韓 堯,李燕萍*

(南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;b.中德聯(lián)合研究院;c.食品學(xué)院,江西 南昌 330047)

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporters,ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)是在生物界廣泛存在的、能夠催化ATP水解并利用水解所產(chǎn)生的能量促使底物實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類膜整合蛋白[1]。其底物種類包括糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和金屬離子等多種生物分子,參與多種生物過程,如真菌的多藥物外排、植物激素運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞解毒、病毒防御以及抗原傳遞[2]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族具有保守結(jié)構(gòu),典型結(jié)構(gòu)是由2個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotidebinding domain,NBD)和2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TMD)組成,其中NBD結(jié)構(gòu)域相對保守,行使ATP水解酶功能,為跨膜運(yùn)輸提供能量,而TMD是跨膜通道,其結(jié)構(gòu)及序列具有底物的特異性[3]。底物從細(xì)胞膜外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程如圖1所示,具體如下:內(nèi)向性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,先形成外周蛋白和底物的復(fù)合體(Substrate binding protein,SBP),而后與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用,把底物傳遞給它的TMD部分。

圖1 內(nèi)向 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理模型圖[5] SBP (Substrate binding protein):底物結(jié)合蛋白;RD (Regulatory domain):調(diào)節(jié)區(qū)域;粉色空心小球代表底物Fig.1 Model of Substrate Binding Protein transport mechanism[5] SBP (Substrate Binding Protein); RD (Regulatory domain):Regulatory area.The pink hollow spheres represent the substrate

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的2個(gè)TMD間存在一個(gè)親水性通道孔隙,在轉(zhuǎn)運(yùn)底物前,靠近膜外的通道口處于開放狀態(tài),靠近膜內(nèi)的通道口處于關(guān)閉狀態(tài);在進(jìn)行底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí),膜外結(jié)合蛋白結(jié)合底物后并將其傳送給TMD,同時(shí)把信號(hào)傳遞到NBD,NBD在水解ATP后,其構(gòu)象發(fā)生變化并將信號(hào)傳遞到TMD,TMD的構(gòu)象亦發(fā)生變化;底物被送到通道孔隙中后,朝向外周質(zhì)的通道口隨即關(guān)閉,朝向胞質(zhì)的通道口隨即開放,底物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而底物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外時(shí),除ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的內(nèi)外通道口開放順序相反外,其他轉(zhuǎn)運(yùn)過程都基本一致[4]。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最初作為營養(yǎng)物質(zhì)內(nèi)運(yùn)蛋白在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn),隨后因參與癌細(xì)胞的多藥耐藥性(Multidrug resistance,MDR)引起人們關(guān)注。真菌中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類較多,功能各異。白色假絲酵母耐藥性蛋白CDR1(Candida drug resistance)是第一個(gè)被報(bào)道的致病中的多向耐藥性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6]。CDR1的底物包括了結(jié)構(gòu)上無關(guān)的唑類、脂類和類固醇,敲除白色假絲酵母中的CDR1基因?qū)е缕鋵λ袡z測的唑類和其他代謝抑制劑高度敏感性,而HEX 1啟動(dòng)子通過對CDR1基因增強(qiáng)性的過表達(dá)導(dǎo)致白色假絲酵母耐藥性的增加[7]。產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因ABC40主要參與苯乙酸的外排,提高菌株苯乙酸及其他弱酸的耐受力[8];指狀青霉(Penicilliumdigitatum)中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因主要參與細(xì)胞中藥物外排[9];BcatrB編碼的灰霉菌(Botrytiscinerea)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要負(fù)責(zé)親脂類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)[10];在酵母體系表達(dá)煙曲霉PDR 5類ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究表明,ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失導(dǎo)致煙曲霉[11]底物特異性和能量依賴性外排方面產(chǎn)生巨大的差異;紅曲霉中囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ypt7基因[12]缺失引起了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)的變化。這說明不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相互聯(lián)系,相互影響。對于同一底物的運(yùn)輸,可能有不同運(yùn)輸途徑可供選擇。

紅曲霉在我國生產(chǎn)使用已經(jīng)有1000多年的歷史,且紅曲霉是目前世界上唯一被批準(zhǔn)可用于生產(chǎn)食用色素的微生物[13]。因此,在食品發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域紅曲霉具有重要的研究價(jià)值。紅曲霉能夠產(chǎn)生醇、酸、酯等多種芳香物質(zhì)(初級代謝產(chǎn)物)和多種水解酶類如淀粉分解酶、蛋白質(zhì)分解酶、半乳糖分解酶、核糖核酸分解酶等,使食品在發(fā)酵過程中產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)香氣和甘甜味道;而它的次級代謝產(chǎn)物如色素、抗菌素、膽固醇抑制劑、中藥成分等更是近年來人們研究的熱點(diǎn)[14]。越來越多的研究表明,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為最大的初級主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,主要參與真菌氨基酸、糖類、維生素等物質(zhì)的運(yùn)輸,但是對于紅曲霉內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至今少有研究和明確的分類。本研究提取橙色紅曲霉AS3.4384基因組DNA,經(jīng)質(zhì)量驗(yàn)證合格后進(jìn)行二代建庫測序(北京諾禾致源科技股份有限公司),并對測序得到的序列進(jìn)行組裝及注釋。鑒定和分析了紅曲霉AS3.4384中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族成員數(shù)目;在本研究中,我們鑒定出33條紅曲霉ABCs基因序列,分為7大亞類。從外顯子-內(nèi)含子組織、基序組成、序列片段分布、系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析等方面進(jìn)行了綜合分析。構(gòu)建了紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹,探討了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系。該研究結(jié)果為紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能的研究提供了基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的鑒定

利用黑曲霉、煙曲霉和酵母3種相似真菌ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族成員蛋白序列作為查詢序列,通過本地BLAST比對程序搜索,以e值≤1e-5為搜索條件,從紅曲霉蛋白序列集中鑒定ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列。將鑒定獲得ABC蛋白序列提交CDD數(shù)庫,(https//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bw-rpsb/bwrpsb.cgi),Pfam)[15]。進(jìn)一步驗(yàn)證ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的NBD和TMD保守結(jié)構(gòu)域,不存在ABC蛋白保守結(jié)構(gòu)域或者分子量不在50～300 kDa范圍之內(nèi)的蛋白序列被去除,最后所有非冗余高置信度序列均命名為紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MsABC)。

1.2 紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列分析和結(jié)構(gòu)表征

所有高置信度的MsABC蛋白序列提交到Ex-PASy(http://web.expasy.org/protpara-m/)以計(jì)算氨基酸數(shù)量、分子量和理論等電點(diǎn)(PI)。MEME程序(版本4.11.2,http://alte-rnate.meme-suite.org/tools/meme)用于識(shí)別MsABCs序列中的保守基序,參數(shù)如下:任意重復(fù)次數(shù),最多10個(gè)錯(cuò)配,最佳基序?qū)挾葹?～100個(gè)氨基酸殘基。在基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器(GSDS,http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)上對MsABCs基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定[16]。

1.3 紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

利用來自黑曲霉、煙曲霉和酵母的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的全長序列(附加文件1)和新鑒定的MsABCs進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。所有獲得的序列首先由ClustatX[17](版本1.83)軟件用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對,然后使用MEGA 6[18]軟件構(gòu)建了一個(gè)無根鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹,并進(jìn)行了1 000次的自舉檢驗(yàn)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和上述3個(gè)物種的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分類,將紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為不同的亞類。

1.4 紅曲霉ABC基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

紅曲霉的生長發(fā)育受到光照、營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、PH和水分等脅迫作用的嚴(yán)重影響,導(dǎo)致紅曲色素等代謝產(chǎn)物降低,品質(zhì)下降。紅曲霉受到逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng),以降低或消除逆境脅迫給生長帶來的危害。紅曲霉的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)途徑及多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程。首先是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)相應(yīng)基因的表達(dá),轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是由啟動(dòng)子和與之相互作用的轉(zhuǎn)錄因子共同完成的。因此將MsABCs編碼序列的上游啟動(dòng)子序列(1.5 kb)提交到PlantCare[19](https://bioinformatics.psb.ugent.be/WebTools/plantcare/html/)以鑒定參與脫落酸響應(yīng)元件(ABA-Responsive Element,ABA)、參與抗氧化的響應(yīng)元件(Antioxidant Response Element,ARE)、參與脫水、低溫和鹽脅迫的脫水響應(yīng)元件(Dehydration Responsive Element,DRE)、參與生長素的響應(yīng)元件(IAA-Responsive Element,IAA)、參與低溫響應(yīng)元件(Low temperature Response Element,LTRE)、參與茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(Methyl Jasmonate,MeJA)等6個(gè)響應(yīng)元件。

1.5 紅曲霉ABC基因的序列分布及同源性分析

將MsABCs編碼基因所在的基因全片段序列導(dǎo)入Mauve軟件[20],添加需要比對的基因序列,選擇全基因組序列比對,設(shè)置默認(rèn)參數(shù),比對完成后獲得基因組位點(diǎn)間的線性關(guān)系。將分析獲得相關(guān)性基因序列使用TBtools軟件[21]繪制基因內(nèi)共線性圖譜。

2 結(jié)果

2.1 紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的鑒定與分析

通過本地BLASTP比對獲得36條序列,通過關(guān)鍵詞搜索在NCBI數(shù)據(jù)庫獲得5條序列。(紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究較少,大多數(shù)未進(jìn)行標(biāo)注。)去除重復(fù)序列后,保留39條序列,提交給CDD(C-onserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)來確認(rèn)ACD(Actin CrossLinking Domain)結(jié)構(gòu)域。排除沒有典型ACD和分子量在50～300 kDa范圍之外的序列。最終確定33條紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列,并根據(jù)其亞類進(jìn)行命名,表1列出了MsABCs蛋白的序列名稱、序列ID、序列位置、開放閱讀框長度、外顯子數(shù)量、氨基酸數(shù)量、分子量和等電點(diǎn)。MsABCs蛋白的長度從617個(gè)氨基酸(MsABC-31)到2600個(gè)氨基酸(MsABC-32)不等。MsABCs蛋白的分子量介于69.2 kDa(MsABC-31)～291.6 kDa(MsABC-32)之間。MsABCs基因分布在22條紅曲霉序列片段上。MsABCs蛋白的預(yù)測等電點(diǎn)為5.30(MsABC-11)～9.23(MsABC-12)。

表1 紅曲霉 ABCs 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)信息Tab.1 Structure of Monascus ABCs transporter

2.2 紅曲霉ABC基因結(jié)構(gòu)

通過基因組DNA與MsABCs全長cDNA的比對,確定內(nèi)含子/外顯子的結(jié)構(gòu)和相位。圖2顯示在MsABCs基因中,絕大多數(shù)MsABCs基因都含有內(nèi)含子,只有MsABC-21不含內(nèi)含子,大部分MsABCs基因含有2～7個(gè)內(nèi)含子,只有4個(gè)基因含有10個(gè)以上內(nèi)含子,即MsABC-3含有12個(gè)內(nèi)含子、MsABC-5含有12個(gè)內(nèi)含子、MsABC-8含有10個(gè)內(nèi)含子、MsABC-32含有16個(gè)內(nèi)含子。推斷不含內(nèi)含子為串聯(lián)復(fù)制的基因,含有較多內(nèi)含子的為片段復(fù)制的基因,紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多為分段復(fù)制基因。不過有趣的是,多條片段復(fù)制基因之間存在高度的保守區(qū)域,例如雖然MsABC-32序列比MsABC-3序列長,但是保守區(qū)具有相同的內(nèi)含子相位,這一結(jié)果提示這兩個(gè)片段重復(fù)基因之間存在著特殊的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

通過motif序列分析工具(Multiple EM for Motif Elicitation,MEME)對MsABCs的保守基序進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了5個(gè)保守的motifs基序。這些保守基序的長度從21到50個(gè)氨基酸不等。表2列出了5個(gè)motifs序列的詳細(xì)信息。根據(jù)CDD數(shù)據(jù)庫比對分析,motif 3完全對應(yīng)于保守的ACD區(qū)域。Motif 1、motif 2和motif 4的全序列一起形成了高度保守的完整ACD結(jié)構(gòu)域。大多數(shù)MsABCs序列(60.6%)含有motif 1、motif 3和motif 4組合,推測它們功能與跨膜區(qū)域相關(guān)。MsABC-15、MsABC-16、和MsABC-31缺乏相應(yīng)的基序組合,未能與其余類型的MsABCs序列共聚類。ACD結(jié)構(gòu)域的不同組成表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能多樣性。系統(tǒng)發(fā)育樹中的同一組MsABCs具有共同的基序,表明它們具有高度保守性。聚在同一亞家族的motif保守基序組成相似,說明成員之間進(jìn)化關(guān)系較近。不同的亞家族之間motif保守基序存在差異,motif出現(xiàn)頻率越高說明序列保守程度越高。

圖2 MsABCs基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(A)、基因結(jié)構(gòu)(B)和保守基序分析(C)。MsABCs基因的上游/下游區(qū)域用藍(lán)色方框表示。外顯子的長度可以通過底部的刻度來推斷;MsABCs基因保守基序的分布,不同顏色的方框中顯示了5個(gè)不同的motifs區(qū)域。有關(guān)圖案的詳細(xì)信息,請參閱表2。

表2 紅曲霉 ABCs 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白保守基序片段Tab.2 Conserved motif fragments of Monascus ABCs transporter

2.3 紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析黑曲霉、煙曲霉、酵母和紅曲霉中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的進(jìn)化關(guān)系,利用黑曲霉、煙曲霉、酵母和紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列,采用鄰位連接法(Neighbor joing,NJ)構(gòu)建無根環(huán)狀系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。在系統(tǒng)發(fā)育樹中,共有來自黑曲霉的20條序列、煙曲霉的25條序列、酵母菌的43條序列和紅曲霉的33條序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析。121條ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白按照轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和功能的不同分為ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF和ABCG 7種亞類。根據(jù)鄰位連接法(Neighbor joing,NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹得出,33條紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列很好地聚類到7種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞類中。值得注意的是,MsABC亞家族除了與相同物種間成員聚類外,存在MsABC成員與來自不同物種的同一亞科的成員的親緣關(guān)系比與來自同一物種的其他ABC成員的親緣關(guān)系更密切,這意味著同一ABC亞家族除了在相同物種間具有較高的同源性外在不同物種之間同樣存在較高的同源性,顯示出ABC蛋白序列在進(jìn)化過程中具有較高的保守性。

2.4 紅曲霉ABC基因啟動(dòng)子序列中與脅迫相關(guān)的順式調(diào)控元件

為了進(jìn)一步研究MsABCs基因在非生物脅迫反應(yīng)中的潛在調(diào)控機(jī)制,將MsABCs基因翻譯起始位點(diǎn)上游1.5 kb序列提交到PlantCare以檢測順式作用元件。圖4顯示了6個(gè)非生物脅迫響應(yīng)元件:脫落酸(ABA)響應(yīng)元件、抗氧化(ARE)的響應(yīng)元件、脫水(DRE)響應(yīng)元件、應(yīng)激生長(IAA)的響應(yīng)元件、低溫(LTRE)響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯(MeJA)相關(guān)的6個(gè)響應(yīng)元件。每條MsABC基因啟動(dòng)子序列至少含有5個(gè)脅迫應(yīng)答順式元件,說明MsABCs基因的轉(zhuǎn)錄與這些非生物脅迫有關(guān)。33條MsABCs基因啟動(dòng)子序列有28條含有LTRE響應(yīng)元件,這表明紅曲菌在高溫條件下可能存在熱應(yīng)激反應(yīng)。另外幾乎所有的MsABCs基因啟動(dòng)子序列含有ABA、ARE、LTRE、MeJA相關(guān)響應(yīng)元件?？傊樖皆治霰砻鱉sABCs基因可以響應(yīng)多種環(huán)境的非生物脅迫。

2.5 紅曲霉ABC基因序列分布及同源性分析

為進(jìn)一步研究MsABCs基因在片段上分布和基因之間的相互聯(lián)系,我們使用Mauve軟件進(jìn)行物種內(nèi)基因共線性分析,該軟件能夠快速有效分析基因組之間有無大片段序列重排現(xiàn)象,是否存在共線性相關(guān),是否存在LCBs(Locally Collinear Bloc-ks)局部共線區(qū)?如相關(guān)性較強(qiáng),則說明基因組進(jìn)化上可能經(jīng)歷著相似途徑,若差異較大則說明在長期的選擇壓力下,通過在LCBs區(qū)域擴(kuò)充新的基因來獲得更好的生存空間,分期較早。Mauve軟件包括MauveAligner和ProgressveMauve兩個(gè)算法:

圖3 黑曲霉、煙曲霉、酵母和紅曲霉 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的環(huán)狀系統(tǒng)發(fā)育樹(MsABC標(biāo)注紅曲霉、AnABC標(biāo)注黑曲霉、AfABC標(biāo)注煙曲霉、SpABC標(biāo)注酵母)

圖4 預(yù)測了MsABC啟動(dòng)子中的順式元件。使用PlantCare分析了33條MsABCs的啟動(dòng)子序列(-1500 bp)。可以根據(jù)底部的比例尺推斷到翻譯起始點(diǎn)的上游長度。

MaueAligner可以有效地識(shí)別多重基因組中的保守基因組區(qū)域,重新排列區(qū)域,保守區(qū)域中的插入序列和精確的斷點(diǎn)等。此外還可以識(shí)別核苷酸替換,小片段的插入和缺失。但是MauveAligner算法只能識(shí)別在所有比對基因組中都存在的保守序列,存在于部分物種中的保守序列不能被識(shí)別,所以適合比對近源物種。ProgressiveMauve算法可以檢測到只在部分基因組中存在的同源序列,可以比對分化距離較遠(yuǎn)的序列,多適用于物種間共線性分析。本課題研究紅曲霉內(nèi)同源性且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因具有較高的保守性,因此采用MauveAligner算法進(jìn)行物種內(nèi)共線性分析。

圖5顯示,MsABCs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因分布在22條紅曲霉序列Scaffolds片段上,Scaffold 20含有Ms-ABCs基因片段最多(4條),大部分Scaffolds含有1～2條MsABCs序列,Scaffolds序列長度與所含有MsABCs基因數(shù)目無正相關(guān)。根據(jù)Holub[22]的描述,包含兩個(gè)或多個(gè)基因的200 kb以內(nèi)的染色體區(qū)域被定義為串聯(lián)重復(fù)基因,比對分析發(fā)現(xiàn)紅曲霉連鎖群含有12組串聯(lián)重復(fù)基因。這些結(jié)果表明,部分MsABCs基因可能是由基因串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生的。

圖5 MsABCs基因的分布和序列片段間關(guān)系示意圖?；疑€條表示紅曲霉基因組中所有的同步性區(qū)塊,有色線條表示相關(guān)的MsABCs基因?qū)?/p>

3 討論

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族存在于從微生物到人類近3000多種生物體內(nèi),是生物界廣泛存在的一類利用ATP水解提供能量促使底物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜整合蛋白,包括內(nèi)運(yùn)蛋白(Importers)和外排蛋白(Exporters)。最近的臨床醫(yī)學(xué)研究表明,隨著致病真菌深度感染的增加和抗真菌藥物的大量使用,越來越多的抗真菌藥物治療效果明顯下降,根本原因在于真菌產(chǎn)生了多藥耐藥性,而編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過度表達(dá)是致病真菌獲得多藥耐藥性的主要原因之一[23]。越來越多致病真菌的ABC基因家族陸續(xù)被鑒定出來,如煙曲霉和白色念珠菌(Candidaalbicans)。但是,人們對紅曲霉ABC基因家族卻知之甚少。

本研究共鑒定出33條MsABCs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,并對其結(jié)構(gòu)、序列定位、系統(tǒng)發(fā)育、基因重復(fù)、脅迫相關(guān)順式元件以及基因組內(nèi)共線性進(jìn)行了分析。這項(xiàng)研究對MsABCs基因家族的研究提供了全面的信息,將有助于理解紅曲霉中MsABCs基因的功能差異。

基因的結(jié)構(gòu)在多基因家族的進(jìn)化中起著至關(guān)重要的作用[24]。在本研究中,含有1～3內(nèi)含子MsABCs基因的比例(30.30%)與煙曲霉(35.71%)和黑曲霉(30.95%)相似。這種內(nèi)含子數(shù)量和基序排列之間的相關(guān)性進(jìn)一步證實(shí)了MsABCs基因的分類。在一些研究中,內(nèi)含子很少或沒有內(nèi)含子的基因在物種中的表達(dá)水平被認(rèn)為是增強(qiáng)的。為了及時(shí)應(yīng)對各種環(huán)境壓力,基因必須被迅速激活,內(nèi)含子較少的緊湊基因有助于快速應(yīng)對,這也是基因長期進(jìn)化的一種內(nèi)在表現(xiàn)。

本研究系統(tǒng)分析了紅曲霉33條ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng),結(jié)果表明,內(nèi)含子較少的MsABCs基因含有較多的非生物響應(yīng)元件。基于系統(tǒng)發(fā)育樹分析將33個(gè)蛋白聚為7個(gè)亞家族,通過分析紅曲霉和其他菌屬ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系,發(fā)現(xiàn)與黑曲霉、煙曲霉等ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的聚類結(jié)果基本一致,不同菌屬的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相同亞類聚集在一個(gè)分支。說明紅曲霉與其他菌屬的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高的同源性,這為紅曲霉ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能分析提供了參考依據(jù)。

先前的研究在煙曲霉[25]、黑曲霉[26]、白色假絲酵母[27]、釀酒酵母菌[28](Saccharomycescerevisiae)和新型隱球酵母[29]中分別鑒定出49,34,27,30和54個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。新型隱球酵母ABC基因數(shù)量較多與其染色體數(shù)目較多、基因組較大有關(guān)。在紅曲霉中發(fā)現(xiàn)了33條MsABCs基因,與同曲霉屬的黑曲霉中的ABC基因數(shù)量相近。在早期的研究中,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被分為8個(gè)亞家族,按照科學(xué)命名從ABCA-ABCH,行使的功能各不相同。ABCA在細(xì)胞體內(nèi)主要介導(dǎo)脂質(zhì)的運(yùn)輸[30];ABCB主要介導(dǎo)生長代謝產(chǎn)物以及外源物的運(yùn)輸有關(guān)[31];ABCC與細(xì)胞膜離子通道的調(diào)節(jié)過程相關(guān)[32];ABCD與脂肪酸的過氧化轉(zhuǎn)入相關(guān)[33];ABCE和ABCF兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大多數(shù)的生物內(nèi)都具有較高的同源性,說明它們可能具有執(zhí)行基礎(chǔ)的運(yùn)輸功能;ABCG在真菌的多種抗藥性基因起耐受作用[11];ABCH與有關(guān)抗藥性的原核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高的同源性[34]。我們的研究中,系統(tǒng)發(fā)育樹顯示MsABCs基因被分成7種不同的亞家族。紅曲霉ABC基因族中不存在ABCH亞家族,這可能是進(jìn)化過程中基因丟失的結(jié)果。

在這些亞家族中,ABCC和ABCG是最大的亞家族,8個(gè)MsABCs基因?qū)儆谶@兩類亞家族,在黑曲霉和煙曲霉中這兩個(gè)亞家族也都有較高的表達(dá)。另根據(jù)進(jìn)化樹可以看出,不同物種的同一亞科的ABC序列比同一物種的ABC序列更相似,但屬于不同的亞科。結(jié)果表明黑曲霉、煙曲霉、釀酒酵母和紅曲霉中的ABC蛋白可能存在同源性,MsABCs成員與來自不同物種的同一亞科的成員的親緣關(guān)系比與來自同一物種的其他ABC成員的親緣關(guān)系更密切,這意味著同一ABC亞家族在不同物種之間具有較高的同源性,在不同物種之間ABC亞家族具有較高的保守性。

4 結(jié)論

本研究對紅曲霉ABC家族進(jìn)行了全基因組分析,確定了33條MsABCs序列。隨后基于生物信息學(xué)方法,對MsABC序列在基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、序列片段定位、基因復(fù)制、逆境相關(guān)順式元件、基因組內(nèi)共線性關(guān)系以及非生物逆境等方面進(jìn)行了分析。多數(shù)MsABCs基因?qū)Νh(huán)境脅迫作用敏感,說明MsABCs基因在紅曲霉應(yīng)對環(huán)境壓力時(shí)起重要作用。本研究提供了有關(guān)紅曲霉MsABCs基因家族的全面信息,并將有助于確定MsABCs基因的功能。