方若思 夏 婷 林晨琪 周湖淇 肖功年

（1浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2貝因美（杭州）食品研究院有限公司，浙江 杭州 310000）

黃酒是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒［1］，其發(fā)酵過程主要涉及三個階段：淀粉的糖化、酵母菌的酒精發(fā)酵和乳酸菌的乳酸發(fā)酵［2］。雖然黃酒發(fā)酵會產(chǎn)生大量氨基酸，營養(yǎng)豐富，但也存在安全問題，尤其是會產(chǎn)生氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）［3］。

EC 是黃酒發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物，已被證明能引起小鼠腫瘤，因此，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將EC 升級為2A，即“可能的人類致癌物”［4］。尿素和瓜氨酸是EC 最主要的前體物［5-6］，一般由精氨酸代謝生成［7-9］，區(qū)別在于酵母會降解精氨酸產(chǎn)生尿素［10］，而乳酸菌通過精氨酸脫亞氨基酶（ariginine desiminase，ADI）途徑分解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸。在乳酸菌中參與ADI途徑的有3種酶：精氨酸脫亞氨基酶（ariginine desiminase，ADI）、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶 （ornithine transcarbamoylase，OTC）和磷酸激酶（creatinine phosphokinase，CK）［11-12］（圖1）。

圖1 乳酸菌的精氨酸脫亞胺酶途徑Fig.1 ADI pathway of Lactic acid bacteria

目前已報道有多種方法可以抑制EC 的形成［13］，主要分為4 類：物理方法、化學(xué)方法、酶學(xué)手段及代謝工程途徑。物理抑制方法主要包括精煉原材料、優(yōu)化生產(chǎn)過程及在下游加工過程中過濾發(fā)酵產(chǎn)物；化學(xué)法主要集中在去除一些化學(xué)物質(zhì)（如氰化物催化劑）以減少EC或前體物含量；酶學(xué)手段主要采用酸性脲酶來降解尿素或氨基甲酸乙酯降解酶來直接催化EC降解；代謝工程途徑在近年來研究非常廣泛，如抑制精氨酸酶基因CAR1的表達(dá)，精氨酸酶可以降解精氨酸，形成EC前體物尿素；或增強(qiáng)尿素循環(huán)和轉(zhuǎn)運途徑中尿素酰胺化酶基因DUR1，2 和尿素轉(zhuǎn)運酶基因DUR3 的表達(dá)。酶學(xué)手段和代謝工程方法大多圍繞尿素開展［14-17］，如添加脲酶，增強(qiáng)尿素代謝途徑中的基因表達(dá)等，但針對OTC酶的研究卻很有限。前期研究表明，OTC 與EC呈負(fù)相關(guān)［18］。在此基礎(chǔ)上，浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院食品生物技術(shù)課題組克隆并突變了9 株產(chǎn)自短乳桿菌（Lactobacillus brevis）的OTC，結(jié)果顯示，H140A和Q143W的突變位點可以顯著提高酶活［19］。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了H140A和Q143W 雙位點突變菌株，探究高酶活突變菌株對黃酒貯藏過程中EC 代謝和黃酒品質(zhì)變化的影響，旨在為黃酒企業(yè)進(jìn)行EC 阻遏提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單位點突變菌株H140A-OTC 和Q143W-OTC 已于前期構(gòu)建［19］并保存于浙江科技學(xué)院食品生物技術(shù)實驗室；精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、茚三酮、異丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG）、硫酸卡那霉素、Ni-NTA 6FF His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，黃酒購自古越龍山黃酒有限公司，為半干型三年陳黃酒，酒精度≥14% vol，總糖含量為15.1～40.0 g·L-1。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax iD3 酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司；TS-5000Z 味覺分析系統(tǒng)，日本INSENT 公司；Waters 2695 高效液相色譜儀，美國WATERS 公司；5975c-7890A GC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用分析儀，美國安捷倫公司；L8900 全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；APV-2000高壓均質(zhì)機(jī)，德國APV公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙位點突變菌株H140A-Q143W-OTC 的構(gòu)建 以單位點突變的菌株Q143W-OTC 為模板，設(shè)計引物如下：正向引物5’-GTTTAACTGATGAATGGGCC CCAACATGGATGCTG-3’，反向引物5’-CAGCATCC ATGTTGGGGCCCATTCATCAGTTAAAC-3’（下劃線部分為突變的位點），進(jìn)行PCR 基因擴(kuò)增，使用限制性核酸內(nèi)切酶DpnⅠ對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行消化處理（37 ℃，2 h）Dpn，以消除父本模板；采用熱擊轉(zhuǎn)化法將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Escherichia coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞中。突變體質(zhì)粒經(jīng)上海生工有限公司測序驗證后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，獲取目標(biāo)菌株并進(jìn)行菌種保藏。

1.3.2 突變菌株與野生菌株OTC 酶的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 挑取抗性平板中長出的單菌落接種到5 mL 含100 μg·mL-1卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min-1的搖床中培養(yǎng)過夜。取2 mL 菌液接種至200 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)3～4 h 至OD600達(dá)到0.6～0.8，然后加入200 μL IPTG，在25 ℃、180 r·min-1的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心30 min，收集菌體，加入30 mL咪唑緩沖液（50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl，20 mmol·L-1咪唑，pH 值8.0） 重懸菌體，隨后采用高壓均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞（壓力為800 bar，進(jìn)行2 個循環(huán)，每個循環(huán)為95 s），再次離心（4 ℃、9 000 r·min-1離心30 min）獲得上清液，采用Ni-NTA 6FF His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行蛋白純化。

1.3.3 黃酒樣品處理 在黃酒樣品中加入相同酶活（10 U·mg-1）的純化后的OTC酶，樣品分為5組，分別為未經(jīng)任何處理的對照組（CK）和4 個OTC 酶處理組，即LB（來自野生型菌株）、H140A（來自H140 位點突變的菌株）、Q143W（來自Q143 位點突變的菌株）和H140-Q143W（來自H140和Q143雙位點突變的菌株）。處理后的黃酒樣品在室溫下儲存40 d。

1.3.4 EC、尿素和瓜氨酸含量的測定 采用Fu 等［20］的高效液相色譜熒光檢測法（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）檢測EC 濃度，分別基于Fu 等［20］和Boyde 等［21］的方法測定瓜氨酸和尿素含量。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及氨基酸含量測定 采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（headspace solid phase microextraction/gas chromatography/mass spectrometry，HS-SPME-GC/MS）分析黃酒樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物［22-23］，采用氨基酸分析儀檢測游離氨基酸的種類及含量。

1.3.6 電子舌味覺分析 采用電子舌（TS-5000Z）進(jìn)行分析測定［24］。

1.3.7 黃酒樣品中的有機(jī)酸分析 采用高效液相色譜儀對黃酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行測定［25］。色譜柱為C18 柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），以 0.05 mol ·L-1pH值2.90 的KH2PO4作為流動相，柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，紫外檢測器波長為215 nm。酒樣經(jīng)離心過濾后直接進(jìn)樣。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3 次，采用SPSS 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTC酶對黃酒不同貯藏時間下EC含量的影響

由圖2 可知，雙位點突變組H140A-Q143W 的EC含量在整個貯藏期間均明顯低于對照組，并在40 d 后持續(xù)下降。H140A 和Q143W 突變組的EC 含量除貯藏5 和30 d 外均低于對照組。野生OTC 酶盡管在前30 d能夠抑制EC，但隨著貯藏時間的延長，EC 水平也隨之升高?？傮w而言，突變OTC酶可以抑制貯藏過程中EC的形成，且濃度最多可降解20%。

圖2 OTC酶對黃酒不同貯藏時間下EC含量的影響Fig.2 Effects of OTC on EC metabolism of yellow rice wine under different storage time

2.2 OTC 酶對黃酒不同貯藏時間下尿素和瓜氨酸含量的影響

由圖3-A 可知，對照組發(fā)酵液中的尿素含量整體低于所有OTC酶試驗組，這意味著胞內(nèi)被利用形成EC的尿素含量較高，從而刺激了EC的產(chǎn)生。這一變化規(guī)律與圖2相符，也與前人報道一致［14］。此外，雙突變組H140A-Q143W 的尿素和瓜氨酸含量相對于其他各組均明顯升高，而單突變H140A和Q143W 組僅略高于對照組（圖3）。

圖3 黃酒貯藏過程中不同處理組尿素和瓜氨酸含量的變化規(guī)律Fig.3 Changes of urea and citrulline contents in different treatment groups during yellow rice wine storage

2.3 黃酒不同貯藏時間下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸的變化規(guī)律研究

黃酒含有多種生物活性成分，尤其是氨基酸。麥曲中蛋白質(zhì)水解會產(chǎn)生大量氨基酸，它們可作為高級醇、醛和其他風(fēng)味化合物的前體，同時，未消耗的氨基酸又可為黃酒提供綿厚的口味。圖4 顯示了不同處理組在40 d貯藏期的氨基酸含量變化。野生型（LB組）總氨基酸含量最高，其次是Q143W、H140A、Q143WH140A 和對照組。表明黃酒中加入OTC 可以促進(jìn)氨基酸的形成，以未突變的促進(jìn)效果最好。

圖4 黃酒貯藏過程中不同處理組游離氨基酸的變化規(guī)律Fig.4 Changes of amino acids in different treatment groups during yellow rice wine storage

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響黃酒感觀和質(zhì)量的最重要因素［26］。陳釀過程可以促進(jìn)酸與醇縮合形成酯，從而改善黃酒的風(fēng)味特征［23，26］。表1 列出了貯藏40 d 后不同處理組的主要風(fēng)味物質(zhì)相對含量，圖5-A較直觀地進(jìn)行了闡明。如圖5-B所示，酸、酯、醇和醛為主導(dǎo)風(fēng)味。占風(fēng)味物質(zhì)近一半的醇類分別為乙醇、苯乙醇、2，3-丁二醇、異戊醇和異丙醇。H140A-Q143W 組的酒精含量最低。酯類主要構(gòu)成與黃酒相關(guān)的果味和香氣［27］。自然發(fā)酵組、對照組和突變組酯類含量相差不大。黃酒中主要的酯類有己酸乙酯、苯甲酸乙酯、琥珀酸乙酯、棕櫚酸乙酯和苯乙酸乙酯。添加OTC 酶后，主要醛類如糠醛和苯甲醛含量有所增加。HS-SPME-GC/MS 共檢測出3 種揮發(fā)性酸，其中乙酸是主要的酸類物質(zhì)。H140A-Q143W組酸度最高。

表1 黃酒樣品中不同處理組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量Table 1 The relative content of volatile flavor compounds in different treatments of yellow rice wine/%

圖5 不同樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較分析Fig.5 Comparative analysis of volatile flavor compounds in different samples

主成分分析（primary component analysis，PCA）的目標(biāo)是根據(jù)數(shù)據(jù)的差異和相似性來解釋數(shù)據(jù)，以便更好地可視化所有信息［28］。本研究對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行PCA 分析，得到3 個主成分，如圖5-C 所示。PC1和PC2 分別占51.3%和31.0%。同時，為表征顯著信號，計算了偏最小二乘回歸-判別分析 （partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 模型的投影變量重要性 （variable importance in projection，VIP） 分?jǐn)?shù)。VIP 分?jǐn)?shù)［29］是一個用于說明特定實驗變量在分類模型定義中相對重要性的指標(biāo)。VIP＞1 的MS 信號通常被認(rèn)為是重要信號［30］。如圖5-D 所示，在黃酒樣品中，標(biāo)志性風(fēng)味物質(zhì)是乙醇、異戊醇和異丙醇?？傮w而言，OTC 酶的添加對黃酒樣品的揮發(fā)性風(fēng)味化合物具有潛在影響。雙位點突變組與其他組有明顯差異，而H140A組與對照組最為相似。

2.4 味覺分析

味覺是影響食品感官和質(zhì)量的另一個關(guān)鍵因素，如今電子舌在食品工業(yè)已有廣泛應(yīng)用［31-32］。圖6的雷達(dá)圖顯示了黃酒不同處理組的味覺分析結(jié)果。曲線的重疊意味著除Q143W 組外，其他各組整體味覺無明顯差異，表明單位點突變組Q143W 可能對黃酒的味道有影響。

圖6 黃酒味覺的雷達(dá)圖Fig.6 Radar plot of yellow rice wine taste

2.5 有機(jī)酸分析

酸是黃酒酒體的重要組成部分，適量的酸在酒中能起到調(diào)節(jié)風(fēng)味的作用，并在貯存過程中與醇類物質(zhì)作用逐漸形成芳香酯。此外，酸不僅能使黃酒酒體協(xié)調(diào)，還能增強(qiáng)黃酒的醇厚感。本研究在黃酒樣品中檢測了幾種重要的有機(jī)酸含量，結(jié)果如圖7 所示?？傆袡C(jī)酸含量范圍在47～116 g·L-1之間，其中乙酸是最主要的有機(jī)酸，含量為21～54 g·L-1，約占總量的一半。與對照組相比，H140A組有機(jī)酸含量明顯增加，雙位點突變組Q143W-H140A 與其幾乎相同，而LB 降低了總有機(jī)酸含量。

圖7 不同黃酒樣品中的有機(jī)酸含量Fig.7 Total organic acids contents in different yellow rice wine samples

3 討論

目前關(guān)于OTC 酶的研究較少，主要集中在人體內(nèi)，由于它是肝臟尿素循環(huán)的必需酶，因此OTC 酶的缺失常導(dǎo)致嗜睡、嘔吐、精神發(fā)育遲緩等癥狀，同時OTC的缺失與否也可作為肝細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo)之一［33-34］。然而OTC 與EC 的直接關(guān)聯(lián)性未見任何研究報道。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵中期添加OTC 酶能明顯降低EC 含量，表明OTC 酶有望應(yīng)用于黃酒的釀造生產(chǎn)；同時，基于來自短乳桿菌OTC 的氨基酸序列，使用Discovery Studio 軟件構(gòu)建突變文庫，發(fā)現(xiàn)Q143W和H140A 突變體的催化活性比野生型高2～3 倍且表現(xiàn)出優(yōu)異的乙醇耐受性，為應(yīng)用于黃酒發(fā)酵提供了新的可能性。本研究在前期基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步探究了突變后的OTC 酶對EC 代謝及貯藏期黃酒品質(zhì)變化的影響。

目前對如脲酶、氨基甲酸乙酯水解酶的相關(guān)酶類研究已有報道，前人通過突變文庫的構(gòu)建和位點的突變改造發(fā)現(xiàn)OTC 對黃酒中的EC 有一定去除作用，且去除率最高可達(dá)16%［35-36］，而本研究將OTC 酶定點突變改造后，對貯藏期的黃酒EC 含量抑制效果明顯，最高可達(dá)20%，且對黃酒的理化品質(zhì)影響不大，證明本試驗方法可行。

傳統(tǒng)釀造黃酒是我國重要的微生物發(fā)酵飲品，獨特的微生態(tài)發(fā)酵體系和復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致其加工品質(zhì)與安全調(diào)控成為黃酒釀造中面臨的主要科學(xué)難題。本研究從酶學(xué)角度出發(fā)，對影響EC代謝的乳酸菌精氨酸代謝關(guān)鍵酶OTC 進(jìn)行定點突變改造并應(yīng)用于黃酒體系，探究其對EC代謝及貯藏期黃酒品質(zhì)變化的影響，具有一定創(chuàng)新性，且酶學(xué)手段與其他抑制方法相比具有明顯優(yōu)勢，如無需特殊加工處理和額外添加化學(xué)物質(zhì)，也未引入未知安全性的菌株，工業(yè)應(yīng)用性強(qiáng)。但同時也存在一定局限性，如盡管未直接在酒體中添加突變菌株，但酶是從突變菌株中分離純化得到，是否存在安全隱患；同時酶的性質(zhì)較不穩(wěn)定，易受外界影響而降解失去活性，如何保障酶在黃酒發(fā)酵及貯藏期間保持活性均是后續(xù)工作需要進(jìn)一步解決的問題。

4 結(jié)論

本研究對鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶在黃酒貯藏過程中對氨基甲酸乙酯的調(diào)控和黃酒品質(zhì)變化進(jìn)行了初步探究，發(fā)現(xiàn)突變的OTC 酶可以抑制貯藏過程中EC 的形成，其中雙位點突變組H140A-Q143W 的抑制作用尤為明顯，EC 含量最多可降解20%，且在氨基酸、味覺、有機(jī)酸等方面也與對照最為接近。這為抑制黃酒發(fā)酵過程中EC的形成提供了一種新方法。