張雅倫 陳晨 王慧 張同賀 張雙 李獻(xiàn) 李永波

摘 要：為實(shí)現(xiàn)肉類食品中大腸桿菌快速檢驗(yàn)，研制出大腸桿菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）檢驗(yàn)即用型質(zhì)控樣品，可以直接溶解使用，無需再次培養(yǎng)，并系統(tǒng)分析了質(zhì)控樣品的均勻性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明：經(jīng)篩選得到凍干基質(zhì)最佳條件，質(zhì)控樣品存活率均在90%以上；質(zhì)控樣品培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果F=0.567，小于臨界值，證明均勻性好；質(zhì)控樣品在37 ℃和25 ℃環(huán)境下放置14 d后菌株計(jì)數(shù)穩(wěn)定，在－20 ℃和4 ℃環(huán)境下貯藏28 d復(fù)蘇率分別為101.5%和99.6%，在37 ℃和－20 ℃環(huán)境下貯藏28 d后的MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果仍保持一致，表明樣品穩(wěn)定性好，滿足作為質(zhì)控樣品的要求。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)；大腸桿菌；定性質(zhì)控樣品；均勻性；穩(wěn)定性

Development of Ready-to-Use Quality Control Samples for Rapid Detection of Escherichia coli in Meat and Meat Products

ZHANG Yalun， CHEN Chen， WANG Hui， ZHANG Tonghe， ZHANG Shuang， LI Xian， LI Yongbo*

（Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health， Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation， Hebei Food Safety Key Laboratory， Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050071， China）

Abstract： This paper developed a ready-to-use quality control sample which can be directly used without secondary culture for the rapid detection of Escherichia coli in meat and meat products by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. The sample was evaluated for homogeneity and stability. The results showed that the survival rate of the quality control sample prepared using the selected cryoprotectant was above 90%. The culture count result of the quality control sample （F = 0.567） was less than the critical value， suggesting good uniformity. The quality control sample was stable for 14 days at 37 and 25 ℃， and the resuscitation rates were 101.5% and 99.6% at ?20 and 4 ℃ for 28 days， respectively. After 28 days of storage at 37 and ?20 ℃， the results of MALDI-TOF-MS were consistent， indicating that the developed sample had good stability and met the requirements of quality control samples.

Keywords： matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry; Escherichia coli; qualitative control samples; homogeneity; stability

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127

中圖分類號(hào)：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）03-0046-05

引文格式：

張雅倫， 陳晨， 王慧， 等. 肉類食品中大腸桿菌快速檢驗(yàn)即用型質(zhì)控樣品研制[J]. 肉類研究， 2023， 37（3）： 46-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yalun， CHEN Chen， WANG Hui， et al. Development of ready-to-use quality control samples for rapid detection of Escherichia coli in meat and meat products[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 46-50. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肉類食品是人們不可或缺的食物，補(bǔ)充人體所需的必要元素[1-2]。腐敗和病原微生物是肉類和肉制品中的污染物，微生物病原體引起的食源性感染是發(fā)病率和死亡率升高的重要原因，對(duì)食品質(zhì)量和安全有相當(dāng)大的影響，且可能存在于食品產(chǎn)業(yè)鏈各個(gè)環(huán)節(jié)[3-6]。大腸桿菌是人類和動(dòng)物腸道中作為共生生物最具代表性的革蘭氏陰性菌，具有莢膜、脂多糖、外毒素等多種毒性物質(zhì)，是一種重要的食源性病原體[7-9]，但肉類食品極易受到大腸桿菌污染，尤其是生肉類和加工過程中的肉制品為主要污染源[10-11]，人體攝入大腸桿菌污染過后的肉類食品可引起不同的疾病綜合征，如不同類型的腹瀉疾病、傷口感染，甚至?xí)鹈庖咝约膊〉?，極大損害人體健康[12-13]。因此，大腸桿菌的早期和快速檢測(cè)對(duì)于確保肉類食品安全至關(guān)重要[14]。

現(xiàn)行檢驗(yàn)肉類食品中大腸桿菌的方式仍為以分離培養(yǎng)、生化鑒定為主的傳統(tǒng)檢測(cè)策略，需要大量的時(shí)間和經(jīng)驗(yàn)豐富的人員[15]。這些檢驗(yàn)方式不適應(yīng)新時(shí)代快速、精準(zhǔn)的檢驗(yàn)需求[16-19]，勢(shì)必極大影響食品的安全管理和有效監(jiān)測(cè)?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是快速鑒定新方法，具有前處理簡(jiǎn)單和高通量的特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知微生物的快速鑒定、分型、溯源等[20-22]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床微生物、食源性致病菌及動(dòng)物源性致病菌的快速鑒定[23-25]。雖然大腸桿菌可以使用MALDI-TOF-MS快速鑒定[26-28]，但此方法的質(zhì)量控制樣品缺失嚴(yán)重限制了我國(guó)食品快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

本研究通過真空冷凍技術(shù)成功研制即用型大腸桿菌質(zhì)控樣品，系統(tǒng)分析該樣品均勻性和穩(wěn)定性。通過優(yōu)化制備條件，得到存活率最高的質(zhì)控樣品，通過菌落計(jì)數(shù)和MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性，旨在作為質(zhì)控樣品用于肉類食品中大腸桿菌快速檢測(cè)，使MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)有準(zhǔn)則可以依據(jù)，提高鑒定的準(zhǔn)確性，增加我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的權(quán)重，提升食品安全突發(fā)事件的處置能力和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)預(yù)警能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（CMCC 43201） 中國(guó)食品檢驗(yàn)研究院。

乙醇、甲酸、乙腈、蔗糖、葡聚糖 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；1640細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)譜靶板基質(zhì)液 德國(guó)Bruker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BHC-300IIA/B3生物安全檢驗(yàn)柜 蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司；MS3振蕩混勻器 美國(guó)IKA公司；HVE-50滅菌器 日本Hirayama公司；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱?日本Sanyo公司；3K15冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；autoflex maX LIN MALDI-TOF-MS儀 德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干基質(zhì)的篩選

凍干基質(zhì)的種類和各成分之間的比例關(guān)系是影響質(zhì)控樣品穩(wěn)定性最重要的因素之一。將培養(yǎng)好的大腸桿菌依據(jù)不同凍干基質(zhì)種類和比例進(jìn)行真空冷凍干燥后，通過復(fù)溶測(cè)定樣品凍干存活率，確定最佳凍干基質(zhì)條件，凍干存活率按下式計(jì)算。

選用基質(zhì)種類分別為1640細(xì)胞培養(yǎng)基、蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脫脂乳粉，按照不同比例配制不同基質(zhì)進(jìn)行研究。

1.3.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

分別配制質(zhì)量濃度為5、10、15 g/100 mL的脫脂乳粉，對(duì)應(yīng)配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖（5%、10%、15%、20%）為凍干基質(zhì)，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復(fù)溶，測(cè)定存活率，篩選凍干基質(zhì)。

1.3.1.2 1640細(xì)胞培養(yǎng)基

選取1640細(xì)胞培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)原料，其他凍干基質(zhì)為蔗糖、葡聚糖、BSA。蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)使用1.3.1.1節(jié)得到的結(jié)果，對(duì)葡聚糖（2%、4%、6%、8%、10%）和BSA（1%、3%、5%、10%）的比例進(jìn)行研究，按照1.3.2方式進(jìn)行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復(fù)溶，測(cè)定存活率，篩選凍干基質(zhì)。

1.3.2 大腸桿菌質(zhì)控樣品制備

將大腸桿菌劃線接種于PCA平板上，放置于36 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽刮取培養(yǎng)好的菌苔，混懸于篩選過后的凍干基質(zhì)中，使用紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液濃度，波長(zhǎng)650 nm，使其OD650 nm為2.5左右。使用微量移液器吸取100 μL菌懸液快速滴入含有液氮的西林瓶中，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行質(zhì)控樣品制備，真空冷凍干燥機(jī)預(yù)凍程序?yàn)椋?0 ℃、200 min，－40 ℃、200 min；冷凍干燥程序?yàn)椋?5 ℃、360 min、真空度130 mTorr，－30 ℃、360 min、真空度130 mTorr，－25 ℃、480 min、真空度130 mTorr，－20 ℃、480 min、真空度130 mTorr，－10 ℃、480 min、真空度130 mTorr。程序結(jié)束時(shí)保存為－20 ℃、真空度100 mTorr狀態(tài)，制備質(zhì)控樣品。

1.3.3 大腸桿菌質(zhì)控樣品均勻性驗(yàn)證

采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方式驗(yàn)證質(zhì)控樣品均勻性，將制備好的樣品進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，通過選定號(hào)碼，確定20 個(gè)質(zhì)控樣品進(jìn)行均勻性研究，通過培養(yǎng)計(jì)數(shù)方式對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行定量檢測(cè)驗(yàn)證均勻性。吸取1 mL無菌水分別加入質(zhì)控樣品中，讓樣品復(fù)溶，通過多次稀釋后均勻涂布在平板上，同時(shí)做2 次平行實(shí)驗(yàn)，將平板置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定大腸桿菌數(shù)量。

1.3.4 大腸桿菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證

1.3.4.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性驗(yàn)證

將制備好的大腸桿菌質(zhì)控樣品分別保存在37 ℃和25 ℃環(huán)境中，進(jìn)行14 d的穩(wěn)定性研究，分別在0、1、2、3、5、7、14 d進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做3 次平行實(shí)驗(yàn)。通過數(shù)值變化驗(yàn)證樣品在較高溫度下的運(yùn)輸穩(wěn)定性，以及能否作為質(zhì)控樣品進(jìn)行實(shí)際發(fā)樣運(yùn)輸。

1.3.4.2 貯藏穩(wěn)定性驗(yàn)證

將質(zhì)控樣品分別保存在4 ℃和－20 ℃環(huán)境中，進(jìn)行28 d的穩(wěn)定性研究。穩(wěn)定性檢驗(yàn)的時(shí)間間隔可以按先密后疏的原則安排。在使用期間應(yīng)有多個(gè)時(shí)間間隔的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，分別在0、1、3、5、7、14、28 d進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做3 次平行實(shí)驗(yàn)。通過復(fù)蘇率驗(yàn)證樣品在低溫下的貯藏穩(wěn)定性，以及能否穩(wěn)定保存。

1.3.4.3 MALDI-TOF-MS穩(wěn)定性驗(yàn)證

將樣品分別在37 ℃和－20 ℃環(huán)境中保存28 d后進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)，導(dǎo)入BN軟件進(jìn)行分析整合，研究質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS穩(wěn)定性。

1.3.5 大腸桿菌質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)

制備的質(zhì)控樣品進(jìn)行MALDI-TOF-MS時(shí)可以直接溶解使用，無需再次培養(yǎng)。

1.3.5.1 樣品前處理

將密封的質(zhì)控樣品開啟，將凍干菌球取出放入離心管內(nèi)，加入100 μL滅菌水使其復(fù)溶，12 500 r/min離心5 min，去除上清液，保留沉淀，重復(fù)進(jìn)行3 次。

1.3.5.2 樣品靶板制作

向沉淀中添加50 μL體積分?jǐn)?shù)70%甲酸，充分裂解2 min，添加50 μL乙腈，充分溶解后，以12 500 r/min離心5 min，取1 μL上清液到靶板相應(yīng)位置，靜置，待溶液揮發(fā)完成，取1 μL質(zhì)譜靶板基質(zhì)液到同樣位置，靜置，待溶液揮發(fā)完成，進(jìn)行后續(xù)MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法對(duì)質(zhì)控樣品均勻性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干基質(zhì)的篩選結(jié)果

凍干基質(zhì)種類繁多，其構(gòu)成、種類和比例不同均會(huì)導(dǎo)致菌株活菌數(shù)發(fā)生變化。

2.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

由表1可知，5 g/100 mL脫脂乳粉、15%蔗糖保護(hù)劑的凍存效果最好，凍干存活率為95%。但在后續(xù)MALDI-TOF-MS檢測(cè)中，在m/z 2 000～20 000出現(xiàn)了溶劑雜峰，影響對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)，因此不能用脫脂乳粉作保護(hù)劑。

2.1.2 1640細(xì)胞培養(yǎng)基

因脫脂乳粉無法使用，選取1640細(xì)胞培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)原料。由表2可知，8%葡聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量40 000）、5% BSA保護(hù)劑的凍存效果最好，凍干存活率為95%。但是加入BSA后，在后續(xù)MALDI-TOF-MS檢測(cè)中也在m/z 2 000～20 000出現(xiàn)了溶劑雜峰，影響對(duì)目標(biāo)菌的檢測(cè)，所以需要去除BSA。

2.1.3 多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

得到篩選過后的凍干溶劑為1640細(xì)胞培養(yǎng)基，其中蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由表3可知，最高存活率為95%，存活率均在90%以上，在后續(xù)MALDI-TOF-MS檢測(cè)時(shí)m/z 2 000～20 000沒有出現(xiàn)溶劑雜峰，可以作為凍干菌球的保護(hù)劑。

2.2 大腸桿菌質(zhì)控樣品均勻性驗(yàn)證結(jié)果

由表4可知，20 瓶大腸桿菌質(zhì)控樣品計(jì)數(shù)結(jié)果較為統(tǒng)一，沒有發(fā)生較大波動(dòng)，說明樣品均勻性良好。

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法，對(duì)樣品的均勻性進(jìn)行檢驗(yàn)。FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表5可知，根據(jù)SPSS軟件計(jì)算的F=0.486＜FINV（0.05，19，20）臨界值，菌株計(jì)數(shù)穩(wěn)定，側(cè)面驗(yàn)證定性結(jié)果均一，表明該樣品均勻性符合要求。

2.3 大腸桿菌質(zhì)控樣品穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

由表6可知，質(zhì)控樣品在37 ℃放置14 d后，大腸桿菌計(jì)數(shù)仍維持在106 CFU，在25 ℃環(huán)境下，質(zhì)控樣品計(jì)數(shù)較37 ℃更加穩(wěn)定，證明質(zhì)控樣品運(yùn)輸穩(wěn)定性良好。

2.3.2 貯藏穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

由表7可知，質(zhì)控樣品在－20 ℃放置28 d復(fù)蘇率為97.78%，在4 ℃放置28 d復(fù)蘇率為95.00%，說明大腸桿菌質(zhì)控樣品貯藏穩(wěn)定性良好。

2.3.3 MALDI-TOF-MS穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

由圖1～2可知，在不同溫度條件下用MALDI-TOF-MS

檢測(cè)大腸桿菌質(zhì)控樣品，結(jié)果穩(wěn)定，譜圖一致，說明質(zhì)控樣品MALDI-TOF-MS測(cè)定穩(wěn)定性良好，可以作為陽性質(zhì)控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)中使用。

3 結(jié) 論

肉類食品中大腸桿菌危害較大，但檢驗(yàn)方式多為生化培養(yǎng)，檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致污染控制問題無法有效控制[29-30]，不能滿足快速檢驗(yàn)需求。MALDI-TOF-MS作為精準(zhǔn)、高通量檢測(cè)手段正在逐步應(yīng)用于日常微生物檢測(cè)，但因沒有相應(yīng)匹配的質(zhì)控樣品，導(dǎo)致沒有方法規(guī)范檢測(cè)數(shù)據(jù)，嚴(yán)重制約了MALDI-TOF-MS的發(fā)展。

本研究通過優(yōu)化凍干基質(zhì)條件，成功研制出大腸桿菌即用型質(zhì)控樣品，樣品通過直接溶解方式，無需再次培養(yǎng)，可以用于肉類食品中大腸桿菌MALDI-TOF-MS快速檢驗(yàn)，并通過樣品復(fù)溶計(jì)數(shù)方式驗(yàn)證均勻性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本質(zhì)控樣品F=0.486，小于臨界值，證明樣品有良好的均勻性，保障了作為質(zhì)控樣品的一致性；37 ℃和25 ℃環(huán)境條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本樣品具有良好的運(yùn)輸穩(wěn)定性，保證了樣品在實(shí)際運(yùn)輸過程中不會(huì)變質(zhì)；4 ℃和－20 ℃環(huán)境條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了本樣品具有良好的貯藏穩(wěn)定性，保證了作為質(zhì)控樣品的長(zhǎng)期有效性；樣品在37 ℃和－20 ℃環(huán)境中貯藏28 d后的MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果一致，說明樣品能夠作為質(zhì)控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗(yàn)中穩(wěn)定使用，為MALDI-TOF-MS技術(shù)檢驗(yàn)肉類食品中大腸桿菌提供了校檢方式，保證了檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定、可靠。

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收稿日期：2022-09-19

基金項(xiàng)目：河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2022ZD10）

第一作者簡(jiǎn)介：張雅倫（1991—）（ORCID： 0000-0001-5441-969X），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

E-mail： 11490405113@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：李永波（1988—）（ORCID： 0000-0001-5827-1186），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

E-mail： 913557305@qq.com