李浩霞 黃穩(wěn)娥 柳西寧 朱馨蕾 任曉月 安巍 周軍 趙建華

摘要：以9種不同基因型枸杞的不同組織（莖、葉、花、果）和不同發(fā)育期（FS1～FS5）的果實為試材，選取Act-1/Act-3、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub為候選內(nèi)參基因，利用實時熒光定量技術(shù)（RT-qPCR）檢測了9個候選基因在不同基因型枸杞的不同組織和不同發(fā)育階段果實中的表達水平。并采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct、RefFinder分析方法，評估候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，并選擇Beat基因驗證內(nèi)參基因。結(jié)果表明，Ef1a為不同基因型枸杞的不同組織和5個發(fā)育時期果實中表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，Gapdh為表達最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在寧夏枸杞中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Rh37，其次為Ef1a。進一步采用Beat基因?qū)Σ煌蛐丸坭降牟煌M織（莖、葉、花、果）和5個發(fā)育時期果實中的表達模式進行驗證，表明Ef1a、Act-1基因可作為枸杞穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：枸杞；內(nèi)參基因；實時熒光定量PCR；定量分析

中圖分類號：S567.1+90.1??文獻標志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0041-11

基金項目：國家自然科學基金（編號：32060359）；寧夏自然科學創(chuàng)新群體基金（編號：2021AAC01001）；寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)計劃（編號：2021BEF02002）；寧夏經(jīng)濟林遺傳改良創(chuàng)新團隊項目（編號：2022QCXTD04）。

作者簡介：李浩霞（1977—），女，甘肅景泰人，副研究員，主要從事旱作農(nóng)業(yè)和栽培生理研究。E-mail：lihaoxia0943@163.com。

通信作者：趙建華，博士，副研究員，主要從事林木遺傳改良與功能基因組學研究。E-mail：zhaojianhua0943@163.com。

枸杞（Lycium）是茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium Linn.）多年生植物，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿等特性，是改良土壤的先鋒樹種［1-3］。我國枸杞資源較為豐富。近年來，寧夏農(nóng)林科學院收集有國內(nèi)外枸杞屬10個種、3個變種以及特異性種質(zhì)資源 2 000 余份，活體保存20 000余株［4-5］。寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我國藥典收錄的唯一枸杞屬植物［6］。研究表明，枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素、黃酮等是枸杞子中重要的功效物質(zhì)，具有促進免疫、降低血糖、抗氧化、延緩衰老等生物活性［7-9］。近年來從枸杞子中分離鑒定出枸杞亞精胺A-O，是一種具有抗阿爾茨海默病、抗氧化、抗衰老和神經(jīng)保護作用的生物活性成分［10-12］。目前，枸杞的研究報道主要集中于栽培育種、資源化利用、營養(yǎng)活性成分研究［13］、生理及藥理作用［7-9］和逆境條件下的響應機制［14-15］等方面。在功能基因組層面上的研究較少，僅有少量枸杞基因功能和基因表達模式分析的報道。關(guān)于枸杞內(nèi)參基因篩選的報道的研究材料多用黑果和寧杞1號［16-18］。目前尚未見有關(guān)不同基因型枸杞內(nèi)參基因篩選的報道。

實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)是在PCR反應體系中加入熒光作為熒光探針，實時監(jiān)測PCR反應進程熒光信號積累，并通過制作標準曲線計算待測樣本相對表達量的一種技術(shù)［19］。它具有靈敏度高、重復性好、可檢測大量樣本且比常規(guī)RT-PCR檢出率高等優(yōu)勢［20-21］，廣泛應用于基因表達水平的分析。但在試驗操作過程中，RNA的質(zhì)量和濃度、cDNA的逆轉(zhuǎn)錄過程、PCR的擴增程序和條件等都會影響定量結(jié)果［22］。通常需要選取好的內(nèi)參基因，為目標基因的表達量提供科學參照標準。在植物的RT-qPCR分析中，內(nèi)參基因包括肌動蛋白基因Actin（Act-1/Act-3）、18S核糖（18S rRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（Ef1a）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管和β微管蛋白基因（TUA、TUB）、 組蛋白H3b基因（H3b）、4-?；o酶A過氧化物酶基因（Acx4）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因（Pp2a）、DEAD-box RNA解旋酶基因（Rh37）、S-腺苷甲硫氨酸合酶基因（Samc）以及親環(huán)蛋白基因（CYP） 等［16-18，23］。在植物內(nèi)參基因的研究中，內(nèi)參基因在不同材料、組織、發(fā)育時期和試驗條件下的表達穩(wěn)定性存在差異。在小麥中，內(nèi)參基因Ef1a表達穩(wěn)定性較好［24］。但在番茄的葉片和根組織中卻發(fā)現(xiàn)，Ef1a的表達量表現(xiàn)出高度的可變性［25］。趙藝蕊等以山核桃的不同組織及不同試驗處理為研究對象，發(fā)現(xiàn)山核桃不同組織和處理間的最適內(nèi)參基因存在差異［26］。張芷睿等利用實時熒光定量PCR技術(shù)對大豆不同發(fā)育時期的18個組織樣本進行內(nèi)參基因研究，發(fā)現(xiàn)出苗期、第1張三葉期、始花期、初莢期的內(nèi)參基因各不相同［27］。周琳等在彩色馬蹄蓮的不同品種和組織中也發(fā)現(xiàn)最適內(nèi)參基因是不同的［28］。楊陽等則發(fā)現(xiàn)，在不同發(fā)育階段和逆境條件下篩選出的多花黃精塊莖的適宜內(nèi)參基因存在差異［29］。因此，對于不同植物材料和組織，需根據(jù)具體的試驗要求，對內(nèi)參基因進行穩(wěn)定性篩選和驗證，以確保試驗結(jié)果的可靠性。

本研究以9個不同基因型枸杞為試驗材料，選取Act-1/Act-3、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub共9個候選內(nèi)參基因，以枸杞的不同組織和果實的不同發(fā)育階段為測試樣本，分析這些基因的表達穩(wěn)定性，并通過分析影響枸杞花香主要物質(zhì)——乙酸芐酯合成的苯甲醇乙?；D(zhuǎn)移酶（Acetyl-CoA：benzylalcohol acetyltransferase，BEAT）基因［30］的表達量，進一步驗證9個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試枸杞品種及信息?供試枸杞的品種為寧杞1號、寧杞7號、北方、寧夏黃果、黑果、中國、昌吉、蒙杞1號、白花，均來自寧夏農(nóng)林科學院枸杞科學研究所國家枸杞種質(zhì)資源圃（38°380′N，106°9′E，海拔1 100 m），樹齡8年，于2021年6—7月盛果期，每個品種分別選取3棵無性植株的新枝莖（S）、葉片（L）、未開放或剛開放的花（F）及5個發(fā)育階段（FS1～FS5）的果實，采集樣品后速凍于－80 ℃的液氮中，材料信息詳見表1。果實5個發(fā)育階段分別為開花后9～12 d（FS1）、14～19 d（FS2）、20～26 d（FS3）、30～37 d（FS4）、34～45 d（FS5）。

1.2.1?儀器設備與試劑?離心機，Centrifuge 5424，德國艾本德股份公司；熒光定量PCR儀，CFX96TM Real-Time System C1000 TouchTM Thermal Cycler，美國 Bio-Rad 公司；超微量紫外可見分光光度計，NanoPhotometer N60 Mobile，Implen公司； 超低溫冰箱，DW-HL340，中科美菱低溫科技股份有限公司；電泳儀，DYY-11型，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，Gel DocxR+，美國Bio-Rad公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，50次，天根生化科技（北京）有限公司；乙醇，500 ml，徐州天鴻化工貿(mào)易有限公司；巰基乙醇，100 mL，上海士鋒生物科技有限公司；Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （perfect real time）反轉(zhuǎn)錄試劑，100次，日本TaKaRa公司；2×Quanti Nova SYBR Green PCR Master Mix，2 500次，凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；ddH2O，100 mL。

1.2?方法

1.2.1?枸杞總RNA提取及cDNA合成?采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒分別提取不同基因型枸杞莖、葉、花、果實的5個不同發(fā)育階段的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，超微量紫外可見分光光度計檢測RNA的濃度和純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA于 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?內(nèi)參基因的選擇及qRT-PCR引物設計?從枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選候選內(nèi)參基因（表2），用Primer Premier 5.0設計候選內(nèi)參基因的 qRT-PCR 引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經(jīng)PCR擴增后，初步選出9個相對穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因。其中Actin基因設計2對引物，在實時熒光定量中，通過熔解曲線判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說明引物特異性好。通過構(gòu)建標準曲線來計算各引物的擴增效率（E）以及線性相關(guān)系數(shù)（r）。

1.2.3?qRT-PCR反應條件?在CFX96TMReal-Time System C1000 TouchTM Thermal Cycler熒光定量PCR儀上進行反應。RT-qPCR反應體系（20 μL）：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共40個循環(huán)；最后 65 ℃ 開始以0.5 ℃每步升溫至95 ℃。枸杞莖、葉、花、果實的5個發(fā)育時期，各設3個生物學重復。

1.2.4?引物特異性和擴增效率分析?將等量混勻的所有組織樣品的cDNA原液稀釋10倍，共設置7個濃度梯度，即100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，測定RT-qPCR的標準曲線。程序運行完成后計算擴增效率（E）和線性相關(guān)系數(shù)r。取2 μL PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)合PCR反應后的熔解曲線圖確定引物的特異性。

1.2.5?候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價?利用Microsoft Excel、Origin Pro 8.5軟件對獲得的原始CT值進行統(tǒng)計與處理。使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Microsoft Excel中的Delta CT方法評估9個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。geNorm算法確定每個基因的表達穩(wěn)定性值（M），具有較低M值的候選內(nèi)參基因具有更穩(wěn)定的表達［31］。NormFinder使用基于模型的方法來估計候選內(nèi)參基因表達的變化，為每個候選內(nèi)參基因分配一個穩(wěn)定性值，因此具有較低值的候選內(nèi)參基因更穩(wěn)定［32］。BestKeeper根據(jù)原始數(shù)據(jù)（CT值）計算候選內(nèi)參基因的標準偏差（SD），SD值越低被認為越穩(wěn)定［33］。Delta-CT方法通過兩兩比較計算平均SD值；較低的SD值表示基因較穩(wěn)定［34］。最后，RefFinder是一種基于網(wǎng)絡的綜合算法，用于評估和篩選候選內(nèi)參基因，它集成了4個計算程序（geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta-CT）對候選內(nèi)參基因進行排序?；诿總€項目的排名，它為單個基因分配適當?shù)臋?quán)重，并計算其權(quán)重的幾何平均值，以進行總體最終排名［35］。

1.2.6?選定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗證?選擇Beat基因評估內(nèi)參基因。使用表2中的引物Beat-F、Beat-R 擴增Beat基因全長，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa，D101A），測序，再確認并提交給GenBank（OM275425）。在各種組織中測量基因表達，并通過最佳內(nèi)參基因（Ef1a、Act-1）和最不穩(wěn)定內(nèi)參基因（Acx4、Gapdh）進行標準化。qRT-PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法［36］。

2?結(jié)果與分析

2.1?總RNA質(zhì)量

提取不同基因型枸杞不同發(fā)育階段和不同組織（莖、葉、花、果）的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用超微量紫外可見分光光度計檢測RNA的濃度和純度。各樣品RNA在28S、18S、5S處有單一且明亮清晰的條帶，可見RNA的完整性較好。超微量紫外可見分光光度計檢測結(jié)果顯示，各樣品RNA的D260 nm/280 nm為1.8～2.1，說明各樣品RNA純度較高，滿足后續(xù)試驗要求。

2.2?候選內(nèi)參基因引物特異性和擴增效率分析

PCR檢測引物特異性，候選內(nèi)參基因均在90～250 bp擴增出與預期一致的單一條帶。經(jīng)RT-qPCR檢測，候選內(nèi)參基因均能產(chǎn)生單一的熔解峰（圖1）。用標準曲線法計算候選內(nèi)參基因的擴增效率（E），各候選內(nèi)參基因的E在91.27%～103.85%之間，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.99（表2）。結(jié)果表明所篩選的引物特異性及擴增效率均良好，可進行下一步的RT-qPCR試驗。

2.3?候選內(nèi)參基因CT值分析

CT值是PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定閾值時經(jīng)過的擴增周期數(shù)［33］。CT值可反映候選內(nèi)參基因的表達豐度，CT值越小，基因表達豐度越高，反之亦然。從9個候選內(nèi)參基因在不同基因型枸杞的不同組織、不同發(fā)育階段、寧夏枸杞、非寧夏枸杞及總樣本中的CT值箱線圖（圖2）可知：Act-1、Ef1a、H3b、Tub的CT值較小，Gapdh-1、Acx4的CT值較大。從分布范圍上來看，Act-1、Ef1a、H3b、Tub分布較集中，Gapdh-1、Acx4分布較分散；從表達水平來看，Act-1、Ef1a、H3b、Tub的表達水平波動范圍窄，Gapdh-1、Acx4波動范圍寬。因此可初步判斷Act-1、Ef1a、H3b、Tub的表達水平較其他基因更穩(wěn)定，可作為候選內(nèi)參基因。

2.4?候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

2.4.1?比較Delta CT?Delta CT分析結(jié)果顯示，候選內(nèi)參基因在不同基因型枸杞不同組織（圖3-A）和不同發(fā)育階段（圖3-B）中表達穩(wěn)定的基因分別為Ef1a、Act-1，不穩(wěn)定的基因分別為Acx4、Gapdh。在寧夏枸杞中基因表達穩(wěn)定性有所不同，即Rh37最為穩(wěn)定，其次為Ef1a；Gapdh穩(wěn)定性最差（圖3-C）。在非寧夏枸杞中表達最穩(wěn)定的基因為Ef1a，其次為H3b；Acx4穩(wěn)定性最差，其次為Gapdh（圖3-D）。

2.4.2?geNorm分析?利用geNorm程序，計算基因的表達穩(wěn)定值（M），并依據(jù)M值對基因的表達穩(wěn)定性進行排序，結(jié)果表明，各候選基因穩(wěn)定性在不同基因型枸杞的不同組織（圖3-E）、不同發(fā)育階段（圖3-F）以及寧夏、非寧夏枸杞（圖3-G、圖3-H）中，Ef1a基因表達穩(wěn)定性均表現(xiàn)最優(yōu)，而表達穩(wěn)定性最差的基因分別為Gapdh、Axc4。

2.4.3?NormFinder分析?NormFinder根據(jù)表達穩(wěn)定值（expression stability value，M）衡量基因表達穩(wěn)定性，M值越小，基因的表達穩(wěn)定性越好。NormFinder分析結(jié)果表明，各候選基因穩(wěn)定性在不同基因型枸杞的不同組織（圖3-I）、果實不同發(fā)育階段（圖3-J）以及非寧夏枸杞（圖3-K）中，表達穩(wěn)定性最好的基因分別為Ef1a、Act-1。表達穩(wěn)定性最差的基因分別為Gapdh、Axc4。而在寧夏枸杞中表達最穩(wěn)定的基因為Rh37，其次為H3b；Gapdh穩(wěn)定性最差（圖3-L）。

2.4.4?BestKeeper分析?采用BestKeeper軟件分析內(nèi)參基因CT的標準偏差（SD），且SD值越小，內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性越好，結(jié)果見表3。不同基因型枸杞不同發(fā)育時期和不同組織中，內(nèi)參基因Act-3、Gapdh-1、Acx4、Samc的SD值變動大（SD＞1），而內(nèi)參基因Act-1、Ef1a、H3b、Pp2a、Rh37、Tub的SD值均小于1，且Rh37、Ef1a的SD值較小，說明這2個基因的穩(wěn)定性較好。

2.4.5?RefFinder內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合排名分析?RefFinder分析結(jié)果如表4所示，對于不同基因型枸杞不同組織和非寧夏枸杞而言，Ef1a、Act-1的綜合排名為第一、第二。而在寧夏枸杞中，綜合排名第一的是Rh37，Ef1a次之，表明內(nèi)參基因Rh37、Ef1a對于寧夏枸杞而言是最合適的。在枸杞果實的不同發(fā)育階段，綜合排名第一的是Ef1a，Rh37次之。說明對于不同基因型枸杞，枸杞的不同組織及枸杞果實的不同發(fā)育時期，穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因并不相同。

2.5?內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

以Beat為目的基因，分別選取2個穩(wěn)定內(nèi)參基因Ef1a、Act-1，2個不穩(wěn)定的基因Acx4、Gapdh，進行熒光定量試驗。以Ef1a、Act-1作為內(nèi)參時，Beat基因在不同基因型枸杞不同組織中的表達量如圖4-A、B所示。Beat在枸杞的花和葉中表達量較高，在果實中的表達量最低，且在寧夏枸杞中的表達量顯著高于在非寧夏枸杞中的表達量，非寧夏枸杞樣品內(nèi)部之間也存在顯著差異（P<0.05）。以Acx4作為內(nèi)參時（圖4-C），寧夏枸杞和非寧夏枸杞之間仍然具有顯著性差異（P<0.05），但是非寧夏枸杞內(nèi)部中國、昌吉、黑果之間的差異未到達顯著水平。以Gapdh作為內(nèi)參時（圖4-D），寧夏枸杞花中表達量最高，但是非寧夏枸杞組織中的表達變化趨勢變化不一，且發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞和非寧夏枸杞之間沒達到顯著差異。

以Ef1a、Act-1作為內(nèi)參時，計算Beat基因在不同基因型枸杞不同發(fā)育階段的表達量。Beat基因在不同發(fā)育階段表達變化模式較為相似（圖5-A、圖5-B）， 在FS1中表達呈最高，F(xiàn)S2表達量相對較低，F(xiàn)S3～FS5之間表達量沒有明顯差異且表達量最低，不同基因型枸杞間在相同發(fā)育階段內(nèi)存在明顯差異。當以Acx4作為內(nèi)參時（圖5-C），不同發(fā)育階段表達變化模式不同于穩(wěn)定性較高的Ef1a、Act-1 作為內(nèi)參的表達量，材料間差異性明顯降低。當以Gapdh作為內(nèi)參時（圖5-D），不同發(fā)育階段的差異顯著水平同樣也降低，且在FS3～FS5階段，寧夏枸杞的表達量明顯低于非寧夏枸杞的表達量。可見，以穩(wěn)定性較高的基因作內(nèi)參基因，目的基因變化趨勢基本一致或偏差較?。环粗?，以穩(wěn)定性較低的基因作內(nèi)參基因，會造成目的基因表達水平存在較大差異或偏差。進一步驗證了篩選出的Ef1a、Act-1基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

3?結(jié)果與討論

隨著RT-qPCR技術(shù)的廣泛應用，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性已成為定量試驗結(jié)果準確性的關(guān)鍵影響因子［31，37］，選擇合適的內(nèi)參基因來減少RT-qPCR試驗中誤差造成的影響是非常有必要的。內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價常用的軟件有g(shù)eNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder綜合分析等［38-39］，能夠快速系統(tǒng)地分析評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

本研究對比分析了Act、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub等9個常用的內(nèi)參基因在不同基因型枸杞不同發(fā)育階段、不同組織中的表達水平。其中Act基因使用了2種不同的熒光定量引物。事實上，筆者所在課題組參考已發(fā)表枸杞內(nèi)參基因文獻［16-18］設計了所有的可用內(nèi)參基因引物作為候選，但并非所有內(nèi)參基因在不同基因型枸杞的不同組織部位中均能獲得比較好的擴增條帶，最終只選取了本研究所述的10對引物進行候選基因的擴增。另外，使用Wang等設計的HSP80引物［17］擴增后，擴增序列比對結(jié)果為Acx4，因此筆者所在課題組對其引物及PCR產(chǎn)物進行了重新命名。

本研究以9個不同基因型的枸杞果實不同發(fā)育階段和不同組織為材料，選用9個候選內(nèi)參基因，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder 軟件分析這9個基因在不同發(fā)育時期和不同組織中的表達穩(wěn)定性。利用上述4種軟件篩選出枸杞植物中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因Ef1a、Act-1，不穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因Gapdh、Acx4。肌動蛋白Actin是高度保守的蛋白質(zhì)，參與各種類型的細胞運動，并在所有真核細胞中廣泛表達，在細胞形態(tài)建成、生長發(fā)育中起著重要作用［40］。Actin基因在綠豆的不同品種和部位中是最合適的內(nèi)參基因之一［32］，在顯齒蛇葡萄的不同組織中表達穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因也是Actin［41］，這與本研究的結(jié)果一致。Ef1a在蛋白質(zhì)生物合成過程中促進氨基酰基tRNA與核糖體A位點的GTP依賴性結(jié)合。Gapdh參與光合還原戊糖磷酸途徑（Calvin-Benson循環(huán)），催化NADPH還原 1，3-二磷酸甘油酯［33］。Ef1a基因在花椰菜的不同組織處理下表達最為穩(wěn)定，Ef1a基因在甜瓜不同組織器官及不同脅迫條件下均可穩(wěn)定表達，也是較為合適的內(nèi)參基因［42］，這也與本試驗的結(jié)果一致。齊香玉等以茉莉花的5種組織和4個發(fā)育階段的花為試驗材料，選擇較常見的8個候選內(nèi)參基因進行引物特異性分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育期花的最適內(nèi)參基因為Actin、Ef1α［43］，這與本研究結(jié)果相同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)針對所有樣本最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Ef1a、Act-1；但是單獨對寧夏枸杞內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行分析時，得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因為Rh37，其次為Ef1a。這就說明對于不同基因型枸杞，內(nèi)參基因表達也有一定的差異。

雖然利用基因穩(wěn)定性分析軟件篩選獲得了穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，但不能確保所篩選出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，還需利用目的基因?qū)?nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行驗證，才能得出可靠的試驗結(jié)果。因此，通過Beat目的基因進一步驗證了基因的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果還表明，內(nèi)參基因的選擇會影響試驗結(jié)論。選擇不適合的內(nèi)參基因可能會導致錯誤的結(jié)果，最終導致錯誤的目的基因表達模式。當選取穩(wěn)定或不穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行試驗時，Beat基因在各種組織中表現(xiàn)出不一致的表達模式。綜上所述，本研究擬為不同基因型枸杞中基因表達的定量分析提供穩(wěn)定的內(nèi)參基因，擬為不同基因型枸杞功能基因組學的研究提供強有力的技術(shù)支撐。

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