王偉杰 趙敏 華振

【摘 要】目的 制備一款針對受損肌膚的面霜，并對其修護、舒緩功效進行探究。方法 配置5 mg/ml透皮纖連蛋白溶液，使用乳豬皮通過體外滲透試驗進行透皮纖連蛋白滲透測試，將皮膚模型隨機分為BC組、NC組、PC組和樣品組，給予各組膠原纖維染色和HE染色，進行脂質(zhì)含量分析，并基于人體的面部圖像觀察。結(jié)果 透皮纖連蛋白的熒光積分光密度（IOD）分析顯示，在滲透24 h后，透皮纖連蛋白在組織中的滲透量顯著高于量高于纖連蛋白（P<0.01）；在滲透2、6、24 h后，透皮纖連蛋白在接收液中的滲透量均顯著高于纖連蛋白（P<0.01）；PC組、樣品組的積分光密度值均顯著高于NC組（P<0.01）；絲聚蛋白（FLG）免疫熒光結(jié)果顯示，和BC組相比，NC組的熒光信號減弱，F(xiàn)LG含量顯著下降（P<0.01）；與NC組相比，PC組和樣品組的FLG熒光信號顯著增加，F(xiàn)LG含量顯著上升（P<0.01）；與NC組相比，PC組與樣品組的熒光信號顯著增強（P<0.01）；和BC組相比，PC組和樣品組膽固醇含量、脂肪酸均含量、神經(jīng)酰胺的含量均顯著增加（P<0.01），且透皮纖連蛋白組的組織形態(tài)、患者臉部紅區(qū)均有明顯改善。結(jié)論 透皮纖連蛋白的滲透顯著性優(yōu)于普通纖連蛋白，可有效改善真皮皮膚模型膠原纖維的損傷，促進真皮修復(fù)；纖連蛋白面霜能有效改善SLS刺激的3D表皮皮膚模型EpiKutis的組織形態(tài)，顯著提升絲聚蛋白（FLG）、屏障脂質(zhì)含量（膽固醇、神經(jīng)酰胺、脂肪酸），改善面部皮膚紅區(qū)，具有良好的修護及舒緩功效。

【關(guān)鍵詞】透皮纖連蛋白；修護；舒緩；功效評價；3D皮膚模型

中圖分類號：TQ658.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）08-0090-05

Study on the Repair and Soothing Effect of a Transdermal Fibronectin-containing Facial Cream

WANG Wei-jie1， ZHAO Min2， HUA Zhen3

（1.Guangzhou Yisheng Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangdong Boxi Biotechnology Co.， Ltd.， Xi’an 710000， Shaanxi， China； 3.The Second Affiliated Hospital of Air Force Military Medical University， Xi’an 710000， Shaanxi， China）

【Abstract】Objective To prepare a cream for damaged skin， and to explore its repair and soothing effect. Methods A 5 mg/ml transdermal fibronectin solution was prepared， and the transdermal fibronectin penetration test was performed using suckling pig skin through in vitro penetration test. The skin model was randomly divided into BC group， NC group， PC group and sample group. Collagen fiber staining and HE staining were performed in each group for lipid content analysis and observation based on human facial images. Results Fluorescence integral optical density （IOD） analysis of transdermal fibronectin showed that after 24 h of penetration， the penetration of transdermal fibronectin in tissues was significantly higher than that of fibronectin （P<0.01）. After 2， 6 and 24 h of permeation， the permeation amount of transdermal fibronectin in the receiving solution was significantly higher than that of fibronectin（P<0.01）. The integral optical density values of PC group and sample group were significantly higher than those of NC group （P<0.01）. The results of FLG immunofluorescence showed that compared with BC group， the fluorescence signal of NC group was weakened， and the content of FLG was significantly decreased （P<0.01）. Compared with the NC group， the FLG fluorescence signal of the PC group and the sample group increased significantly， and the FLG content increased significantly （P<0.01）. Compared with NC group， the fluorescence signal of PC group and sample group was significantly enhanced （P<0.01）. Compared with the BC group， the cholesterol content， fatty acid content and ceramide content in the PC group and the sample group were significantly increased（P<0.01）， and the tissue morphology of the transdermal fibronectin group and the red area of the patient’s face were significantly improved. Conclusion The permeability of transdermal fibronectin is significantly better than that of ordinary fibronectin， which can effectively improve the damage of collagen fibers in dermal skin model and promote dermal repair. Fibronectin facial cream can effectively improve the tissue morphology of EpiKutis？， a 3D epidermal skin model stimulated by SLS， significantly increase the content of silk polyprotein （FLG） and barrier lipids （cholesterol， ceramide， fatty acid）， and improve the red area of facial skin.

【Key words】Transdermal fibronectin； Repair； Soothing； Efficacy evaluation； 3D skin model

纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）是一種普遍存在的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，參與了許多重要的細胞過程，包括傷口愈合和胚胎發(fā)育，以及細胞粘附和遷移等行為的調(diào)節(jié)。有研究表明[1]，纖連蛋白參與了傷口愈合的所有階段并在傷口愈合過程中表達上調(diào)。隨著對纖連蛋白創(chuàng)傷修復(fù)分子機制的深入研究，其在新興生物領(lǐng)域的應(yīng)用也愈加廣泛，并逐步應(yīng)用于美容護膚領(lǐng)域。體外研究表明[2]，纖連蛋白具有促進細胞增殖、創(chuàng)面愈合、膠原合成等作用，因此纖連蛋白是促進醫(yī)美術(shù)后修復(fù)的理想活性物質(zhì)。然而，纖連蛋白作為一種二聚體黏附糖蛋白，由2個約250 kDa的亞基組成的大分子，很難經(jīng)皮滲透進入活細胞層發(fā)揮其生物活性[3，4]。透皮纖連蛋白是利用重組DNA技術(shù)，截取天然纖連蛋白核心活性區(qū)域，融入生物透皮肽技術(shù)，經(jīng)重新組合形成的高活性、高滲透性的小分子化纖連蛋白，在保留生物活性的同時提高其經(jīng)皮吸收率。透皮纖連蛋白面霜是基于前期的基礎(chǔ)研究所開發(fā)出來的，透皮纖連蛋白含量為0.25%[5，6]。本研究通過體外滲透實驗評價透皮纖連蛋白的滲透性，通過SLS刺激的3D表皮皮膚模型、UVA輻射刺激的真皮皮膚模型和人體試驗檢測組織形態(tài)、絲聚蛋白、脂質(zhì)、膠原纖維變化情況，觀察志愿者面部紅斑改善情況，探討該面霜的修護、舒緩功效。

1.1 試劑與儀器 試劑：透皮纖連蛋白（廣州壹笙科技有限公司）；纖連蛋白（廣州壹笙科技有限公司），熒光標(biāo)記的透皮纖連蛋白（廣東博溪生物）；熒光標(biāo)記的纖連蛋白（廣東博溪生物科技有限公司）；透皮纖連蛋白面霜（廣州壹笙科技有限公司，透皮纖連蛋白量含為0.25%）等。模型：3D表皮皮膚模型（廣東博溪生物科技有限公司，EpiKutis？，ES221105）；真皮皮膚模型（廣東博溪生物科技有限公司，DermiKutis？，F(xiàn)221104）等。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品配制 5 mg/ml透皮纖連蛋白溶液：稱取適量透皮纖連蛋白粉末，稀釋成25 mg/ml濃度，過濾后加入真皮皮膚模型中，最終濃度為5 mg/ml。0.25%熒光標(biāo)記的纖連蛋白：稱取12.5 mg熒光標(biāo)記后的纖連蛋白溶于5 ml的PBS中，混勻。

1.2.2體外滲透實驗 將豬皮固定供給室和接收室之間；向接收室中加入接收液7.0 ml，豬皮固定后，添加1 ml接收液（PBS），排凈空氣；向供給室中皮膚表面加入樣品，有效滲透面積S約為3.14 cm2。將透皮纖連蛋白樣品添加至豬皮表面，均勻涂開。分別于滲透后2、6、24 h時間點采集皮膚樣本，吸取PBS清洗皮膚表面5次，用棉簽將表面殘留液體擦干，用刀片環(huán)切皮膚，浸于4%多聚甲醛溶液中固定（固定時間≥24 h）。

1.2.3膠原纖維染色 將真皮皮膚模型（DermiKutis）移到6孔板上，每孔加入2 ml的皮膚模型培養(yǎng)液。同時將模型隨機分為BC組、NC組、PC組和樣品組，每組3個重復(fù)。除BC組外，NC組、PC組和樣品組分別進行UVA輻照（30 J/cm2），隔天輻照，輻照3次。輻照后給藥，PC組液下給藥陽性對照物使終濃度為VC 100μg/ml+VE 7 μg/ml、樣品組液下給藥纖連蛋白溶液使終濃度為5 mg/ml。

1.2.4 HE染色、FLG免疫熒光、脂質(zhì)尼羅紅染色①3D表皮模型給藥：將表3D皮模型轉(zhuǎn)移到6孔板中（提前添加0.9 ml EpiGrowth培養(yǎng)液），NC組、PC組和樣品組表面添加25 μl 0.1%的SLS溶液，孵育30 min。PC組液下給藥12.5 μl 50 μM WY14643[7]，樣品組添加12.5 μl纖連蛋白面霜，置于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中孵育24 h；②HE染色：將模型環(huán)切取下，用4%的多聚甲醛進行固定處理，取樣品切片進行H&E染色檢測；③FLG免疫熒光檢測：用4%的多聚甲醛進行固定24 h后切片，進行免疫熒光檢測（按試劑盒說明書操作）；④脂質(zhì)尼羅紅染色：加50 μl尼羅紅染色液在組織切片上，室溫，避光染色20 min后，用蒸餾水沖洗切片。

1.2.5 脂質(zhì)含量分析 ①模型給藥：將模型轉(zhuǎn)移到6孔板中（提前添加0.9 ml EpiGrowth培養(yǎng)液），將模型隨機分為BC組、PC組、樣品組；PC組添加相應(yīng)濃度的WY14643工作液，樣品組以相應(yīng)的樣品進行處理；②膽固醇測試：將模型環(huán)切至1.5 ml離心管中，加入500 μl 0.2 mg/ml蛋白酶K，置于50 ℃水浴1 h；待角質(zhì)層脫落后，每管加入250 μl的甲醇，超聲30 min，然后14000 rpm離心10 min、60 ℃蒸干甲醇后，保存于4 ℃；③神經(jīng)酰胺、脂肪酸提取及檢測：將模型置于離心管中，加入蛋白酶K溶液，50 ℃水浴2 h；水浴結(jié)束后用鑷子夾取角質(zhì)層于去離子水中漂洗，并置于新的離心管中。

1.2.6基于人體的面部圖像觀察 招募6名成年志愿者試用透皮纖連蛋白面霜，早晚各使用1次，0.5 g/次。在產(chǎn)品使用2周和4周后，6位受試者進行現(xiàn)場回訪，用Visia 7.0儀器拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以（x-±s）表示，行t檢驗；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P<0.001表示統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2.1 透皮纖連蛋白的滲透測試 體外滲透實驗熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，0.25%纖連蛋白和0.25%透皮纖連蛋白凍干粉作用于乳豬皮2、6、24 h后均發(fā)生了滲透行為，且隨著時間的增加，皮膚組織中滲透量不斷增加。熒光積分光密度（IOD）分析顯示，滲透2、6 h后，透皮纖連蛋白在組織中的滲透量高于纖連蛋白，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；滲透24 h后，透皮纖連蛋白在組織中的滲透量顯著高于量高于纖連蛋白（P<0.01）（圖1），表明滲透24 h后，0.25%透皮纖連蛋白凍干粉的滲透性顯著優(yōu)于0.25%纖連蛋白。通過比較接收液熒光OD值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用2、6、24 h后，透皮纖連蛋白在接收液中的滲透量均顯著高于纖連蛋白（P<0.01）（圖2），表明0.25%透皮纖連蛋白凍干粉的滲透性優(yōu)于0.25%纖連蛋白?；钚猿煞种挥袧B透進活細胞層才能發(fā)揮其生物活性，活性物的滲透性是活性物發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)，預(yù)示著同濃度的透皮纖連蛋白可能比纖連蛋白表現(xiàn)出更有效的生物活性。

2.2 透皮纖連蛋白的修護功效

2.2.1膠原纖維Masson染色 Masson染色是顯示膠原纖維分布的經(jīng)典染色方法，利用染色的兩種不同分子量的陰離子在組織滲透性的差異，根據(jù)不同的滲透性能差異，區(qū)分出不同的組織成分。和BC組相比，在UVA刺激下NC組的膠原纖維損傷明顯出現(xiàn)膠原纖維減少斷裂的現(xiàn)象[8]。對染色結(jié)果進行觀察，PC組和樣品組與NC組相比，膠原纖維的數(shù)量增加斷裂減少；對各組的積分光密度（IOD）進行統(tǒng)計學(xué)分析，PC組、樣品組的積分光密度值均顯著高于NC組（P<0.01）（圖3），表明在VC 100 μg/ml+VE 7μg/ml和透皮纖連蛋白5 mg/ml的作用下能顯著改善UVA刺激引起的真皮皮膚模型膠原纖維損傷。

2.2.2 FLG含量測試 FLG是角化包膜組裝過程中關(guān)鍵的成分，是顆粒層向角質(zhì)層分化的重要標(biāo)志物，F(xiàn)LG的表達有利于促進皮膚屏障的正常分化。FLG除了是皮膚屏障的結(jié)構(gòu)性組成，還能夠在半胱胺酸蛋白酶蛋白14（Caspase-14）水解形成天然保濕因子，因此也起到了保濕的作用[9]。FLG免疫熒光結(jié)果顯示，和BC組相比，NC組的熒光信號減弱，表示SLS刺激對模型產(chǎn)生損傷，積分光密度提示FLG含量顯著下降（P<0.01）；與NC組相比，PC組和樣品組的FLG熒光信號顯著增加，積分光密度結(jié)果提示FLG含量顯著上升（P<0.01）（圖4），表明在陽性對照物50μM WY14643和0.25%透皮纖連蛋白面霜作用下能通過顯著提升FLG蛋白含量改善SLS刺激引起的3D表皮模型屏障損傷。

2.2.3 脂質(zhì)的尼羅紅染色 尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，可與脂類物質(zhì)結(jié)合，在激發(fā)波長530 nm激發(fā)下，顯示強烈桔紅色熒光[10]。本次實驗的4個組都顯示橘紅色熒光，說明4個組的模型都存在脂質(zhì)，積分光密度（IOD）結(jié)果顯示，BC組的熒光最強，表明BC組的表皮模型的脂質(zhì)含量最高；NC組的熒光信號最弱，表明NC組的脂質(zhì)含量最低。與NC組相比，PC組與樣品組的熒光信號更強，差異有顯著意義（P<0.01）（圖5），表明50μM WY14643和0.25%透皮纖連蛋白面霜均能顯著改善SLS刺激表皮模型的脂質(zhì)含量。

2.2.4 脂質(zhì)含量分析 結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)是角質(zhì)層磚灰結(jié)構(gòu)中的“砂漿”，對屏障結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，皮膚的選擇性滲透，保持皮膚水分至關(guān)重要，結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)主要包含膽固醇、脂肪酸、神經(jīng)酰胺，三者分布于角質(zhì)細胞之間，是皮膚保持正常屏障功能不可缺少的結(jié)構(gòu)性成分[11]，其中神經(jīng)酰胺占比約為50%，是結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)最重要的成分之一[12]。因此本次實驗研究了0.25%透皮纖連蛋白面霜對3D表皮模型膽固醇、脂肪酸、神經(jīng)酰胺含量的影響。結(jié)果顯示，和BC組相比，PC組和樣品組膽固醇含量、脂肪酸總濃度、神經(jīng)酰胺總濃度均顯著增加（P<0.01）（圖6）。陽性對照物作用后雖然神經(jīng)酰胺含量有所增加，但由于SD值較大而沒有統(tǒng)計學(xué)差異；脂質(zhì)含量分析結(jié)果表明，樣品面霜能通過上調(diào)膽固醇、脂肪酸、神經(jīng)酰胺含量提升屏障功能[13]。

2.2.5 組織形態(tài) 在×40鏡下觀察組織形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與BC組相比，SLS刺激后NC組表皮模型活細胞層變薄，而且出現(xiàn)空泡現(xiàn)象；與NC組相比，PC組和樣品組模型活細胞層增厚，細胞損傷明顯改善，表明陽性對照物和0.25%透皮纖連蛋白面霜能有效改善SLS刺激引起的表皮模型損傷。

2.2.6 基于人體的面部圖像觀察 6名拍照志愿者的面部圖像顯示，使用0.25%透皮纖連蛋白面霜4周后面部的紅區(qū)變小，用Visia拍攝志愿者使用前后的面部照片，使用后志愿者的面部紅區(qū)減少，顏色變淺（圖7），提示0.25%透皮纖連蛋白面霜具有修護、舒緩功效。

通過滲透實驗、體外修護功效評價實驗、人體試驗發(fā)現(xiàn)透皮纖連蛋白的滲透顯著性優(yōu)于普通纖連蛋白，透皮纖連蛋白可有效改善UVB誘導(dǎo)的真皮膠原纖維損傷，促進真皮結(jié)構(gòu)修復(fù)。纖連蛋白面霜能有效改善SLS刺激的3D表皮皮膚模型EpiKutis？的組織形態(tài)，通過顯著提升絲聚蛋白（FLG）、膽固醇、神經(jīng)酰胺、脂肪酸含量，增強皮膚屏障結(jié)構(gòu)，改善面部皮膚紅區(qū)，發(fā)揮皮膚修護、舒緩的功效，可用于有面部修護、舒緩需求的人群。電子注射（水光療法）、光聲電治療通過對表皮或真皮造成不同程度的損傷而發(fā)揮美容作用，本次研究表明透皮纖連蛋白面霜能有效滲透至皮下，促進組織修復(fù)，對促進行電子注射（水光療法）、光聲電治療的術(shù)后恢復(fù)具有積極意義。

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編輯 扶田