許惠玲

福建基諾厚普生物科技有限公司，福建 莆田 351100

生物制藥是利用活體組織、細(xì)胞或微生物合成藥物的過(guò)程。常見(jiàn)的生物制藥物料包括細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)細(xì)胞、基因表達(dá)載體、發(fā)酵劑和營(yíng)養(yǎng)品、純化材料等。在制藥過(guò)程中，某些生物制藥物料可能在特定環(huán)境條件下失去活性，或者在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中出現(xiàn)降解，又或者使用的細(xì)胞和微生物存在一定的被污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要采取適當(dāng)?shù)目刂拼胧苑乐挂蛭锪系馁|(zhì)量問(wèn)題對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量造成影響。因此探析物料質(zhì)量的控制要點(diǎn)，并制定合理的策略，是確保制藥工作穩(wěn)定推進(jìn)的首要工作。

1 生物制藥中物料質(zhì)量的控制要點(diǎn)

1.1 物料污染的控制

在生物制藥工廠中，不同批次或不同產(chǎn)品的物料可能共用一些設(shè)備、管道和工作區(qū)域。如果不充分清潔這些共用設(shè)施，有可能發(fā)生交叉污染，導(dǎo)致微生物、細(xì)菌、病毒或其他有害物質(zhì)傳播到其他批次的產(chǎn)品中[1]。同時(shí)，生物制藥過(guò)程中使用的原料可能暴露在空氣、水和土壤等自然環(huán)境中，這些環(huán)境中存在著大量的微生物和細(xì)菌。如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)目刂拼胧?，這些微生物和細(xì)菌可能進(jìn)入物料中并導(dǎo)致污染。

微生物、細(xì)菌、病毒或其他有害物質(zhì)的污染可能會(huì)引入附加的蛋白質(zhì)、核酸或其他雜質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)品的純度降低。如果這些有害物質(zhì)存在于制藥產(chǎn)品中，可能會(huì)對(duì)使用者的健康產(chǎn)生不良影響，甚至造成嚴(yán)重的副作用。為了確保物料的質(zhì)量和安全性，相關(guān)企業(yè)需要建立監(jiān)測(cè)和檢測(cè)系統(tǒng)，定期對(duì)設(shè)備、物料和產(chǎn)品進(jìn)行檢查，以確保其符合規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 物料不純的控制

從生物源獲取原料時(shí)可能會(huì)夾帶其他生物產(chǎn)物，例如細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞碎片、細(xì)胞分泌物等；部分雜質(zhì)可能會(huì)在制藥過(guò)程中形成，比如在高溫或高壓條件下，蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性或聚集，導(dǎo)致雜質(zhì)產(chǎn)生。這些原料中的雜質(zhì)會(huì)隨著物料進(jìn)入制藥過(guò)程，并且在后續(xù)步驟中難以完全去除[2]。

不相干的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的純度下降。這些雜質(zhì)可能與目標(biāo)蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，降低目標(biāo)蛋白質(zhì)的提取和純化效率，從而降低產(chǎn)品的純度。某些雜質(zhì)可能與目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性相互作用，改變其構(gòu)象或功能，最終可能導(dǎo)致產(chǎn)品在治療或應(yīng)用過(guò)程中失去預(yù)期效果，甚至引起不良反應(yīng)。

1.3 物料變異問(wèn)題

不同個(gè)體或品系的動(dòng)物在遺傳水平上存在差異。這些差異可能包括基因型、表達(dá)水平、代謝能力等方面。因此在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞系可能發(fā)生突變，導(dǎo)致基因組變異。這些突變可能由自然選擇、污染或處理?xiàng)l件等因素引起，例如外部環(huán)境和處理?xiàng)l件（如溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等）的變化可能對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物的基因表達(dá)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致其一致性難以保證[3]。

生物制藥依賴高度一致的生產(chǎn)過(guò)程來(lái)獲得穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量。如果原料中的細(xì)胞或動(dòng)物存在變異，例如細(xì)胞系的突變或動(dòng)物個(gè)體間的遺傳差異，就可能導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程中的一致性難以保證。不一致的原料可能會(huì)導(dǎo)致批次間的差異，使產(chǎn)品無(wú)法滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的要求。

2 生物制藥中物料質(zhì)量的控制策略

2.1 加強(qiáng)物料檢測(cè)，完善源頭控制

在生物制藥過(guò)程中，為了確保原材料的質(zhì)量和安全性，相關(guān)企業(yè)可以使用PCR 等技術(shù)檢測(cè)原材料中微生物、細(xì)菌和病毒等生物體的存在及其感染狀態(tài)。例如，在生物制藥過(guò)程中使用一種細(xì)胞培養(yǎng)基為原材料，該培養(yǎng)基用于生產(chǎn)生物制品。為了確保培養(yǎng)基沒(méi)有受到細(xì)菌污染，需要對(duì)其進(jìn)行微生物檢測(cè)[4]。首先，制藥單位的管理人員需要從生產(chǎn)批次中取出一定量的培養(yǎng)基樣品，將其轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室條件下。其次，確保操作環(huán)境的潔凈，并采取無(wú)菌措施以防止外源污染。其三，使用合適的DNA 提取方法從培養(yǎng)基樣品中提取DNA。這一步驟可以通過(guò)商業(yè)化的DNA 提取試劑盒或其他標(biāo)準(zhǔn)的DNA 提取方法來(lái)完成。其四，確保提取的DNA 質(zhì)量和純度足夠高，以保證后續(xù)PCR 反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可靠性。其五，根據(jù)需檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)菌選擇適當(dāng)?shù)囊?。引物?yīng)具有高度特異性，只能與目標(biāo)細(xì)菌DNA 序列匹配。其六，將引物添加到PCR 反應(yīng)體系中，加入提取的培養(yǎng)基DNA 作為模板，并按照PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)，以擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌DNA 序列。通常PCR 反應(yīng)包括一系列的變性、退火和延伸步驟。在每個(gè)循環(huán)中，目標(biāo)DNA 序列會(huì)指數(shù)級(jí)地?cái)U(kuò)增。最后，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。將擴(kuò)增產(chǎn)物加載到瓊脂糖凝膠上，并通過(guò)電流刺激使DNA 片段在凝膠中遷移。根據(jù)目標(biāo)DNA 序列的大小，可以確定是否存在預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。如果PCR 反應(yīng)出現(xiàn)了預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明培養(yǎng)基樣品中存在目標(biāo)細(xì)菌的DNA 序列，表明可能存在細(xì)菌感染。反之，如果沒(méi)有觀察到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物，則表明培養(yǎng)基樣品中不存在目標(biāo)細(xì)菌的DNA，即無(wú)感染。

除加強(qiáng)對(duì)物料的檢測(cè)外，還要從源頭減少污染的發(fā)生，制藥單位需對(duì)操作員進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，確保他們具備正確的操作技能和衛(wèi)生意識(shí)。同時(shí)，要遵循相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，如GMP（Good Manufacturing Practice）等，維持操作環(huán)境的潔凈度和溫濕度控制，使用空氣過(guò)濾系統(tǒng)、無(wú)菌技術(shù)等來(lái)減少微生物污染，確保設(shè)備和工作區(qū)域的徹底清潔，并驗(yàn)證清洗和消毒程序的有效性。通過(guò)嚴(yán)格的控制措施和合規(guī)要求，可以降低污染源對(duì)生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品的不良影響。

2.2 組合清除技術(shù)，增強(qiáng)物料提純

物料中殘余的雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)藥物的穩(wěn)定性和有效性產(chǎn)生負(fù)面影響。為了清除這些殘余物質(zhì)，可采用酶處理、堿性水解、超濾等多種方法。酶處理涉及使用特定的核酸酶（如DNase 或RNase）來(lái)降解DNA或RNA，從而消除它們的影響。這些酶可以選擇性地切割DNA 或RNA 鏈，使其失去功能。進(jìn)行酶處理時(shí)，需要根據(jù)清除目的選擇合適的核酸酶（如DNase或RNase）；根據(jù)酶的要求，在酶溶液中加入適當(dāng)?shù)木彌_液，以維持最適pH 和離子濃度；輕輕顛倒混合酶溶液，以確保酶的均勻分布，并將適量的酶溶液加入含有待處理的DNA 或RNA 的物料中，根據(jù)酶的操作要求在恰當(dāng)?shù)臏囟认路跤磻?yīng)混合物，一般以37 ℃為宜。之后使用相應(yīng)的方法停止酶反應(yīng)，如加入抑制劑或改變反應(yīng)條件，并通過(guò)凝膠電泳、熒光探針染色等來(lái)檢測(cè)處理后的DNA 或RNA，以驗(yàn)證酶處理的效果。

堿性水解一般用于分解DNA 或RNA 較小的堿基殘基。進(jìn)行堿性水解需要使用氫氧化鈉（NaOH）和磷酸緩沖液等，根據(jù)所需反應(yīng)體系的比例，將適量的堿性試劑加入含有待處理的DNA 或RNA 的樣品中，輕輕搖動(dòng)反應(yīng)混合物，以確保堿性試劑與DNA或RNA 充分接觸，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢跤磻?yīng)混合物一段時(shí)間，在室溫下通常孵育約10～30 min。在反應(yīng)結(jié)束后，添加足夠量的磷酸緩沖液以中和堿性試劑的影響。這有助于防止進(jìn)一步分解或損傷物料。

超濾一般用于清除物料中的細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)聚集體。進(jìn)行超濾時(shí)要選擇合適的膜型和孔徑大小，根據(jù)需要的分子質(zhì)量截留范圍進(jìn)行選擇，同時(shí)準(zhǔn)備將其用于連接超濾器與收集裝置或系統(tǒng)以及收集容器，將超濾器裝置與樣品處理系統(tǒng)連接，確保連接緊固并無(wú)泄漏[5]。將含有需要清除雜質(zhì)的溶液加入超濾器中，通過(guò)超濾器施加適當(dāng)?shù)膲毫Γ梢酝ㄟ^(guò)重力、離心或使用泵等方式），使溶液通過(guò)超濾器。大分子物質(zhì)會(huì)被滯留在超濾器的膜上，而小分子物質(zhì)則通過(guò)膜進(jìn)入收集容器。

2.3 進(jìn)行技術(shù)監(jiān)測(cè)，預(yù)防物料變異

基因組測(cè)序是一種廣泛應(yīng)用于確定DNA 序列的技術(shù)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞系或動(dòng)物個(gè)體的基因組進(jìn)行測(cè)序，可以檢測(cè)到可能的遺傳變異[6]。

首先，收集要進(jìn)行測(cè)序的物料樣本。要確保樣品采集過(guò)程中的無(wú)菌條件，并盡量選擇具有代表性的樣本以獲得全面的數(shù)據(jù)。其次，使用適當(dāng)?shù)腄NA提取方法從樣品中提取基因組DNA，包括常規(guī)的離心、裂解和純化步驟，以從細(xì)胞或組織中提取高質(zhì)量的DNA。其三，將提取的DNA 進(jìn)行片段化處理，并構(gòu)建文庫(kù)，以便于后續(xù)測(cè)序。這通常涉及連接適配器序列并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。其四，使用高通量測(cè)序平臺(tái)（如Illumina HiSeq、PacBio 或Oxford Nanopore）進(jìn)行基因組測(cè)序。這些平臺(tái)可以產(chǎn)生大量的讀取數(shù)據(jù)，覆蓋整個(gè)基因組。其五，對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和數(shù)據(jù)處理，包括去除低質(zhì)量序列、剔除污染物等。其六，使用生物信息學(xué)工具對(duì)得到的序列進(jìn)行比對(duì)和變異檢測(cè)。通過(guò)比對(duì)到參考基因組，檢測(cè)樣品中的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、插入/缺失（InDels）和結(jié)構(gòu)變異等。這些檢測(cè)可以使用一系列的生物信息學(xué)軟件和算法來(lái)實(shí)現(xiàn)。最后，根據(jù)基因組測(cè)序的結(jié)果評(píng)估細(xì)胞系的遺傳變異情況，注重檢查是否存在突變、拷貝數(shù)變異、重排等。

3 結(jié)語(yǔ)

在生物制藥中，物料污染、不純、變異是常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題，也是質(zhì)量控制的要點(diǎn)。制藥企業(yè)在控制策略上要盡可能采取多種方法并行，如物料檢測(cè)要引入PCR 方法，雜質(zhì)清除要采用酶處理、堿性水解、超濾等方法，預(yù)防變異要根據(jù)生理特征及時(shí)進(jìn)行基因組測(cè)序，以此保證質(zhì)量控制的有效性，縮小物料污染、不純和變異等質(zhì)量問(wèn)題的發(fā)生概率，避免因物料質(zhì)量問(wèn)題影響產(chǎn)品效果，對(duì)患者機(jī)體造成損害。