王秋雨，李新霞，蘭怡，毛新民，馬紅梅（. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 800；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 800；. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 800；4. 新疆地區(qū)高發(fā)疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 800；5. 新疆維吾爾自治區(qū)中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)學(xué)科，烏魯木齊 800）

氣道炎癥是許多慢性呼吸道疾病的特征，包括常見的肺部疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）[1]等?？諝馕廴竞推渌h(huán)境吸入性危害物的增加是導(dǎo)致慢性肺部炎癥和呼吸道疾病發(fā)展的重要原因[2]。氣道上皮細(xì)胞作為呼吸系統(tǒng)與外界接觸的第一道天然屏障，通過釋放炎癥介質(zhì)參與肺部慢性炎癥和呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。目前臨床上采用吸入皮質(zhì)類固醇藥物的聯(lián)合用藥進(jìn)行治療，但患者對藥物效應(yīng)產(chǎn)生的個(gè)體間差異很大，仍然迫切需要改進(jìn)慢性呼吸道疾病的抗感染治療方法[4]。近年對于天然藥物抗炎作用的深入研究，探索具有抗炎活性的天然產(chǎn)物來改善或治愈炎癥已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一，有必要進(jìn)一步研究調(diào)控氣道炎癥的分子機(jī)制，并尋找、開發(fā)有效的治療和預(yù)防慢性氣道炎癥的潛在抗炎天然藥物。

大蒜（Garlic）是百合科蔥屬植物大蒜（Allium SativumL.）的地下鱗莖，有天然抗生素之稱，是藥食同源的植物[5]。大量現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大蒜具有抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、降血壓、抗菌等多種藥理作用，這多歸因于其中的有機(jī)硫化合物等活性成分[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大蒜中主要的物質(zhì)有硫化合物和多聚果糖，其中特征性含硫化合物為蒜氨酸（alliin）[S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（S-allyl-L-cysteinesulfoxide）][7-8]。蒜氨酸性質(zhì)穩(wěn)定，目前關(guān)于蒜氨酸的藥效研究也顯示其具有天然抗氧化特性[9]和抗炎特性[10]。大量研究證明了炎癥與慢性氣道炎癥之間的密切關(guān)系，但關(guān)于蒜氨酸對肺部慢性氣道炎癥方面的作用和機(jī)制尚未闡明，為明確大蒜含硫化合物蒜氨酸的抗炎機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對接技術(shù)與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對蒜氨酸的抗炎機(jī)制進(jìn)行初步探索與驗(yàn)證，以期為大蒜含硫化合物蒜氨酸在肺部慢性氣道炎癥的臨床抗炎藥物開發(fā)和研究中提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人支氣管上皮細(xì)胞株（16HBE），購于武漢細(xì)胞庫，已經(jīng)過支原體PCR檢測。

1.2 試藥

蒜氨酸（純度：98%，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司）；雪蓮過濾嘴香煙（新疆卷煙廠）；MEM培養(yǎng)基（美國 Gibco公司）；硫氫化鈉水合物（NaSH）、脂多糖（LPS）（美國Sigma公司）；IL-6檢測試劑盒（YX-091206H，上海優(yōu)選生物科技有限公司）；TNF-α檢測試劑盒（JL10208，上海江萊生物科技有限公司）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（CA1410，Solarbio生物科技有限公司）；TGF-β1（bs-0086R）抗體、IL-6（bs-0782R）抗體、山羊抗鼠二抗（bs-40296G-HRP）、山羊抗兔二抗（bs-40295G-HRP）（北京Bioss生物技術(shù)有限公司）；PPARα（66826-1-Ig）、內(nèi)參β-Actin Rabbit（20536-1-AP）（Proteintech中國公司）。

1.3 儀器

MultiskanGo酶標(biāo)儀、PowerPac HC電泳儀、BIO-RAD蛋白顯色儀（含ChemiDOC MP全自動(dòng)成像系統(tǒng)）（美國Bio-Rad公司）；SW-CJ-2F超凈工作臺（美國Airtech公司）；371型直熱式CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）；5424R低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；IX73熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；FACSAriaⅡCell Sorter流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.1.1 蒜氨酸-慢性氣道炎癥靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫以“釣靶”方式進(jìn)行蒜氨酸靶點(diǎn)獲取，通過TCMSP、GeneCards等數(shù)據(jù)庫收集蒜氨酸靶點(diǎn)，得到313個(gè)靶點(diǎn)。通過DisGeNET、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫檢索疾病“Chronic airway inflammation”，獲取靶點(diǎn)1926個(gè)。整理得到蒜氨酸-慢性氣道炎癥共同靶點(diǎn)110個(gè)，將其導(dǎo)入String平臺，設(shè)置“Organism”選項(xiàng)選擇“Homo Sapiens”進(jìn)行分析，利用Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，?0個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)有SRC、EGFR、MMP9、AKT1、PPARα、MAPK1、STAT1和CASP3等，對蒜氨酸-慢性氣道炎癥共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。利用Cytoscape 3.9.1軟件繪制“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖1。

圖1 “蒜氨酸-靶點(diǎn)-通路-慢性氣道炎癥”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of “alliin-target-pathway-chronic airway inflammation”

2.1.2 “蒜氨酸-靶點(diǎn)”分子對接 將蒜氨酸與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的關(guān)鍵靶點(diǎn)MMP9、AKT1、STAT、PPARα進(jìn)行分子對接。利用PubChem數(shù)據(jù)庫獲得蒜氨酸“3D.mol2”結(jié)構(gòu)，通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫下載核心靶蛋白3D結(jié)構(gòu)。通過AutoDock Vina程序進(jìn)行蒜氨酸-關(guān)鍵蛋白分子對接，分析蒜氨酸與靶點(diǎn)的結(jié)合活性，結(jié)果見表1。藥物分子與蛋白的結(jié)合自由能（Affinity）越小，預(yù)測兩者結(jié)合越緊密牢固[11]，4個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與蒜氨酸對接結(jié)合分?jǐn)?shù)小于－20.92 kJ·mol－1，說明與蒜氨酸有較好的結(jié)合活性。使用PyMol軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖2。

圖2 蒜氨酸與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接結(jié)果Fig 2 Alliin docking with key targets

表1 蒜氨酸與相關(guān)靶點(diǎn)對接結(jié)果Tab 1 Alliin docking with relevant targets

2.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 液氮凍存的16HBE細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇后，在超凈工作臺將細(xì)胞接種于25 cm2無菌培養(yǎng)瓶中，使用10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS），含1%青霉素-鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%后進(jìn)行傳代[12]，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 香煙煙霧（CSE）的制備[13]在兩個(gè)串聯(lián)的大包氏管內(nèi)各加入5 mL不含血清的空白MEM培養(yǎng)基，在串聯(lián)管的一端連接去掉濾嘴的香煙，另一端連接50 mL的注射器。點(diǎn)燃香煙后，模擬標(biāo)準(zhǔn)化人體吸煙模式，使用注射器以50 mL/10 s的速度抽吸，使煙霧溶于培養(yǎng)基，形成氣溶膠。每次1支香煙，每支香煙用注射器抽吸10次，收集培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.4，使用0.22 μm濾器過濾除菌，即得到100%的CSE原液，封裝后于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行快速解凍，30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，用10%FBS-MEM培養(yǎng)基將CSE原液分別稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

2.2.3 MTT檢測細(xì)胞活力

① 蒜氨酸對16HBE細(xì)胞的毒性檢測：將16HBE細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板上，設(shè)置空白組，正常對照組，蒜氨酸藥物組（100、200、400、600、800、1000 μmol·L－1），于培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄去細(xì)胞上清液。每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶液，震蕩至結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度（A）值，篩選最適給藥濃度。結(jié)果見圖3，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用濃度為100、200、400、600、800、1000 μmol·L－1蒜氨酸干預(yù)細(xì)胞后，各組細(xì)胞存活率之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了200、400、800 μmol·L－1蒜氨酸作為低、中、高給藥濃度。

圖3 不同濃度蒜氨酸對細(xì)胞毒性作用Fig 3 Toxic effect of different concentrations of alliin on cells

② 體外16HBE細(xì)胞炎癥模型建立：以16HBE細(xì)胞為載體，利用CSE與LPS模擬體外模型[14]，設(shè)置空白組（不加細(xì)胞的溶劑組），正常對照組（Control組），不同濃度CSE組（1%、5%、10%、15%、20%），不同質(zhì)量濃度LPS組（25、50、100、150、200、400 μg·mL－1），CSE＋LPS組（5%＋25 μg·mL－1、5%＋50 μg·mL－1、5%＋100 μg·mL－1）干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果見圖4。采用5%CSE＋50 μg·mL－1LPS干預(yù)時(shí)，細(xì)胞存活率相比正常對照組有顯著下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了5%CSE＋50 μg·mL－1LPS作為造模干預(yù)條件。

圖4 不同造模方法對細(xì)胞毒性作用Fig 4 Cytotoxic effect of different modelings

③ 陽性藥物對細(xì)胞毒性檢測：參考文獻(xiàn)[15]，采用不同濃度NaSH干預(yù)16HBE細(xì)胞，結(jié)果見圖5。與正常對照組相比，當(dāng)NaSH濃度為500 μmol·L－1時(shí)，細(xì)胞存活率出現(xiàn)了明顯下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)采用100 μmol·L－1濃度NaSH作為給藥濃度。

圖5 NaSH對細(xì)胞的毒性作用Fig 5 Cytotoxic effect of NaSH on cells

2.2.4 細(xì)胞分組及形態(tài)觀察 設(shè)置分組正常對照組（Control組）、模型組（5%CSE＋50 μg·mL－1LPS）、陽性藥組（NaSH 100 μmol·L－1）、蒜氨酸低濃度組（200 μmol·L－1）、蒜氨酸中濃度組（400 μmol·L－1）、蒜氨酸高濃度組（800 μmol·L－1）。觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見圖6，正常對照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好、形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則狀，細(xì)胞間連接緊密，邊界清晰；模型組中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞兩端觸角增長，細(xì)胞密度下降，部分細(xì)胞邊緣模糊，給予不同濃度蒜氨酸后，能改善細(xì)胞形態(tài)，并逐步趨于正常細(xì)胞。

圖6 蒜氨酸對香煙煙霧加LPS刺激下的細(xì)胞正常形態(tài)及活性的影響（×400）Fig 6 Effect of alliin on the normal shape and activity of cells stimulated by cigarette smoke and LPS（×400）

2.2.5 蒜氨酸對炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)的影響細(xì)胞分組同“2.2.4”項(xiàng)下方法，藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞上清液，ELISA試劑盒檢測IL-6、TNF-α的水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，結(jié)果見表2。與正常對照組相比，加入CSE和LPS干預(yù)的細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α表達(dá)明顯增加。加入不同濃度蒜氨酸進(jìn)行治療后，蒜氨酸可以有效減少細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的表達(dá)。

表2 細(xì)胞上清液中炎癥因子表達(dá)水平( ±s，n＝3)Tab 2 Inflammatory factor expression in the cell supernatants ( ±s，n＝3)

表2 細(xì)胞上清液中炎癥因子表達(dá)水平( ±s，n＝3)Tab 2 Inflammatory factor expression in the cell supernatants ( ±s，n＝3)

注：與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。Note：Compared with the normal control group，##P＜0.01；compared with the model group，**P＜0.01.

分組IL-6/（pg·mL－1）TNF-α/（pg·mL－1）正常對照組 7.6768±0.22492 5.2376±0.6271模型組（5%CSE＋LPS 50 μg·mL－1）10.3961±0.36977##14.8838±0.58575##陽性藥組（NaSH 100 μmol·L－1） 9.7748±0.08728**12.8925±0.70398**蒜氨酸低濃度組（200 μmol·L－1） 9.3794±0.13332** 9.7633±0.86394**蒜氨酸中濃度組（400 μmol·L－1） 9.0308±0.14365** 8.4961±0.70398**蒜氨酸高濃度組（800 μmol·L－1） 8.5241±0.1575** 7.1254±0.58575**

2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá) 使用無血清的MEM培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA探針，使?jié)舛葹?0 μmol·L－1，細(xì)胞前處理及分組同“2.2.4”項(xiàng)下方法，藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞裝載探針，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，用無血清MEM培養(yǎng)基清洗3遍，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測（參數(shù)設(shè)置為488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)弱），使用FlowJo v10.8.1進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果見圖7，與正常組相比，5%CSE＋50 μg·mL－1LPS造模組出峰明顯右移、顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)，加入不同濃度蒜氨酸后，觀察發(fā)現(xiàn)蒜氨酸可以有效抑制16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測蒜氨酸抑制細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)Fig 7 Inhibition of alliin on the intracellular ROS expression by flow cytometry

2.2.7 Western blot法檢測各組相關(guān)炎癥蛋白的表達(dá) 細(xì)胞前期培養(yǎng)及分組處理同“2.2.4”項(xiàng)下方法，藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液（RIPA∶PMSF＝100∶1），置于冰上裂解30 min，將裂解后的細(xì)胞懸液離心處理，收集上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總蛋白含量測定，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用SDS-PAGE快速凝膠試劑盒，進(jìn)行蛋白凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育過夜，次日二抗孵育50 min，使用ECL法顯色，軟件Image Lab進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8，與正常對照組相比，模型組中IL-6和TGF-β1蛋白表達(dá)均顯著增加、PPARα的表達(dá)顯著降低。與模型組相比，加入不同濃度蒜氨酸干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，蒜氨酸可以顯著下調(diào)IL-6和TGF-β1蛋白表達(dá)，并上調(diào)PPARα蛋白表達(dá)。

圖8 Western blot檢測蒜氨酸對IL-6、TGF-β1和PPARα表達(dá)的影響Fig 8 Effect of alliin on the expression of IL-6，TGF-β1 and PPARα by Western blot

2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

大蒜作為烹飪的一種香料，同時(shí)具有抗菌、抗衰老和抗腫瘤的特性，并且可以通過激活免疫系統(tǒng)來預(yù)防感染[16]。蒜氨酸作為大蒜中主要的生物活性物質(zhì)[17]，同樣展現(xiàn)出了良好的抗炎、抗氧化活性[18]。本實(shí)驗(yàn)通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接模擬初步預(yù)測了蒜氨酸與慢性氣道炎癥之間的密切聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)其中的PPARα是蒜氨酸-慢性氣道炎癥的關(guān)鍵蛋白，并且與蒜氨酸的對接活性也較好，故推測PPARα可能與蒜氨酸調(diào)控慢性氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

CSE會引起高氧化劑負(fù)荷，并使機(jī)體抗氧化能力顯著減弱，容易在機(jī)體累積過量ROS，引起氧化應(yīng)激[19]，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，造成器官、組織或細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷[20]。PPARα是過氧化物酶體增殖物激活的受體，在細(xì)胞脂肪酸氧化、炎癥和免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用[21]。據(jù)報(bào)道，過量的ROS會抑制PPARα的表達(dá)，導(dǎo)致氧化還原失衡，并且可能激活促纖維化細(xì)胞因子TGF-β誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷，刺激成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致小氣道周圍纖維化，加劇肺部纖維化發(fā)生[22]。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CSE和LPS干預(yù)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，過多的ROS引起了相關(guān)炎性因子表達(dá)，造成細(xì)胞的炎癥損傷。蒜氨酸可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，上調(diào)PPARα表達(dá)，減少相關(guān)炎性因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)。表明蒜氨酸可能通過PPARα信號通路來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化平衡的作用，從而減少氣道上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，蒜氨酸通過調(diào)控PPARα信號通路來改善CSE與LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的氧化應(yīng)激與炎癥損傷狀態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)正常的抗氧化、炎癥反應(yīng)。為后續(xù)研究蒜氨酸對慢性氣道炎癥及其他肺部慢性炎癥疾病的保護(hù)機(jī)制提供了理論參考。