增殖和體內(nèi)腫瘤生長，circTFRC通過吸收靶向TFRC的miRNA-107上調(diào)TFRC的表達，從而促進BC組織中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞增殖和細胞侵襲[30]。

4.1.3??circPDSS1??circPDSS1在膀胱尿路上皮癌（urothelial?bladder?cancer，UBC）中表達上調(diào)，其表達水平隨著臨床分期的增加而增加。過表達circPDSS1可導(dǎo)致miR-16的下調(diào)，而過表達miR-16對circPDSS1無明顯影響，過表達circPDSS1可導(dǎo)致UBC細胞增殖、侵襲和遷移率升高，過表達miR-16不僅能抑制UBC細胞的增殖、侵襲和遷移，還能減弱過表達circPDSS1的作用。因此，circPDSS1可能通過下調(diào)miR-16促進UBC的進展[28]。

4.1.4??circZFR??circZFR在BC組織和細胞中的表達高于相鄰的非腫瘤組織和正常膀胱上皮細胞。較高的circZFR水平與BC患者的病理T分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、無進展生存期和總生存期呈正相關(guān)，說明circZFR可用作預(yù)后的生物標(biāo)志。circZFR敲低可以顯著減弱BC細胞的遷移和侵襲能力，從機制上講，circZFR可以直接結(jié)合miR-377作為海綿，從而促進ZEB2在BC細胞中的表達[31]。

4.1.5??circPRMT5??circPRMT5的高表達與UBC患者的轉(zhuǎn)移和（或）較差的生存水平呈正相關(guān)，circPRMT5的上調(diào)充當(dāng)miR-30c的海綿，調(diào)節(jié)SNAIL1/E-鈣黏蛋白途徑，通過競爭miR-30c來促進UBC細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[32]。

4.1.6??circCASC15??circCASC15的表達水平與BC患者的腫瘤分期正相關(guān)，主要機制是充當(dāng)miR-1224-5p海綿來激活致癌的CREB1表達，從而促進BC細胞的增殖[33]。

4.1.7??circRGNEF??circRGNEF高表達預(yù)示了BC預(yù)后不良，其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高病理性T期和高分期相關(guān)，與低circRGNEF表達的患者相比，circRGNEF高表達與較差的總體生存率相關(guān)[34]。

4.1.8??circRIP2??研究發(fā)現(xiàn)，circRIP2能夠上調(diào)BC組織中TGF-β2的表達，并通過TGF-β2/Smad3蛋白途徑誘導(dǎo)上皮內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移，有效的circRIP2活性通過激活miR-1305/轉(zhuǎn)化生長因子β2/Smad3通路而誘導(dǎo)BC的發(fā)生發(fā)展，從而加速膀胱癌的進展[35]。

4.2??抑癌因子

4.2.1??Cdr1as??作為第1個被發(fā)現(xiàn)具有miRNA海綿作用的circRNA，Cdr1as在BC組織中的表達明顯低于鄰近的正常組織。Cdr1as表達上調(diào)，在體外能抑制BC細胞的生長、侵襲和遷移，在體內(nèi)能抑制腫瘤的生長。Cdr1as能使BC中的多個miRNA發(fā)生海綿化，并通過與miR-135a結(jié)合來控制BC細胞的生長、浸潤和遷移，進而起到抗腫瘤效果[36]。

4.2.2??circHIPK3??又稱為膀胱癌相關(guān)的環(huán)形RNA-2，在BC中表達下調(diào)，與腫瘤分級、侵襲程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈相反的變化，circHIPK3通過靶向miR-558抑制乙酰肝素酶的表達，從而抑制BC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[37]。

4.2.3??circFNDC3B??在人類BC組織中，circFNDC3B的表達明顯減少，并且與病理T分期、分級、淋巴侵犯程度以及患者的總存活率密切相關(guān)。在體外和體內(nèi)，過表達的circFNDC3B在功能方面都明顯抑制了細胞的生長、遷移和侵襲。circFNDC3B作為miR-1178-3p海綿，抑制癌基因G3BP應(yīng)激顆粒組裝因子2，從而抑制與G3BP2基因相對應(yīng)的SRC/FAK信號通路，circFNDC3B的過表達可以通過靶向miR-1178-3p/G3BP2/SRC/FAK軸來有效控制體外細胞生長和侵襲，并在體內(nèi)控制癌細胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，表明circFNDC3B可成為一個全新的癌癥抑制因子和藥物靶點[38]。

4.2.4??circITCH??circITCH在BC組織中表現(xiàn)下調(diào)，circ-ITCH低表達的BC患者生存期減少。circITCH的強制表達可抑制細胞在體內(nèi)外的生長、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。circITCH通過作為miR-17和miR-224的分子海綿，使miR-17的靶基因p21表現(xiàn)上調(diào)，miR-224靶基因PTEN的表現(xiàn)上調(diào)，進而抑制BC的侵襲性生物學(xué)行為[39]。

4.2.5??circLPAR1??circLPAR1在MIBC組織中表達下調(diào)。相比于表達上調(diào)患者，circLPAR1表達下調(diào)的患者特異性生存期更短。circLPAR1可以與miR-762結(jié)合并抑制其作為miRNA海綿的活性，即circLPAR1在miR-762的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[40]。

5??小結(jié)與展望

circRNA是BC進程中的重要因素，circRNA為BC的診斷、預(yù)后和治療提供了新的視角。多種circRNAs在BC組織中有差異表達，且其功能失調(diào)程度與BC患者的臨床病理特征直接相關(guān)。circRNA具有高度穩(wěn)定性、高豐度及在不同體液中的廣泛分布的特點，既是有前景的治療和預(yù)后生物標(biāo)志，也是BC的潛在治療靶標(biāo)。盡管在circRNA研究領(lǐng)域已取得了許多進步，但仍有許多局限性。首先，circRNA的生物發(fā)生、更新、作用機制和功能尚不清楚，與功能未知的大量circRNA相比，僅驗證了少數(shù)circRNA的功能。其次，circRNA在組織細胞中的特異性表達是怎樣被調(diào)控的，目前還不明確，需要進一步的驗證。最后，大多數(shù)研究的樣本量很小，通常缺乏不同組織學(xué)等級和病理學(xué)階段的表達譜，而且統(tǒng)一規(guī)范的circRNA命名系統(tǒng)也應(yīng)該盡快被建立起來。

綜上所述，由于circRNA的產(chǎn)生過程和功能更加豐富了真核生物轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性與多樣性，充實了后基因組時代的研究內(nèi)容，因此，對這類非編碼RNA的研究具有潛在的治療和研究應(yīng)用價值，但circRNA領(lǐng)域的研究仍處于起步階段，今后仍需做大量的研究。

[參考文獻][1] National?Health?Commission?of?the?Peoples?Republic?of?China.?Chinese?guidelines?for?diagnosis?and?treatment?of?urothelial?carcinoma?of?bladder?2018?（English?version）[J].?Chin?J?Cancer?Res，?2019，?31（1）：?49–66.

[9] LIANG?D，?TATOMER?D?C，?LUO?Z，?et?al.?The?output?of?protein-coding?genes?shifts?to?circular?RNAs?when?the?pre-mRNA?processing?machinery?is?limiting[J].?Mol?Cell，?2017，?68（5）：?940–954.?e3.

[16] ABDELMOHSEN?K，?PANDA?A?C，?MUNK?R，?et?al.?Identification?of?HuR?target?circular?RNAs?uncovers?suppression?of?PABPN1?translation?by?circPABPN1[J].?RNA?Biol，?2017，?14（3）：?361–369.

[24] ABE?N，?MATSUMOTO?K，?NISHIHARA?M，?et?al.?Rolling?circle?translation?of?circular?RNA?in?living?human?cells[J].?Sci?Rep，?2015，?5：?16435.

[33] ZHUANG?C，?HUANG?X，?YU?J，?et?al.?Circular?RNA?hsa_circ_0075828?promotes?bladder?cancer?cell?proliferation?through?activation?of?CREB1[J].?BMB?Rep，?2020，?53（2）：?82–87.