關(guān) 瑞,王 玉,曹雷鵬,李聰苗,黃正花,馮碩儒,周 悅,樊瑞娟,劉玉環(huán)

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與工程國家重點實驗室,生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心,江西 南昌 330047)

螺旋藻因其營養(yǎng)價值高而被廣泛應(yīng)用于人類和動物健康補(bǔ)充劑中,如食品和飼料、藥品和個人護(hù)理等,其所有的功能性成分中,蛋白質(zhì)的含量最高(高達(dá)干重的60%～70%),其中必需氨基酸含量高達(dá)8%,是營養(yǎng)全面的純天然蛋白質(zhì)食品源[1-2]。螺旋藻中藻膽蛋白根據(jù)吸收光譜差異主要分為藻藍(lán)蛋白(C-phycocyanin,C-PC)、別藻藍(lán)蛋白(A-phycocyanin,A-PC)及藻紅蛋白(R-phycocyanin,R-PC),其中藻藍(lán)蛋白占螺旋藻干重的20%,可作為天然色素用于食品、化妝品等[3]。藻藍(lán)蛋白是一種多鏈全蛋白,主要由α-亞基(兩個半胱氨酸和兩個甲硫氨酸殘基)和β-亞基(3個半胱氨酸和5個甲硫氨酸殘基)組成,其中每個亞基含有160～180個氨基酸序列,而α3β3環(huán)狀三聚體和(α3β3)2六聚體為藻藍(lán)蛋白的主要存在形式[4]。同時,藻藍(lán)蛋白的發(fā)色團(tuán)主要來源于藻藍(lán)素(線性四吡咯化合物),通過硫醚鍵與載體蛋白連接。C-PC溶液呈現(xiàn)水鈷藍(lán)而A-PC溶液為亮水藍(lán),C-PC和A-PC最大吸收波長分別在620和652 nm[5]。C-PC是一種被廣泛開發(fā)的藻藍(lán)蛋白類的天然藍(lán)色化合物,根據(jù)其620 nm的特征峰值吸光度與280 nm的蛋白質(zhì)吸光度之比的純度等級進(jìn)行劃分,當(dāng)A620/A280≥為0.7時,CPC為食品級;當(dāng)A620/A280為0.7～3.9時,C-PC為試劑級;當(dāng)A620/A280≥為4.0時,C-PC為分析級[6]。C-PC的純度越高,其商業(yè)價值越高,食品級C-PC的價格在于0.9元·mg-1,而分析級C-PC的價格約105元·mg-1[7]。此外,先前的文獻(xiàn)報道高純度的藻藍(lán)蛋白具有抗炎、抗氧化性、抗腫瘤、免疫熒光性等生物活性,可作為藥物成分用于醫(yī)療保健無毒副作用的天然理想物質(zhì)[8-9],因此大量的高純度藻藍(lán)蛋白成為當(dāng)前實現(xiàn)藻藍(lán)蛋白高價值應(yīng)用的迫切需要。

目前研究報道從螺旋藻中提取C-PC的方法有物理、化學(xué)、生物等技術(shù),如超聲、高壓均質(zhì)、反復(fù)凍融、化學(xué)溶劑及酶處理法等[10-13]。Wanida[14]等采用螺旋藻粉為原料,采用超聲細(xì)胞破碎法,10 mmol·L-1磷酸緩沖液、料液比為1：15、功率為750 W、時間5 min,最終得到的C-PC產(chǎn)率和純度分別為60 mg·g-1和0.52。Tavanandi[15]等以螺旋藻干粉為原料,采用凍融法提取藻藍(lán)蛋白,提取條件:0.1 mol·L-1磷酸緩沖液、料液比1：8、浸泡4 h、凍融4 h、解凍1 h,得到C-PC得率和純度分別為73.73 mg·g-1和0.66。目前C-PC提取方法都存在一定的缺陷,如單獨使用超聲細(xì)胞破碎法或凍融法所提取的C-PC產(chǎn)率和純度均比較低,且凍融法耗時較長,化學(xué)法和酶處理法成本較高。C-PC的純化技術(shù)主要有鹽析[16]、柱層析[17]、雙水相萃取[15]、膜過濾[18]等。Marina[19]等利用50 kDa聚醚砜膜超濾藻藍(lán)蛋白粗提液,C-PC純度提高至1.5,之后經(jīng)過離子交換柱,最終得到C-PC純度為3.9,其回收率為79.7%。Ravi[20]等將超聲波細(xì)胞破碎提取的C-PC粗提液,經(jīng)過20%、70%硫酸銨兩步沉淀,再經(jīng)過DEAE-Cellulose陰離子交換柱層析,得到純度為4.03的分析級C-PC?，F(xiàn)有的C-PC分離純化技術(shù)存在不穩(wěn)定、不適合大規(guī)模應(yīng)用、回收率不高等問題[21],為了促進(jìn)藻藍(lán)蛋白的深加工及其高價值應(yīng)用,低成本高效快速生產(chǎn)高純度藻藍(lán)蛋白成為當(dāng)前主要研究方向。

因此,本論文研究目的主要通過超聲耦合高壓均質(zhì)法以低成本高效提取C-PC,并利用鹽析-透析及柱層析方法純化C-PC,以提高C-PC的純度,同時采用SDS-PAGE和色澤分析鑒定所獲得的分析級C-PC的分子量及色澤,為螺旋藻藻藍(lán)蛋白的低成本高效生產(chǎn)及其高價值應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

螺旋藻干藻粉原料(江西中藻生物科技有限公司);硫酸銨、氯化鈉、氯化鋇等均為分析純(廣州西隴科學(xué)股份有限公司);透析袋(8 000～14 000 Da,北京索萊寶科技有限公司);葡聚糖凝膠柱G-75(北京索萊寶科技有限公司);電泳試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);低分子量Marker(北京索萊寶科技有限公司)

紫外可見分光光度計(UV-9000,上海元析儀器有限公司);臺式高速冷凍離心機(jī)(H1850R,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);電腦紫外層析儀(HD-3001,上海嘉鵬科技有限公司);高壓均質(zhì)機(jī)(GJJ-0.06/100,上海臺馳輕工裝備有限公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);電泳系統(tǒng)(Bio-BAD公司);凝膠成像分析儀(WD-9413C,北京六一生物科技有限公司);色差儀(TS7700,深圳市三恩時科技有限公司)。

1.2 藻藍(lán)蛋白的提取方法及條件優(yōu)化

1.2.1 高壓均質(zhì)提取

取50.0 g螺旋藻粉,添加1.0 L超純水制備螺旋藻溶液,后于高壓均質(zhì)機(jī)連續(xù)處理3次,處理壓力分別為0、20、40、60、80 MPa,處理后的藻漿于8 000 r·min-1條件下離心10 min。取上清液進(jìn)行全波長掃描(200～800 nm)并測定620、280、652 nm處的吸光度,并計算不同壓力下提取藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)率和純度,以上實驗重復(fù)3次。

1.2.2 超聲提取

取50.0 g螺旋藻粉于2.0 L燒杯中,之后加入1.0 L超純水。在超聲功率為390 W,超聲2 s后間歇2 s的條件下,分別破碎1、2、3、4、5、6 min,超聲細(xì)胞破碎于4 ℃的水浴中進(jìn)行以防止過熱。超聲結(jié)束后樣品于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清液進(jìn)行紫外全波長掃描(200～800 nm)并測定620、280、652 nm處的吸光度,計算不同的超聲時間所得藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)率和純度,以上實驗重復(fù)3次。

1.2.3 超聲耦合高壓均質(zhì)法提取藻藍(lán)蛋白

超聲破碎法提取藻藍(lán)蛋白的最佳條件為超聲功率為390 W,超聲2 s后間歇2 s,總處理時間為2 min;高壓均質(zhì)法提取藻藍(lán)蛋白的最適處理壓力為60 MPa連續(xù)處理3次。取50.0 g螺旋藻粉于2.0 L燒杯中,之后加入1.0 L超純水?dāng)嚢杈鶆蚝?于超聲破碎/高壓均質(zhì)法的最佳條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎,將破碎的溶液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清液進(jìn)行全波長掃描(200～800 nm)并測定620、280、652 nm處的吸光度,計算所得藻藍(lán)蛋白的產(chǎn)率和純度[22],以上實驗重復(fù)3次。

1.2.4 藻藍(lán)蛋白(C-PC)含量與純度測定

將所得樣品測定620、280、652 nm處的吸光度,并根據(jù)公式1～3計算藻藍(lán)蛋白的濃度、產(chǎn)率及純度[13]:

Purity=A620/A280

(1)

C(mg·mL-1)=(A620-0.474A652)/5.34

(2)

C-PC產(chǎn)率(mg·g-1)=C*V/m

(3)

式中:A620 nm,A280 nm,A652 nm分別為藻藍(lán)蛋白溶液在620,280,652 nm處的吸光度,C為藻藍(lán)蛋白體積濃度(mg·mL-1),m為螺旋藻藻粉質(zhì)量(g),V為藻藍(lán)蛋白溶液體積(mL)。

1.3 藻藍(lán)蛋白的鹽析及透析處理

處理所得的藻漿于冷凍離心機(jī)4 ℃、8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液,添加硫酸銨至10%、11%、12%、13%、14%、15%硫酸銨后,4 ℃避光保存6 h后于8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min,所得到的上清液繼續(xù)補(bǔ)加硫酸銨至50%后,在4 ℃避光保存6 h后,并在4 ℃、8 000 r·min-1下離心10 min,最后將所得沉淀采用透析袋(8 000～14 000 Da)透析12 h,用氯化鋇檢驗透析終點。

1.4 藻藍(lán)蛋白柱層析純化

采用葡聚糖凝膠柱G-75對透析脫鹽后的樣品進(jìn)一步純化。首先將葡聚糖凝膠干粉浸泡于蒸餾水中24 h,使其充分溶脹,柱形為2 cm×50 cm,柱床高30 cm。用pH 7.0的PBS緩沖液沖洗葡聚糖凝膠柱床,使填料達(dá)到陰陽離子平衡。將透析過夜后的樣品用0.1 mol·L-1的NaCl進(jìn)行梯度洗脫(洗脫速度為0.5 mL·min-1),每5 min收集1管。分別測定收集樣品在620、280、652 nm處的吸光度并計算藻藍(lán)蛋白的濃度和純度。再將所得到純度最高的組分進(jìn)行200～800 nm全波長掃描。

1.5 SDS-凝膠電泳

分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。樣品在濃縮膠中的電泳儀電壓為80 V,電泳30 min,再將電壓變?yōu)?20 V,電泳120 min。電泳結(jié)束之后,采用考馬斯亮藍(lán)染色30 min,用乙酸：乙醇：水=1：1：8的脫色液脫色,直至顏色脫凈為終點。

1.6 色澤的測定

色澤的測定采用TS7700色差計,測色光源為D65光源,光斑直徑為8 mm,均勻選取5個測量點,色差計經(jīng)黑白色板校正后,測定各個測量點的L*a*b*值并取平均值,其中:L*代表樣品的明度,其值范圍為0～100;a*代表綠紅值,其值范圍為-120～+120;b*代表樣品的藍(lán)黃值,其值范圍為-120～+120[23]。

1.7 實驗處理與數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用Origin Pro 9.0和SPSS 9.0軟件。對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,每組實驗重復(fù)3次以上確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。不同字母代表數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高壓均質(zhì)提取藻藍(lán)蛋白

高壓均質(zhì)法是一種用于細(xì)胞破碎的快速方法,主要通過用高壓的方法對細(xì)胞膜進(jìn)行破碎,最終使得細(xì)胞內(nèi)成分流出[24]。圖1A中顯示為50 g·L-1螺旋藻的藻溶液在不同壓力處理連續(xù)處理3次后獲得的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量及其純度。結(jié)果顯示C-PC的產(chǎn)率隨處理壓力的增加而顯著上升,并在60 MPa達(dá)到最大值88.15 mg·g-1,之后隨著壓力的繼續(xù)升高無顯著性差異。此外,C-PC純度(A620/A280)在隨著壓力的升高而顯著上升,20～60 MPa之后維持在0.63～0.66(<0.7),隨著壓力的進(jìn)一步提高至80 MPa,其純度降低至0.53左右,其主要原因可能是隨著處理壓力的增加,對細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞逐漸加大,導(dǎo)致細(xì)胞中C-PC溶出較多,最終使得C-PC產(chǎn)量提高[15]。在0～20 MPa,隨著壓力的提高,細(xì)胞內(nèi)藻藍(lán)蛋白的溶出顯著提高,使得C-PC純度也顯著提高至最大值,之后隨著處理壓力增加至80 MPa,細(xì)胞壁破壞程度進(jìn)一步加大,細(xì)胞內(nèi)的核酸、糖類、脂質(zhì)等物質(zhì)釋放,使C-PC純度下降。圖1B為60 MPa所獲得的螺旋藻C-PC紫外掃描圖(200～800 nm),結(jié)果顯示C-PC于620 nm處具有最大吸收峰,與先前報道藻藍(lán)蛋白的特征峰基本一致,表明60 MPa處理螺旋藻對藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)無影響。因此,綜合考慮提取能耗成本效益,選擇60 MPa作為高壓均質(zhì)法提取螺旋藻C-PC的最適壓力。

F/MPa

λ/nm圖1 不同處理壓力對C-PC產(chǎn)率純度的影響及紫外掃描圖(60 MPa)Fig.1 Effect of different treatment pressure on purity and yield of C-PC and UV scanning (60 MPa)

2.2 超聲法提取藻藍(lán)蛋白

超聲波細(xì)胞破碎通過超聲波破壞生物組織的細(xì)胞壁,促進(jìn)細(xì)胞壁內(nèi)可提取化合物的釋放,增強(qiáng)溶劑從連續(xù)相中進(jìn)入細(xì)胞,增加細(xì)胞內(nèi)化合物的釋放而增加提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的得率[25]。圖2A顯示超聲時間對藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量及純度的影響。結(jié)果表明C-PC產(chǎn)率在前2 min內(nèi)顯著上升至81.29 mg·g-1,之后在2～4 min內(nèi)產(chǎn)率無顯著性差異,隨著時間的進(jìn)一步延長至6 min后期,產(chǎn)率顯著下降至68.62 mg·g-1。由于超聲波具有的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng),可在極短的時間內(nèi),擊碎細(xì)胞壁,促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流[26],提高C-PC的溶出度因而C-PC得率增加。2～4 min條件下隨著時間增加超聲波對細(xì)胞壁的破壞沒有顯著影響,得率幾乎不變。隨著超聲時間的延長(4～6 min),體系可能產(chǎn)生過多的熱量,引起C-PC變性,導(dǎo)致得率下降。同時,隨著超聲時間的延長,細(xì)胞內(nèi)的雜質(zhì)持續(xù)浸出,C-PC純度(A620/A280)由0.6顯著下降至0.48(圖2A)。圖2B為超聲2 min所獲得的螺旋藻C-PC紫外掃描圖(200～800 nm),結(jié)果顯示C-PC于620 nm處具有最大吸收峰,與先前報道藻藍(lán)蛋白的特征峰基本一致,表明超聲2 min處理螺旋藻對藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)無影響。因此,綜合考慮提取能耗成本效益,選擇2 min作為超聲法提取藻藍(lán)蛋白的最適時間。

2.3 超聲-高壓均質(zhì)聯(lián)用法提取藻藍(lán)蛋白

圖3顯示了高壓均質(zhì)和超聲處理的最佳條件下,高壓均質(zhì)耦合超聲法提取螺旋藻藻藍(lán)蛋白效果。由圖3A可知,高壓均質(zhì)耦合超聲提取所獲得的C-PC產(chǎn)率顯著高于高壓均質(zhì)或超聲提取,但其純度顯著低于高壓均質(zhì)或超聲提取。超聲處理后高壓均質(zhì)提取C-PC產(chǎn)率達(dá)到最大值(131.2 mg·g-1),其次是高壓均質(zhì)+超聲處理(124.3 mg·g-1)、高壓均質(zhì)(86.85 mg·g-1)、超聲處理(82.96 mg·g-1),比高壓均質(zhì)和超聲提取所得產(chǎn)率分別提高了51.07%和58.15%。其主要的原因在于高壓均質(zhì)耦合超聲法對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞程度遠(yuǎn)高于單獨處理,蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、多糖等細(xì)胞內(nèi)容物大量溶出,最終導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白含量顯著提高,而其純度達(dá)到最低值(0.69)[15]。該結(jié)果表明該耦合方法提取藻藍(lán)蛋白效率遠(yuǎn)高于先前文獻(xiàn)報道,Tavanandi[15]等采用4次凍融4 h法提取的藻藍(lán)蛋白產(chǎn)率為73.73 mg·g-1;Pan-utai[26]等利用超聲法提取5 min后所得藻藍(lán)蛋白產(chǎn)量為60 mg·g-1;Ilter[27]等采用均質(zhì)法獲得的C-PC產(chǎn)率為67.61 mg·g-1;Kaferbock[28]等采用脈沖電場處理7 h所得C-PC產(chǎn)率為119.48 mg·g-1。因此,為獲得較高藻藍(lán)蛋白產(chǎn)率,后續(xù)實驗采用超聲法+高壓均質(zhì)作為C-PC的最適提取方法。

t/min

λ/nm圖2 超聲處理對C-PC產(chǎn)率純度的影響及紫外掃描圖(2 min)Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on the yield and purity of C-PC and UV scanning (2 min)

圖3B顯示了4種方法所得C-PC的紫外全波長掃描結(jié)果,結(jié)果顯示中顯示4種提取方法得到的樣品都有4個吸收峰,分別在280、400～450、620、670 nm。先前研究表明280 nm為蛋白質(zhì)特征吸收峰,400～450 nm為類胡蘿卜素的特征吸收峰,620 nm為藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰,而670 nm為葉綠素的特征吸收峰[29]。由3B可知4種方法提取的樣品在280、620 nm處都有較高的吸收峰,表明提取物中主要的物質(zhì)為藻藍(lán)蛋白;且超聲+高壓均質(zhì)提取的樣品吸收峰都高于其他3條曲線,說明該提取方法所得的C-PC得率最高,但其含有的雜質(zhì)較多,其純度低于其余3種提取方法,這與圖3A的結(jié)果是一致。

t/min

λ/nm圖3 不同處理方法對藻藍(lán)蛋白產(chǎn)率純度及紫外吸光度的影響Fig.3 Effects of treatment methods on the purity and yield of phycocyanin and UV scanning

2.4 硫酸銨鹽析及透析純化藻藍(lán)蛋白

利用硫酸銨對C-PC進(jìn)行純化的原理是鹽溶和鹽析。低濃度的硫酸銨包圍著蛋白質(zhì)分子,蛋白質(zhì)分子將被鹽化(溶解)。高濃度時,鹽離子強(qiáng)度很強(qiáng),更容易與水分子結(jié)合,鹽與水分子的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的吸引力增加,從而使蛋白質(zhì)分子發(fā)生疏水相互作用,降低溶解度因而形成沉淀[30]。由圖4可知,C-PC的純度隨著硫酸銨濃度的增加,呈先上升至后下降的趨勢。當(dāng)硫酸銨濃度為12%時,C-PC純度(A620/A280)達(dá)到最大值(1.09),之后顯著下降至0.76。此外,隨著硫酸銨濃度的增加,上清液中C-PC的回收率在硫酸銨濃度為10%～12%保持不變在90%左右,之后隨著硫酸銨濃度提高至15%,C-PC的回收率顯著下降至69.5%左右。其主要的原因可能是由于鹽溶原理,剛開始時硫酸銨能夠使雜質(zhì)(葉綠素、類胡蘿卜素等)沉淀下來,而目標(biāo)產(chǎn)物不會損失故在上清液中C-PC的回收率不變而純度增加。隨著硫酸銨濃度的增加(>12%),過多的硫酸銨能夠讓C-PC沉降下來使目標(biāo)產(chǎn)物損失,上清液中C-PC回收率下降。因此,本實驗采用12%硫酸銨作為鹽析的第一步對藻藍(lán)蛋白進(jìn)行溶解,之后添加硫酸銨濃度至50%使得C-PC完全沉淀以進(jìn)行后續(xù)的純化。

硫酸銨濃度/%圖4 硫酸銨濃度對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響Fig.4 Effect of ammonium sulfate concentration on the purity and recovery rate of phycocyanin

2.5 葡聚糖凝膠G-75純化藻藍(lán)蛋白

凝膠柱層析主要根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量不同從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。先前研究表明C-PC在結(jié)構(gòu)上由兩條多肽鏈組成,即α單位(13～20.5 kDa)和β單位(11～24.4 kDa)[30]。葡聚糖凝膠G-75的分離范圍大約在3～80 kDa,因此,本實驗選擇葡聚糖凝膠G-75對C-PC進(jìn)行純化。圖5a為C-PC在吸光度為280和620 nm時的洗脫曲線。洗脫時間25 min時,在280和620 nm處均出現(xiàn)洗脫峰,而在620 nm的吸光度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在280 nm的吸光度,其純度A620/A280達(dá)到最大值為4.20(分析級>4.0),其可能的原因是分子量比較大的雜蛋白經(jīng)過葡聚糖凝膠柱G-75柱所需要時間較短,而分子量比較小的雜蛋白所需要的時間較長,雜蛋白與C-PC被分開[29],導(dǎo)致280 nm處吸收峰下降。通過柱層析的方法可將雜蛋白和C-PC分開以提高C-PC的純度。因此,25 min作為葡聚糖凝膠G-75層析柱純化藻藍(lán)蛋白的最佳時間。

圖5b顯示藻藍(lán)蛋白經(jīng)過葡聚糖凝膠柱G-75洗脫25 min后收集的樣品紫外掃描圖,在620 nm處的吸光度出現(xiàn)了大幅度上升,而在280 nm處的吸光度出現(xiàn)了輕微的下降,其主要原因為經(jīng)過葡聚糖凝膠G-75后雜蛋白質(zhì)被進(jìn)一步去除,故280 nm處吸光度下降,300～400 nm處出現(xiàn)微弱的峰可能是蛋白質(zhì)中二硫鍵的吸收引起的。經(jīng)過葡聚糖凝膠柱G-75,C-PC純度由原來的0.85進(jìn)一步提升至4.2,達(dá)到了分析級純度。

洗脫時間/min

λ/min圖5 葡聚糖凝膠G-75洗脫曲線及過柱前后紫外掃描圖Fig.5 Elution curve of dextran gel G-75 and UV Scanning of C-PC

2.6 分析級藻藍(lán)蛋白的SDS-PAGE及色澤

超聲-高壓均質(zhì)提取所得的粗藻藍(lán)蛋白提取液經(jīng)兩步鹽析、透析及25 min柱層析后,純化的樣品進(jìn)行冷凍干燥,所得分析級藻藍(lán)蛋白產(chǎn)率為107.65 mg·g-1,純度為4.23,其回收率達(dá)到了82.05%。圖6顯示了分析級藻藍(lán)蛋白SDS-PAGE和色澤。由圖6a可知,經(jīng)過鹽析后透析的藻藍(lán)蛋白的電泳泳道的條帶比較多而且不明顯,表明所得到的樣品的雜質(zhì)較多且純度較低,而經(jīng)過葡聚糖凝膠G-75柱層析純化后的藻藍(lán)蛋白電泳條帶較少且清晰,表明雜質(zhì)通過柱層析大部分全部被去除,因而電泳條帶顯示出目標(biāo)蛋白質(zhì),純化效果理想,這與圖4和圖5a所得到的藻藍(lán)蛋白純度結(jié)果一致。此外,通過與Marker樣品對比評估,C-PC的分子量約為17 kDa,這與先前文獻(xiàn)等所報道的分子量基本一致[31]。圖6b顯示了柱層析純化后所獲得的藻藍(lán)蛋白色澤值,其亮度(L*值)為58.07,紅度(a*)為-15.44,黃度(b*)為-17.86,該結(jié)果可能與先前報道的結(jié)果有差異,其可能與藻藍(lán)蛋白的純度和濃度、藻種有關(guān)[32]。

圖6 SDS-PAGE電泳圖和藻藍(lán)蛋白色澤Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis diagram and color of C-PC

3 結(jié)論

本文通過研究螺旋藻分析級C-PC的分離純化工藝,以低成本高效生產(chǎn)分析級C-PC。首先分別優(yōu)化高壓均質(zhì)處理壓力和超聲法的超聲時間,并將二者的最佳條件聯(lián)用,比較不同處理方法下C-PC的得率和純度。結(jié)果顯示超聲-高壓均質(zhì)處理提取C-PC產(chǎn)率最高,其提取率分別比單獨使用高壓均質(zhì)和超聲處理提高了51.07%和58.15%,且高于先前報道的。優(yōu)化了硫酸銨對藻藍(lán)蛋白的鹽溶濃度(12%)及鹽析濃度為50%。超聲-高壓均質(zhì)法的藻藍(lán)蛋白粗提液經(jīng)過硫酸銨兩步沉淀、透析和25 min葡聚糖凝膠柱G-75柱層析法進(jìn)行純化后,藻藍(lán)蛋白產(chǎn)率和純度分別為107.65 mg·g-1和4.23(>4.0),其回收率達(dá)到82.05%。此外,采用SDS-PAGE對純化后C-PC進(jìn)行純度及分子量(17 kDa)進(jìn)行驗證,與先前報的結(jié)果基本一致。本文通過對傳統(tǒng)提取純化工藝上進(jìn)行改進(jìn),以高效低成本快速生產(chǎn)分析級C-PC,為螺旋藻分析級藻藍(lán)蛋白的廣泛應(yīng)用提供技術(shù)支撐。