王潤(rùn)萍 許航榮 潘 杰 鐘智威 萬(wàn) 根 阮記明

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）又名黃辣丁、黃姑魚、黃鰭魚等，屬鲇形目（Siluriformes）黃顙魚屬（Pelteobagrus），是我國(guó)具重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的淡水名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種［1］。黃顙魚肉質(zhì)鮮美、無(wú)魚鱗和肌間刺，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，高蛋白、低脂肪且富含鈣、磷、鉀等微量元素，具有降血壓、提高免疫力和預(yù)防貧血等重要的藥用價(jià)值［2］。隨著近年來(lái)黃顙魚養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟、養(yǎng)殖品種不斷優(yōu)化，黃顙魚集約化養(yǎng)殖快速發(fā)展。但由于養(yǎng)殖密度高、環(huán)境負(fù)荷重，直接導(dǎo)致細(xì)菌引起的傳染性疾病迅速增加，且頻繁暴發(fā)。目前已有報(bào)道的黃顙魚主要細(xì)菌性疾病包括紅頭?。?］、出血?。?］、腹水?。?］等。腹水病，也叫“大肚子”病，是黃顙魚養(yǎng)殖過(guò)程中一種急性傳染病，發(fā)病速度快、發(fā)病范圍廣、發(fā)病率和死亡率高［6-7］。然而，目前報(bào)道中引起腹水病的病原菌并不唯一，包括愛(ài)德華氏菌［8］、嗜水氣單胞菌［9］等，給預(yù)防和治療都帶來(lái)了困難，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，并且嚴(yán)重制約了黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。另外，同種的病原菌在耐藥性上存在時(shí)間和地域上差異，進(jìn)一步加深了治療的難度。因此，對(duì)于黃顙魚腹水病病理特征、病原菌種類及菌株特性進(jìn)行深入研究具有重要意義。

2021年3—5月，江西南昌縣多個(gè)黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)大規(guī)模腹水病，死亡率高，治愈困難。為查清病原，本研究對(duì)患病樣本進(jìn)行采集和解剖分析，對(duì)病原菌進(jìn)行分離、鑒定；同時(shí)對(duì)菌株藥敏特性、攜帶毒力基因的情況等進(jìn)行初步分析，旨在為更深入地研究腹水病致病機(jī)理提供理論依據(jù)，同時(shí)為該類細(xì)菌性疾病的防治提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用病魚、健康魚均從南昌市南昌縣某養(yǎng)殖場(chǎng)采集，魚體平均體長(zhǎng)15～18 cm，體重17～20 g。

1.1.2 主要試劑 蛋白胨、酵母粉、0.9%生理鹽水、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒［寶生物工程（大連）有限生物公司］、2×Taq PCR Mix（北京索萊寶科技有限公司）、Goldview 染料（北京索萊寶科技有限公司）、藥敏片（杭州微生物試劑有限公司）、波恩氏固定液等。肉膏蛋白胨（Luria-Bertani, LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、NaCl 10 g、瓊脂20 g·L-1（固體平板），pH值7.2。16S rDNA 通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATC ATGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3′。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 癥狀及組織病理觀察 將病魚和健康魚的體表沖洗干凈，無(wú)菌條件下分別剖取病魚、健康魚的鰓絲、肝、脾、腎、腸等組織塊（1 cm×1 cm×1 cm），在波恩氏液中固定24 h，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行蘇木精-伊紅法染色（Hematoxylin Eosin staining，HE）、切片、拍照和分析。

1.2.2 病原菌的分離和純化 將病魚于無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行解剖，取肝臟、腎臟及腸道組織進(jìn)行勻漿，0.9%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取上清液于LB 平板涂布，28 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，挑選培養(yǎng)基上大小、形態(tài)及顏色不同的菌落，進(jìn)行2～3 次分離純化，獲得純菌株，-80 ℃條件下保藏備用。

1.2.3 16S rDNA 測(cè)序分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將純化好的菌接種于LB 液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)菌并提取總DNA，以菌體總DNA 為模板，采用通用引物進(jìn)行16S rDNA 的PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：DNA 模板1 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，2× Taq PCR Mix 25 μL，雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR 條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將合格產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序列結(jié)果在NCBI 進(jìn)行Blast比對(duì)，根據(jù)同源性序列比對(duì)結(jié)果確定菌株分類；其次，選取模式菌株16S rDNA 序列，采用MEGA7.0 中鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，置信度檢驗(yàn)（Bootstrap）為1 000。

1.2.4 人工回復(fù)感染 挑取分離菌株單菌落于腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion medium，BHI）中，28 ℃培養(yǎng)約20 h，取1 mL 菌液，6 000×g離心3 min，用1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗2次后，用1 mL PBS 重懸。菌液初始濃度為1×108CFU·mL-1，進(jìn)行10倍梯度稀釋至1×107、1×106、1×105、1×104CFU·mL-1，進(jìn)行攻毒，一組注射PBS 作為對(duì)照組；每組10 尾魚，每尾魚注射100 μL，水溫（20±1） ℃，連續(xù)觀察7 d。統(tǒng)計(jì)患病情況和死亡率，同時(shí)對(duì)感染患病魚進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.2.5 菌株的藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B）［10］，將分離獲得的菌液涂布在LB平板上，依次將各藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記。倒置放于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別測(cè)量各個(gè)抗菌藥物的抑菌圈直徑，計(jì)算平均值。

1.2.6 菌株毒力基因分布 參照Wang 等［11］的方法，提取細(xì)菌基因組DNA 作為模板，分別對(duì)菌株氣溶素（aerA）、細(xì)胞毒性腸毒素（act）、鞭毛（fla）、熱穩(wěn)定細(xì)胞腸毒素（ast）、甘油磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（gcaT）、絲氨酸蛋白酶（ser）、Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因（ascV）、脂肪酶（lip）及核酸酶（exu）共9 種毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1［12］，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The sequences of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 病癥及組織病理學(xué)觀察

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，魚體表無(wú)明顯的傷痕，鏡檢體表、鰓及其他組織未發(fā)現(xiàn)寄生蟲感染。腹部膨脹明顯（圖1-a）；肛門發(fā)炎，紅腫突出（圖1-a、b）。解剖后觀察未發(fā)現(xiàn)寄生蟲，腹腔內(nèi)充滿黃色透明、果凍狀粘液；膽囊腫大發(fā)黑；腸道空腸，腸壁變薄、甚至透明；肝臟發(fā)黃；部分病魚的腸道、胃等內(nèi)臟有大量出血點(diǎn)（圖1-c）。

圖1 黃顙魚腹水病臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of naturally infected ascites P.fulvidraco

顯微觀察可見(jiàn)，患病黃顙魚的鰓小片上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，大量壞死、脫落；柱細(xì)胞排列扭曲，部分脫落、彌散；鰓小片扭曲、斷裂；鰓絲間充滿彌散、壞死的細(xì)胞（圖2-a）。健康黃顙魚的鰓絲和鰓小片有規(guī)律地沿一個(gè)方向緊密排列，鰓組織結(jié)構(gòu)完整，鰓絲間隙清晰，鰓小片上皮細(xì)胞排列緊密、規(guī)律、完整（圖2-b）。

圖2 黃顙魚組織切片觀察（×200）Fig.2 Histological section observation of P.fulvidraco （×200）

腎組織中，患病黃顙魚腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)張、內(nèi)刷狀緣結(jié)構(gòu)消失、上皮細(xì)胞壞死、脫落；腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2-c）。健康黃顙魚腎組織結(jié)構(gòu)完整，清晰；腎小球飽滿，邊界清晰；腎小管內(nèi)刷狀緣結(jié)構(gòu)完整（圖2-d）。

肝組織中，患病黃顙魚肝組織部分區(qū)域出現(xiàn)空泡，肝細(xì)胞排列紊亂、大量壞死；中央靜脈周圍細(xì)胞出現(xiàn)彌散，內(nèi)皮脫落；肝板結(jié)構(gòu)斷裂；肝血竇擴(kuò)張（圖2-e）。健康黃顙魚細(xì)胞肝板由中央靜脈向四周呈輻射狀散開(kāi)且結(jié)構(gòu)紋路規(guī)則，血管內(nèi)紅細(xì)胞充盈（圖2-f）。

腸道組織中，患病黃顙魚腸絨毛上皮細(xì)胞脫落、彌散；杯狀細(xì)胞消失，固有層、粘膜下層細(xì)胞壞死、脫落；腸絨毛脫落、彌散（圖2-g）。健康黃顙魚腸道結(jié)構(gòu)完整、清晰，杯狀細(xì)胞清晰、規(guī)律排列（圖2-h）。

2.2 病原菌的分離鑒定及回感

由LB 平板分離純化獲得形態(tài)、大小相同的菌株1 株，菌命名為PL1。菌株P(guān)L1 在LB 平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈乳黃色、圓形，表明光滑、濕潤(rùn)，邊緣整齊（圖3）。

圖3 菌株P(guān)L1在LB培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphologies of the strain PL1 on LB plate

對(duì)菌株P(guān)L1 的16s rDNA 進(jìn)行擴(kuò)增獲得長(zhǎng)1 342 bp片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序及NCBI中BLAST比對(duì)表明菌株P(guān)L1與維氏氣單胞菌Aeromonas veronii同源性最高，相似度為99.85%。同時(shí)利用軟件MEGA7.0（NJ 法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明菌株P(guān)L1 與維氏氣單胞菌聚為一支（圖4）。最終確定菌株P(guān)L1為維氏氣單胞菌A.veronii。

圖4 菌株P(guān)L1 16S rDNA序列進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of the strain PL1

通過(guò)人工回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組生長(zhǎng)良好，無(wú)發(fā)病癥狀（圖5-a），注射菌株P(guān)L1試驗(yàn)組黃顙魚出現(xiàn)明顯病癥：泄殖孔發(fā)炎突出，腹部膨大（圖5-b），解剖有大量腹水（圖5-c）。注射菌體濃度為1×106、1×107CFU·L-1組的黃顙魚，均在感染72 h 后全部死亡，并且從發(fā)病魚的肝、腎中再次分離獲得菌株P(guān)L1。表明菌株P(guān)L1 為本次黃顙魚腹水病主要病原菌。

圖5 人工感染黃顙魚癥狀Fig.5 Symptoms of artificially infected P.fulvidraco

2.3 藥敏試驗(yàn)

菌株A.veroniiPL1 對(duì)30 種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），其對(duì)多粘菌素、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、氯霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶等12 種抗生素敏感，其中對(duì)復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢曲松及頭孢哌酮4 種抗生素最為敏感（圖6）。對(duì)氧氟沙星、紅霉素和哌拉西林3 種抗生素中度敏感；對(duì)麥迪霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬(wàn)古霉素、青霉素、克林霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、頭孢唑林及頭孢拉定等15 種抗生素具有耐受性。

圖6 K-B平板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Drug sensitive test results of K-B plate method

表2 維氏氣單胞菌PL1藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitive test results of the strain A.veronii PL1

2.4 毒力基因檢測(cè)

由圖7 可知，在檢測(cè)的9 種毒力基因中，共檢測(cè)到6 種毒力因子基因：aerA、act、gcaT、Ser、fla、ascV；未檢測(cè)到ast、lip、exu3種毒力基因。

圖7 菌株A.veronii PL1毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of the strain A.veronii PL1

3 討論

腹水病已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見(jiàn)的危害性極大的傳染性疾病，目前已有大量水生生物患腹水病的報(bào)道，如異育銀鯽（Carassais auratus gibebio）［13］、大鯢（Andrias davidianus）［14］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［15］、日本鰻鱺（Anguilla japonicus）［16］、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）［17］等。根據(jù)目前發(fā)現(xiàn)病例及文獻(xiàn)報(bào)道，腹水病主要特征為魚體腹部膨大，腸道內(nèi)無(wú)食物，腹腔內(nèi)有積液。而根據(jù)有無(wú)出血及肛門紅腫、潰爛等可以將腹水病分為溶血性腹水病和非溶血性腹水病，其中溶血性腹水病主要由細(xì)菌感染引起，非溶血性腹水病由營(yíng)養(yǎng)代謝異常引發(fā)［18］。本研究中，病魚主要癥狀表現(xiàn)為腹部膨大，魚體消瘦，肛門紅腫突出，腸道無(wú)食物，腹腔大量腹水，腹水離體后呈現(xiàn)凝膠狀。可見(jiàn)，本研究中黃顙魚（P.fulvidraco）腹水病為細(xì)菌溶血性腹水病。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，患病黃顙魚各組織均有不同程度損傷：肝臟、腎臟及腸道組織中均存在細(xì)胞空泡、細(xì)胞壞死、脫落，紅細(xì)胞浸潤(rùn)等共同特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了魚體腹水的形成可能與肝、腎以及腸組織的病變密切相關(guān)［19］。

本研究從腹水病黃顙魚肝臟、腎臟中分離獲得病原菌，腹水中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌存在，經(jīng)鑒定表明病原菌為維氏氣單胞菌A.veronii。維氏氣單胞菌是一種重要的人、畜及水生生物共患性病原菌，能夠引起中華鱉（Trionyx sinensis）軟殼?。?0］、異育銀鯽（C.gibebio）死亡［21］、草魚（Ctenopharyngodon idellus）膿毒癥［22］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）死亡［23］等危害，還可引起人類胃腸炎、軟組織感染、敗血癥和外傷感染等病癥，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)嚴(yán)重威脅著人類的安全與健康［24-25］。本研究中，菌株A.veroniiPL1對(duì)復(fù)方新諾明、氯霉素、頭孢曲松和頭孢哌酮這4種抗生素敏感性最強(qiáng)，但其中氯霉素是水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥，因此，其余3 種抗生素可在實(shí)際生產(chǎn)中用于該病的治療。另外，該菌株對(duì)麥迪霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星等15 種抗菌藥物具有耐藥性，呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，與以往研究相比耐藥性呈現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)［26-27］。推測(cè)可能與養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期使用抗生素致使耐藥性增強(qiáng)相關(guān)，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，必須科學(xué)合理有效的使用漁藥。同時(shí)，有必要對(duì)維氏氣單胞菌的致病機(jī)理進(jìn)行更深入研究，為開(kāi)發(fā)預(yù)防疫苗、快速診斷試劑盒以及一些新型抗菌藥物等提供依據(jù)。

有關(guān)研究表明，A.veronii致病性與毒力基因的存在關(guān)系密切［28］。宋明芳等［29］研究表明氣單胞菌具有多中毒力基因，能夠表達(dá)分泌氣溶素、腸毒素、胞外蛋白等多種毒力因子。其中，氣溶素基因（aerA）是維氏氣單胞菌最重要、最豐富的毒力基因之一，其編碼的蛋白具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性，可破壞宿主細(xì)胞膜通透性，裂解細(xì)胞［30］。前人研究表明，嗜水氣單胞菌中的氣溶素能夠干擾人類腸上皮緊密連接的完整性和細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程［31］。其次，細(xì)菌腸毒素可以引起人、畜、畜禽腸道上皮細(xì)胞代謝紊亂，黏膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致功能失調(diào)，引起腹瀉等病癥。腸毒素包括細(xì)胞毒性腸毒素（cytotoxic enterotoxin，Act）、熱不穩(wěn)定性腸毒素（heat-labile cytotonic enterotoxin，Alt）和熱穩(wěn)定性腸毒素（heat-stable cytotonic enterotoxin，Ast）。其中，腸毒素基因能夠提高巨噬細(xì)胞細(xì)胞系中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白細(xì)胞介素 1（interleukin 1，IL-1）以及組織溶解產(chǎn)生的其他炎癥細(xì)胞因子的水平［32］。gcaT和ascV基因編碼的分泌蛋白，在氣單胞菌感染的致病性中起重要作用［33］。大多數(shù)氣單胞菌都能在極性鞭毛作用下運(yùn)動(dòng)。細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力是氣單胞菌重要的毒力因子，因此鞭毛基因fla也是病原菌重要的毒力基因之一［33］。本研究中，菌株A.veroniiPL 攜帶aerA、act、gcaT、ser、fla及ascV多種毒力基因，表明菌株P(guān)L1可通過(guò)表達(dá)毒力因子，導(dǎo)致魚腸道炎癥、充血、消化吸收受阻，引起黃顙魚腹水病癥。綜合上述基因分析結(jié)果表明，菌株P(guān)L 具有較強(qiáng)毒力，人工回歸感染也表明該菌株具有較強(qiáng)的致病性，能夠引發(fā)黃顙魚腹水病，造成死亡。而關(guān)于其致病途徑和機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從患有典型腹水病黃顙魚體內(nèi)分離出1 株優(yōu)勢(shì)菌PL1，對(duì)其進(jìn)行了分離鑒定、回歸感染以及耐藥性、毒力基因分析。通過(guò)16S rDNA 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果表明菌株P(guān)L1為維氏氣單胞菌。回歸感染試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射菌株P(guān)L1的黃顙魚表現(xiàn)出與自然發(fā)病相同的典型腹水病臨床癥狀：腹部膨大、腹腔內(nèi)積水，表明該菌株為此次黃顙魚腹水病主要病原菌。毒力基因分析表明，菌株P(guān)L1 攜帶有aerA、act、gcaT、ser、fla、ascV等6 種毒力基因，具有較強(qiáng)毒力。耐藥性試驗(yàn)結(jié)果表明菌株P(guān)L1對(duì)復(fù)方新諾明、氯霉素和頭孢曲松、頭孢哌酮敏感性最好，但同時(shí)對(duì)多達(dá)15 種抗生素產(chǎn)生耐藥性，呈現(xiàn)出多重耐藥性。