徐文珍,鄧澤元,李紅艷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西 南昌 330031)

機體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)失衡,是造成機體氧化應(yīng)激的重要原因,其中活性氧的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌細胞損傷的主要因素之一[1,2]。過氧化氫(H2O2)是致使細胞氧化應(yīng)激的重要因子,使細胞產(chǎn)生大量ROS,加速凋亡進程,進而誘發(fā)心血管疾病。H2O2對心肌細胞的氧化損傷是實驗室中用來模擬心肌細胞損傷的常用方法[3]。

適量的免疫因子可以提高機體抵抗外界刺激和修復(fù)機體損傷的能力,而持續(xù)過量的刺激物產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)則會引起細胞的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細胞的損傷和凋亡[4]。腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是體內(nèi)重要的炎癥細胞因子,在急性心肌梗死、冠狀動脈硬化及心力衰竭等心血管疾病中起著重要作用[5],TNF-α可誘導(dǎo)趨化因子和細胞粘附分子,從而誘導(dǎo)心肌細胞損傷和破壞心肌組織[6,7]。TNF-α激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB( nuclear factor κB,NF-κB),NF-κB信號通路的激活可以干預(yù)炎癥反應(yīng)。

然而,傳統(tǒng)的心肌細胞損傷模型往往采用單一的高濃度脂多糖(LPS)或TNF-α誘導(dǎo)炎癥損傷,或者單一地用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,并不能達到心肌細胞同時產(chǎn)生氧化應(yīng)激和慢性炎癥的效果。所以,本研究以低濃度TNF-α聯(lián)合H2O2共同誘導(dǎo)大鼠心肌細胞,同時達到氧化和炎癥損傷的效果,為抗氧化、抗炎作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

從武漢普諾賽生物購入大鼠心肌細胞(H9c2)。

1.2 儀器與試劑

EXL800全自動酶標(biāo)儀購買自美國Biotek Instruments有限公司;FACS Calibur流式細胞儀購買自美國Becton Dickinson公司;轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像儀和CRX96 Touch 實時定量PCR均購買自美國Bio-Rad公司;自蛋白質(zhì)電泳儀購買自北京六一生物科技有限公司;Nano Drop 8000超微量分光光度計購自Thermo Fisher科技公司;Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機和JY-86-2-50型-80 ℃冰箱均購買自香港力康發(fā)展有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋購買自國華電器有限公司;GPST200型CO2恒濕恒溫培養(yǎng)箱均購買自長沙長錦科技有限公司;37XC (XDS-1A)型倒置顯微鏡購買自上海蔡康化學(xué)儀器公司;BHC-1300A/B3型生物安全柜購買自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

TNF-α購于美國PeproTech有限公司;二甲基亞砜和30 % H2O2溶液購于美國Sigma 公司;胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購于以色列Biolnd公司;鏈霉素/青霉素、胰蛋白酶、丙酮酸鈉和DEPC水購于北京索萊寶科技有限公司;磷酸緩沖鹽(PBS)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;活性氧(ROS)檢測試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA、蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑苯基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluorid ,PMSF)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;南京建成生物工程研究所購入TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒;TRIzolTMReagent購于Thermo Fisher科技公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser (Perfect Real Time)和Beastar? qPCR mastermix(SYBR Green)購于日本TaKaRa公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細胞培養(yǎng)

用10%胎牛血清+ 1%青霉素-鏈霉素+1%丙酮酸鈉配制成10% DMEM完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細胞,將細胞傳代后放在37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測H2O2和TNF-α對H9c2大鼠心肌細胞細胞活力的影響

將H9c2細胞以5×104mL接種到96孔板中,在細胞達到70%～90%細胞密度后舍棄原始培養(yǎng)基,將藥物按一定的劑量進行分組處理。采用0(Control組),50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1H2O2處理H9c2細胞1 h。在確定TNF-α的最佳濃度實驗中,采用0(Control組),10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α處理H9c2細胞12 h,每組 6 個復(fù)孔。倒掉舊培養(yǎng)基,用 PBS 洗滌 2 次。每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱孵育1 h,在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取光密度(OD) 值,以公式“細胞存活率 = OD待測孔/O D對照孔×100%” 計算各組細胞存活率,以反映細胞的增殖活性。在后續(xù)研究中,按照細胞存活率分別選取了H2O2和TNF-α的最佳刺激劑量。

1.5 流式細胞術(shù)檢測H9c2細胞內(nèi)ROS水平

將H9c2細胞以5×104mL接種到十二孔板中,細胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進行分組處理。隨后,用無血清培養(yǎng)基將DCFH-DA配制成5 μmol·L-1。PBS清洗3次后,每孔加入500 μL DCFH-DA,37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min[8]。加入無血清培養(yǎng)基清洗3次,加入0.15%的胰酶消化液,收集細胞后離心,流式細胞儀檢測熒光強度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗

將H9c2細胞以5×104mL接種到十二孔板中,細胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進行分組處理。采用0(Control組),10,20,40,60,80,100 ng·mL-1TNF-α誘導(dǎo)H9c2細胞12 h后,收集H9c2細胞上清液后,根據(jù)ELISA試劑盒的使用方法,按步驟檢測TNF-α和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌量。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測大鼠心肌細胞炎癥相關(guān)蛋白的表達

H9c2細胞接種到小平皿中,細胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進行分組處理。采集各組H9c2細胞,加入配制的冰冷裂解液(1 mL RAPA中加入10 μL蛋白磷酸酶抑制劑和10 μL苯甲基磺酰氟),在冰上裂解 30 min 后,離心并收集上清液,提取細胞總蛋白,然后使用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,用10% SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白質(zhì)分離,隨后利用恒流轉(zhuǎn)到PVDF膜上[9]。隨后用5%脫脂乳在室溫下封閉PVDF膜2 h,并與相應(yīng)的一抗[ICAM(1：5000),TNF-α(1：1000),IL-6(1：1000),VCAM(1：3000)]4 ℃ 孵育過夜。TBST清洗3個10 min,3個5 min后,將膜和相應(yīng)二抗置于搖床上孵育2 h 。最后,利用ECL化學(xué)發(fā)光液,避光孵育10～30 s,用凝膠成像儀對目的條帶拍照,并用 Image Lab 軟件對其進行分析,以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與 β-actin 條帶灰度值比值為指標(biāo)進行蛋白質(zhì)表達的相對定量[9]。

1.6 SOD和MDA水平

將H9c2細胞以5×104mL接種到十二孔板中,細胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進行分組處理。采用Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2處理1 h組和200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組,分別誘導(dǎo)H9c2細胞后,用組織裂解液裂解細胞后收集H9c2細胞上清液,參照SOD酶活力檢測分析試劑盒測定細胞內(nèi)SOD活力,參照MDA檢測試劑盒測定細胞內(nèi)MDA活性。

1.7 熒光定量PCR技術(shù)測定炎癥因子mRNA的表達

H9c2細胞接種到六孔板中,細胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進行分組處理。實驗分為采用Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2處理1 h組和200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組誘導(dǎo)H9c2細胞。隨后,PBS清洗3次,每孔加入1mL的TRIzol 試劑,4 ℃孵育10 min,將細胞吹散后,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,加入200 μL三氯甲烷后用力上下振蕩,室溫靜置10 min,后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min),吸取上清液至新的干凈EP管中,加入500 μL異丙醇,輕柔上下?lián)u晃混勻,靜置10 min后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min)。管壁可觀察到RNA沉淀,棄上清后加入1 mL 75%乙醇,靜置5 min后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min)。最后,吸掉多余上清,將RNA沉淀至于無菌操作臺晾干,加入20 μL DEPC水混勻,后利用超微量核酸分析儀測定濃度,判斷RNA樣品純度。為了測定各樣品的 TNF-α、IL-6、VCAM mRNA 表達,TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄,并采用 SYBR Green PCR Master Mix 擴增反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物,將cDNA作為模板進行熒光定量PCR,利用熒光定量PCR 儀進行擴增。引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列如表1所示。對β-actin的mRNA表達進行標(biāo)準(zhǔn)化,根據(jù)2(-ΔΔCt)法計算每種mRNA的基因表達的相對定量。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of target gene

1.8 統(tǒng)計分析

通過 GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理,采用SPSS 26.0單因素方差分析進行統(tǒng)計處理,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,以Duncan多重比較進行顯著性分析,p<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度H2O2對H9c2細胞的細胞活力和ROS水平的影響

采用CCK-8法測定H9c2細胞活力,如圖1A所示,與Control組(100%)相比,50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1H2O2組作用1 h后,H9c2細胞存活率分別下降至92%±1.6%、83%±1.4%、75%±3.5%、59%±2.6%、36%±1.9%、23%±0.29%、23%±0.21%。隨著H2O2濃度升高,大鼠心肌細胞細胞活力不斷降低。當(dāng)H2O2濃度高于100 μmol·L-1時,細胞活力顯著下降,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系(p<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為200 μmol·L-1時,細胞存活率為59%±2.6%,表明細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),但是當(dāng)細胞活力低于40%時,細胞氧化損傷嚴(yán)重,無法進行修復(fù)。

如圖1B所示,與Control組相比,不同濃度(50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1)H2O2作用1 h后,均對H9c2細胞造成了不同程度的氧化損傷。與Control組(100%)相比,50 μmol·L-1H2O2組H9c2細胞內(nèi)ROS水平(97%±8.26%)無顯著性差異;100、150、200、250 μmol·L-1H2O2組H9c2細胞內(nèi)ROS水平上升至 166%±14.8%、276%±3.04%、266%±13.9%、107%±4.78%;300、350 μmol·L-1H2O2組H9c2細胞內(nèi)ROS水平下降至83%±12.6%、84%±10%。當(dāng)H2O2濃度為0～150 μmol·L-1時,細胞內(nèi)ROS水平顯著升高(p<0.05),且呈劑量依賴性;當(dāng)H2O2濃度為150或200 μmol·L-1時,細胞內(nèi)ROS水平達到最大。

結(jié)合H2O2對H9c2細胞的細胞活力和ROS水平,初步將H2O2濃度設(shè)為200 μmol·L-1。此時,ROS水平達到較高水平,細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),不會導(dǎo)致立即細胞死亡,但在抗氧化活性物質(zhì)作用下,還可能被修復(fù)。

H2O2濃度/(μmol·L-1)

H2O2濃度/(μmol·L-1)

2.2 不同劑量TNF-α對H9c2細胞的細胞活力和ROS生成的影響

如圖2A所示,0(Control組),10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α組H9c2細胞存活率分別為100%、112%±0.89%、109%±2%、107%±2%、107%±1.1%、110%±1%、111%±1.8%、106%±1.7%,與Control組相比,沒有顯著性差異(p>0.05)。當(dāng)TNF-α低于200 ng·mL-1時,對H9c2細胞沒有毒性作用。

如圖2B所示,與Control組相比,與Control組(100%)相比,10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α組H9c2細胞內(nèi)ROS水平分別上升至103%±26.23%、168%±33.6%、169%±6%、126%±8.7%、213%±%、314%±40.6%。與Control相比,當(dāng)TNF-α作用濃度低于60 ng·mL-1時,細胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05);當(dāng)TNF-α作用濃度高于60 ng·mL-1時,細胞內(nèi)ROS水平顯著提高(p<0.05)。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

2.3 不同劑量TNF-α對H9c2細胞中炎癥因子釋放的影響

如圖3A所示,0(Control組)、1、10、20、40、60、80、100 ng·mL-1TNF-α組作用12 h后,H9c2細胞上清液中IL-1β釋放量分別約為7.5、4.6、7.7、7.1、7.4、8.6、8.2、8.8 ng·mL-1。與Control組相比,不同劑量TNF-α作用12 h后,細胞上清液中IL-1β釋放量沒有顯著性差異(p>0.05)。如圖3B所示,與Control組(4.4 ng·mL-1)相比,10、20、40、60、80、100 ng·mL-1TNF-α組作用12 h后,H9c2細胞上清液中TNF-α釋放量分別上升至6.5±0.3、6.7±0.45、6±0.34、7.9±0.4、7.1±0.59、5.3±0.3 ng·mL-1。當(dāng)使用TNF-α濃度高于10 ng·mL-1的TNF-α作用12 h后,細胞上清液中TNF-α釋放量顯著增強(p<0.05)。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

綜合細胞內(nèi)ROS水平、上清液IL-1β釋放量、上清液TNF-α釋放量,初步選擇80 ng·mL-1TNF-α誘導(dǎo)H9c2細胞炎癥損傷。此時,ROS水平和上清液TNF-α釋放量均與Control組有顯著性差異,為Control組的2倍左右,提示出現(xiàn)炎癥損傷。

2.4 不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對H9c2細胞ROS水平的影響

與Control組相比,100、150、200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α作用12 h后,各組H9c2細胞內(nèi)ROS水平分別上升至456%±106.4%、639%±60%、845%±8.3%。當(dāng)H2O2濃度不斷增大時,H9c2細胞內(nèi)ROS水平也不斷增高。200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α作用B12 h后,細胞內(nèi)ROS水平增至最大,約為Control組的8.5倍。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

2.5 200 μmol·L-1 H2O2聯(lián)合不同劑量TNF-α對H9c2細胞炎癥因子蛋白表達的影響

采用200 μmol·L-1的H2O2處理1 h聯(lián)合不同劑量TNF-α處理12 h,與Control組相比,TNF-α相對蛋白表達量沒有顯著性差異(p>0.05),但是,IL-6和ICAM的相對蛋白表達量顯著增加(p<0.05)。200 μmol·L-1的H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α處理12 h,炎癥因子ICAM相對蛋白表達量增至Control組的2.5倍,炎癥因子IL-6相對蛋白表達量增至Control組的2.2倍,顯著高于Control組,提示出現(xiàn)炎癥損傷。

綜合不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對H9c2細胞ROS水平以及不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2對H9c2細胞炎癥因子蛋白表達的影響,結(jié)果表明200 μmol·L-1的H2O2和80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合能同時誘導(dǎo)H9c2細胞內(nèi)氧化應(yīng)激(ROS水平達到最大)和炎癥損傷(ICAM、IL-6和TNF-α炎癥因子等蛋白表達水平顯著高于Control組)。

圖5 不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對H9c2細胞炎癥因子蛋白表達的影響。A為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對H9c2細胞ICAM蛋白表達的影響,B為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對H9c2細胞TNF-α蛋白表達的影響,C為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對H9c2細胞IL-6蛋白表達的影響.。不同字母(a,b,c,d)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

為了驗證200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h誘導(dǎo)H9c2細胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷模型的建立是否成功,分別探索了Control組、單一的氧化損傷組(只加200 μmol·L-1H2O2作用1 h組)、單一的炎癥損傷組(只加80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)和聯(lián)合組(200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)的氧化損傷指標(biāo)(SOD和MDA水平)和炎癥損傷指標(biāo)(炎癥因子蛋白水平表達和基因水平表達)方面的差異。若聯(lián)合組的氧化損傷指標(biāo)不亞于單一的氧化損傷組且炎癥損傷指標(biāo)不亞于單一的炎癥損傷組,則提示模型建立成功。

2.6 TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞SOD和MDA水平的影響

如圖6所示,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組的SOD和MDA水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05),說明80 ng·mL-1TNF-α雖然能引起細胞內(nèi)ROS水平增加,但并不引起抗氧化相關(guān)酶的變化。但是,加了200 μmol·L-1H2O2(200 μmol·L-1H2O2組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組)后,MDA水平顯著上升且SOD抗氧化酶活性顯著下降(p<0.05),SOD和MDA水平呈現(xiàn)出負相關(guān)。

圖6 TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞SOD和MDA水平的影響。A表示TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞SOD水平的影響,B表示TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞MDA水平的影響。不同字母(a,b)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

2.7 TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞炎癥因子蛋白表達的影響

為了驗證模型的成功與否,本研究用Western Blot法和Q-PCR分別探索了不同組別(Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2作用1 h組和200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)炎癥因子蛋白表達和基因水平的影響。C通過Western Blot法探索炎癥因子蛋白表達的變化,從圖7可以看出:與Control組相比,只加200 μmol·L-1H2O2組的ICAM、VCAM和IL-6蛋白表達水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05),說明只加200 μmol·L-1H2O2組并不引起炎癥因子蛋白表達的變化,200 μmol·L-1H2O2并不能誘導(dǎo)炎癥損傷。但是,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組的ICAM、VCAM和IL-6蛋白的表達顯著上升(p<0.05),說明80 ng·mL-1TNF-α能提高炎癥因子蛋白表達。

圖7 TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞炎癥因子蛋白的影響。A表示TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞VCAM蛋白表達的影響。B表示TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞ICAM蛋白表達的影響。C表示TNF-α聯(lián)合H2O2對H9c2細胞IL-6蛋白表達的影響。不同字母(a,b)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

基因可以調(diào)節(jié)蛋白表達,因此本研究檢測了促炎因子VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平。從圖8可以看出:與Control組相比,只加200 μmol·L-1H2O2組的VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA表達量沒有顯著性差異(p>0.05),說明只加200 μmol·L-1H2O2組并不引起炎癥因子VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA的表達。但是,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組的VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA的表達顯著上升(p<0.05),說明80 ng·mL-1TNF-α能提高炎癥因子mRNA的表達。

VCAM

IL-6

TNF-α

3 討論

心血管疾病進程中,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)大量累積,使心肌細胞凋亡[10]。心血管疾病發(fā)病機制很復(fù)雜,很多心血管疾病與氧化應(yīng)激和慢性炎癥密不可分。如動脈粥樣硬化和心肌梗死,氧化應(yīng)激和系統(tǒng)性炎癥是其最突出的特征[11,12]。氧化應(yīng)激增加了炎癥反應(yīng),持續(xù)的炎癥產(chǎn)生了大量的活性氧。

本研究采用TNF-α聯(lián)合H2O2誘導(dǎo)H9c2細胞,同時建立細胞氧化應(yīng)激和慢性炎癥模型。通過CCK-8實驗、流式細胞術(shù),發(fā)現(xiàn)200 μmol·L-1H2O2刺激H9c2細胞1 h細胞存活率為55%;細胞內(nèi)活性氧水平增至266%,初步以200 μmol·L-1H2O2刺激H9c2細胞1 h用于構(gòu)建H9c2細胞氧化損傷模型。通過CCK-8實驗、流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實驗,發(fā)現(xiàn)采用80 ng·mL-1TNF-α刺激H9c2細胞12 h,與Control組相比,細胞存活率沒有顯著性差異(p>0.05),細胞內(nèi)的活性氧水平增至213%。上清液中IL-1β釋放量沒有顯著性差異(p>0.05),上清液中IL-6釋放量顯著增加至Control組的1.6倍,初步以80 ng·mL-1TNF-α刺激H9c2細胞12 h用于構(gòu)建H9c2細胞炎癥損傷模型。接著,通過流式細胞術(shù)探索不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對H9c2細胞ROS水平的影響,發(fā)現(xiàn)200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α使H9c2細胞ROS水平增至Control組的8.5倍。本研究通過Western Blot法探索200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合不同劑量TNF-α對H9c2細胞炎癥因子的影響,發(fā)現(xiàn)與Control組相比,TNF-α相對蛋白表達量沒有顯著性差異(p>0.05),但炎癥因子ICAM相對蛋白表達量增至Control組的2.5倍,炎癥因子IL-6相對蛋白表達量增至Control組的2.2倍。所以,80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2顯著增強H9c2細胞內(nèi)ROS水平,顯著增強上清液中炎癥因子IL-6釋放量,顯著增加ICAM和IL-6炎癥因子蛋白的表達(p<0.05)。說明80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2既誘導(dǎo)了細胞氧化應(yīng)激,又誘導(dǎo)了細胞炎癥損傷。

為驗證此模型的成功與否,本研究探索了不同組別(Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α組、只加200 μmol·L-1H2O2組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組)對SOD、MDA氧化應(yīng)激指標(biāo)的差異,以及對相關(guān)炎癥因子在蛋白表達和基因調(diào)控上的差異。超氧化物歧化酶( SOD)是一種調(diào)控氧化應(yīng)激的酶,催化超氧陰離子和H2O2之間的反應(yīng),平衡氧化和抗氧化,保護心肌細胞免受氧化應(yīng)激[13]。丙二醛 (MDA) 是一種脂質(zhì)過氧化物,它在體內(nèi)的大量累積會對人體細胞、組織都有一定的損害。SOD水平反映細胞的抗氧化能力,MDA可以間接反映細胞內(nèi)氧化應(yīng)激造成的損傷程度[14]。SOD水平降低和MDA 的增加都心肌細胞氧化損傷加重。與Control組相比,加了200 μmol·L-1H2O2組MDA水平顯著上升且SOD水平顯著下降(p<0.05),只加80 ng·mL-1TNF-α組SOD 和 MDA水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05)。隨后,本研究分別探索了蛋白和基因方面相關(guān)炎癥因子的表達。結(jié)果表明,加了80 ng·mL-1TNF-α組,在蛋白和基因水平上,一些炎癥因子的表達均顯著提高,尤其是一些黏附因子,如VCAM在mRNA表達上是Control組的350倍左右,并且在蛋白表達上是Control組的4倍左右,ICAM在蛋白表達上是Control組的3倍左右。而這些抗炎因子都是NF-κB信號通路的下游蛋白,結(jié)果提示200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h共同誘導(dǎo)大鼠心肌細胞激活NF-κB信號通路下游蛋白和mRNA的表達,而NF-κB信號通路的異常激活與心肌細胞損傷有密切聯(lián)系[15,16]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB( Nuclear factor κB,NF-κB) 作為一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的重要核因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[17,18]。

綜上所述,200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h共同誘導(dǎo)大鼠心肌細胞,細胞內(nèi)ROS顯著增高,氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平增高,抗氧化酶SOD降低,并激活NF-κB信號通路下游炎癥因子蛋白和mRNA的表達。其作用機理可能與NF-κB信號通路的靶向調(diào)節(jié)有關(guān),結(jié)果可為進一步研究其氧化應(yīng)激和慢性炎癥反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。